本發(fā)明涉及家禽選育技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種茶花雞的選育方法。

背景技術(shù)：

茶花雞(英文名：chahuachickens)俗稱原雞、紅原雞、野雞、燭夜。聞名于中國(guó)西南地區(qū)，產(chǎn)于西雙版納周邊地區(qū)的深山老林，由野生紅色原雞經(jīng)長(zhǎng)期馴化選育而成，是中國(guó)不可多得的原始雞種。因其啼聲似“茶花兩朵”，故名茶花雞，它具有適應(yīng)性強(qiáng)、飼養(yǎng)粗放、采食量少及成活率高等特點(diǎn)，是中國(guó)特有的珍禽品種。隨著人們保護(hù)意識(shí)的加強(qiáng)，茶花雞和其他野生動(dòng)物一樣，在西雙版納自然保護(hù)區(qū)內(nèi)得到了保護(hù)。今后應(yīng)加強(qiáng)對(duì)茶花雞的生物學(xué)特性和經(jīng)濟(jì)性能的進(jìn)一步研究，確定其利用前途。當(dāng)前，應(yīng)劃定茶花雞的保種選育區(qū)，進(jìn)行必要的選育工作，培育我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)小型雞種，以滿足當(dāng)?shù)厝嗣癜l(fā)展養(yǎng)雞業(yè)的需要。

隨著對(duì)外交流的日益頻繁，家禽及其產(chǎn)品交易不斷增加，生長(zhǎng)慢、個(gè)體小、產(chǎn)蛋少的茶花雞逐漸被生產(chǎn)性能高的外引優(yōu)良品種所取代，數(shù)量逐年減少。同時(shí)，群體雜亂態(tài)勢(shì)加劇，遺傳關(guān)系混亂，品種的優(yōu)良特性隨之日趨退化。如果不及時(shí)保種、選育和改良，最終必將喪失茶花雞遺傳基因的優(yōu)勢(shì)。

目前，對(duì)于茶花雞的保種選育，均采用外形選擇的手段。茶花雞的主要特性：體型矮小，羽毛緊湊，體軀勻稱，近似船形，性情活潑，機(jī)靈，好斗，能飛善跑。頭小而清秀，多為平頭，少數(shù)鳳頭。多為單冠，少數(shù)豆冠。喙黑色，少數(shù)黑中帶黃色。虹彩黃色居多，也有褐色和灰色。耳垂、肉垂紅色。皮膚白色者多，少數(shù)淺黃色。脛、腳黑色，少數(shù)黑中帶黃色。公雞羽毛除翼羽、主尾羽、鐮羽為黑色或黑色鑲邊外，其余全身紅色，頸羽、鞍羽具有鮮艷光澤，尾羽發(fā)達(dá)。母雞除翼羽、尾羽多數(shù)是黑色外，全身是麻褐色。但通過外形選擇的方法其選育周期較長(zhǎng)。因此，急需一種選育周期短的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了多克隆抗體及其制備方法和茶花雞的選育方法。該選育方法不再局限于外形選擇，可縮短選育周期。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種多克隆抗體，將包括氨基酸序列如seqidno：15所示多肽的蛋白作為抗原，經(jīng)免疫反應(yīng)制備獲得。

作為優(yōu)選，包括氨基酸序列如seqidno：15所示多肽的蛋白還包括蛋白載體。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，蛋白載體為真核生物表達(dá)載體pegfp-n1載體。

本發(fā)明還提供了該多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

將氨基酸序列如seqidno：15所示多肽與蛋白載體偶聯(lián)，得到抗原；

采用抗原免疫動(dòng)物，所得抗血清經(jīng)純化，得到多克隆抗體。

作為優(yōu)選，采用抗原免疫動(dòng)物的方法包括初次免疫和加強(qiáng)免疫。

作為優(yōu)選，加強(qiáng)免疫的次數(shù)為3～4次。

本發(fā)明還提供了一種茶花雞的選育方法，包括如下步驟：

提取雞腦組織紋狀體的總蛋白，經(jīng)電泳得到分離的蛋白質(zhì)樣品；

將分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移至固相載體；

采用蛋白質(zhì)印跡法將本發(fā)明制備的多克隆抗體與固相載體上的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物。

