本發(fā)明涉及質(zhì)譜法，并且更確切地說涉及用于通過從蛋白質(zhì)、多肽和其它生物相關(guān)多電荷物質(zhì)產(chǎn)生的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物離子的質(zhì)譜法來純化和分析蛋白質(zhì)或多肽的復(fù)雜混合物的方法以及將這些方法應(yīng)用于獲得用于生物物質(zhì)的識別和定量所必需的基于序列的信息。

背景技術(shù)：

在最近二十年，質(zhì)譜法已經(jīng)在分析從多種不同樣本類型導(dǎo)出的蛋白質(zhì)樣本方面取得了極大進(jìn)展。結(jié)合電噴射電離和各種分離技術(shù)，可識別和定量單一樣本中的數(shù)千蛋白質(zhì)。當(dāng)今實驗室中使用的最常見的方法涉及某一形式的蛋白質(zhì)提取，繼之以所關(guān)注的蛋白質(zhì)樣本的蛋白水解分解。類似于胰蛋白酶的蛋白水解酶的使用產(chǎn)生可容易地由多種不同儀器配置分析的肽。被稱為“從下到上”蛋白質(zhì)組研究的此方法可用于研究活細(xì)胞依據(jù)其環(huán)境的狀態(tài)。“從下到上”方法的主要優(yōu)點之一是所產(chǎn)生的肽具有極其類似的生理化學(xué)性質(zhì)，這有助于復(fù)雜樣本中數(shù)千肽的直截了當(dāng)?shù)姆蛛x。結(jié)合串連質(zhì)譜法的任何分離方法可隨后用于產(chǎn)生用以識別給定樣本中的蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息。盡管此技術(shù)是許多實驗室中的例程，但當(dāng)將完整蛋白質(zhì)還原到其組成肽時存在關(guān)于可獲得的信息的量的限制。

與“從下到上”蛋白質(zhì)組研究相比，“從上到下”蛋白質(zhì)組研究指代其中將蛋白質(zhì)樣本完整地引入到質(zhì)譜儀而無需酶、化學(xué)品或其它分解方式的分析方法。從上到下的分析實現(xiàn)完整蛋白質(zhì)的研究，從而允許直接在蛋白質(zhì)層級的識別、主要結(jié)構(gòu)確定以及轉(zhuǎn)譯后修飾(ptm)的局部化。從上到下的蛋白質(zhì)組分析通常包括將完整蛋白質(zhì)引入到質(zhì)譜儀的電離源中，使蛋白質(zhì)離子斷裂，且測量如此產(chǎn)生的各種片段的質(zhì)荷比和豐度。所得分段比肽分段復(fù)雜得多，這在無本文教示的方法存在下可能必須要使用具有極高質(zhì)量準(zhǔn)確性和分辨率能力的質(zhì)譜儀以便以可接受的確定性解譯分段圖案。所述解譯一般包含將觀測的分段圖案與包含從已知樣本產(chǎn)生的經(jīng)編譯實驗分段結(jié)果的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，或替代地與理論上預(yù)測分段圖案進(jìn)行比較。舉例來說，liu等人(《經(jīng)由四極/飛行時間串連質(zhì)譜儀中的離子阱碰撞引起的解離和離子/離子反應(yīng)對先驗未知蛋白質(zhì)的從上到下的蛋白質(zhì)識別/表征(top-downproteinidentification/characterizationofaprioriunknownproteinsviaiontrapcollision-induceddissociationandion/ionreactionsinaquadrupole/time-of-flighttandemmassspectrometer)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2009，81，1433-1441)已經(jīng)描述對具有多達(dá)≈28kda的質(zhì)量的經(jīng)改質(zhì)和未改質(zhì)的未知蛋白質(zhì)的從上到下的蛋白質(zhì)識別和表征。

從上到下的分析優(yōu)于從下到上的分析的優(yōu)點在于可直接識別蛋白質(zhì)，而不是如從下