在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物的方法為底物顯色或放射自顯影。

在本發(fā)明中，抗原抗體復(fù)合物的檢測(cè)位置為70kd。

在本發(fā)明中，檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物之后包括：在70kd處檢測(cè)到抗原抗體復(fù)合物，則雞為茶花雞。

本發(fā)明提供了多克隆抗體及其制備方法和茶花雞的選育方法。該多克隆抗體的制備方法為：將包括氨基酸序列如seqidno：15所示多肽的蛋白作為抗原，經(jīng)免疫反應(yīng)制備獲得。該茶花雞的選育方法包括：提取雞腦組織紋狀體的總蛋白，經(jīng)電泳得到分離的蛋白質(zhì)樣品；將分離的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移至固相載體；采用蛋白質(zhì)印跡法將本發(fā)明制備的多克隆抗體與固相載體上的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫反應(yīng)，檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物。

本發(fā)明具有的有益效果為：

1、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備的抗體可識(shí)別免疫原，效價(jià)大于1:20000；

2、本發(fā)明提供的茶花雞的選育方法可準(zhǔn)確選出茶花雞；

3、本發(fā)明選育方法不再局限于外形選擇，可進(jìn)行早期選育，縮短了選育周期。

附圖說明

圖1示seqidno：14序列與seqidno：13序列的比對(duì)結(jié)果；標(biāo)示下劃線的序列為seqidno：14序列，另外一條序列為seqidno：13序列；

圖2示茶花雞與不同性別白洛克雞的抗體westernblotting檢測(cè)圖；a為foxp2特異抗體不同白洛克公(wf)、母(wm)及去勢(shì)雞(wc)及茶花雞(ggs)的檢測(cè)圖，b為持家基因gpdh抗體與對(duì)應(yīng)樣品的檢測(cè)圖；

圖3示茶花雞與不同雞品種的第二抗體的westernblotting檢測(cè)圖；a為foxp2特異抗體不同雞品種包括藏雞(t)、白洛克公(wf)白萊航公(wl)及茶花雞(ggs)的檢測(cè)圖，b為持家基因gpdh抗體與對(duì)應(yīng)樣品的檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了多克隆抗體及其制備方法和茶花雞的選育方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供的多克隆抗體及其制備方法和茶花雞的選育方法中所用生物材料及試劑等均可由市場(chǎng)購(gòu)得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1達(dá)蘭雞foxp2保守序列分析

⑴foxp2基因編碼區(qū)部分cdna的擴(kuò)增

將從初生達(dá)蘭雞大腦提取出的rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，此后，用在foxp2保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物，以cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列如seqidno：1-4所示。

表1引物序列

⑵race過程

參考generacer試劑盒說明，主要原理是：先將總rna或mrna的5'端經(jīng)過去磷酸化、去帽子、連接試劑盒提供的rnaoligo，然后再用試劑盒提供的含poly(t)18的接頭引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

⑶利用根據(jù)已得到的基因部分編碼區(qū)的cdna序列設(shè)計(jì)的基因特異性引物和試劑盒提供的接頭通用引物，經(jīng)過pcr擴(kuò)增race產(chǎn)物，此后再進(jìn)行巢式pcr。race引物序列如下表所示：

表2race引物序列

⑷pcr產(chǎn)物的克隆測(cè)序

以上得到的pcr產(chǎn)物，按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明，進(jìn)行pcr產(chǎn)物回收；將回收得到的pcr產(chǎn)物與pmd19t-vector連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，搖菌，此后菌液送北京奧科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，克隆測(cè)序引物分別為m13f和m13r。

⑸測(cè)序結(jié)果分析

測(cè)序結(jié)果用chromas、dnaman進(jìn)行分析。并根據(jù)測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行序列拼接，得到完整的基因序列。該達(dá)蘭雞foxp2保守序列如seqidno：13所示。

實(shí)施例2茶花雞foxp2保守序列分析

參照實(shí)施例1試驗(yàn)方法，得到茶花雞foxp2保守序列，如seqidno：14所示。經(jīng)檢測(cè)，該序列與seqidno：13所示相比多51bp堿基比對(duì)結(jié)果見圖1。

實(shí)施例3多克隆抗體的制備

根據(jù)實(shí)施例2race結(jié)果，對(duì)foxp2蛋白表位預(yù)測(cè)后，設(shè)計(jì)僅能識(shí)別多51bp的蛋白抗體(seqidno：14所示序列對(duì)應(yīng)蛋白的抗體)，對(duì)foxp2蛋白表位預(yù)測(cè)后，選中開放讀碼框的第135-145位氨基酸序列clqefykkqqeq(注：末端加c是為了載體偶聯(lián))，其序列如seqidno：15所示，合成肽段，制備多克隆抗體。具體步驟如下：

1)多肽合成：人工合成多肽(10-14mg，純度85％以上)；

2)載體偶聯(lián)：將合成多肽偶聯(lián)蛋白載體pegfp-n1載體；

3)動(dòng)物免疫，抗血清制備：免疫2只新西蘭大白兔(初次免疫加上3-4次加強(qiáng)免疫)；預(yù)采血；第0天:初次免疫(完全福氏佐劑+抗原，600～800ug/只)；第21天:第一次加強(qiáng)免疫(不完全福氏佐劑+抗原，400～500ug/只)；第35天:第二次加強(qiáng)免疫(不完全福氏佐劑+抗原，400～500ug/只)；第42天:血清檢測(cè)；若效價(jià)達(dá)到要求，第49天采全血，分離抗血清；如達(dá)不到要求，第49天:第三加強(qiáng)免疫(不完全福氏佐劑+抗原，200ug/只)；第56天:血清檢測(cè)；若效價(jià)達(dá)到要求，第63天采全血，分離抗血清；

4)抗體親和純化(每抗體純化一只兔子30ml抗血清)，所制備的多抗可以識(shí)別免疫原，elisa檢測(cè)效價(jià)大于1：20000；抗原親和純化；抗體純度和濃度檢測(cè)；elisa檢測(cè)；抗體定量。

實(shí)施例4foxp2蛋白在茶花雞中特異表達(dá)抗體westernblotting檢測(cè)

對(duì)樣品的陽(yáng)性檢測(cè)可用gapdh持家基因抗體進(jìn)行檢測(cè)說明，目的條帶大小選用的蛋白marker來指示目的條帶，由先前的race結(jié)果已經(jīng)獲得orf，可推測(cè)蛋白的實(shí)際大小大概為70kda(707aa*105da/aa)來判斷是否為目的條帶。

利用實(shí)施例3制得的抗體對(duì)白洛克公雞、白洛克母雞、去勢(shì)白洛克及茶花雞公雞進(jìn)行westernblotting檢測(cè)，結(jié)果表明只在茶花雞的腦組織紋狀體中，發(fā)現(xiàn)特異性雜交條帶，表明在白洛克公雞、白洛克母雞、去勢(shì)白洛克紋狀體中，沒有檢測(cè)到目的蛋白，即51bp插入的可變剪切(seqidno：14所示序列)在該品種的紋狀體中沒有翻譯，而只有在茶花雞中特異的表達(dá)，如圖2所示。

利用實(shí)施例3制得的抗體對(duì)藏雞公雞、白洛克公雞、白萊航公雞及茶花雞公雞進(jìn)行westernblotting檢測(cè)，結(jié)果表明只在茶花雞的腦組織紋狀體中，發(fā)現(xiàn)特異性雜交條帶，表明在藏雞公雞、白洛克公雞、白萊航公雞紋狀體中，沒有檢測(cè)到目的蛋白，即51bp插入的可變剪切(seqidno：14所示序列)在該品種的紋狀體中，沒有翻譯，而只有在茶花雞中特異的表達(dá)，如圖3所示。

采用上述方法，其它品種的雞如壽光雞、浦東雞(又稱九斤黃)、北京油雞、大骨雞(又名莊河雞)、狼山雞、海蘭蛋雞、矮小雞、星布羅肉雞、白洛克等均沒有檢測(cè)到目的蛋白。

由以上試驗(yàn)結(jié)果可以說明，如seqidno：14所示序列轉(zhuǎn)錄后形成的蛋白，只有在茶花雞中表達(dá)，是茶花雞具有的特性。說明是造成茶花雞叫聲特異的原因。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>一種茶花雞的選育方法

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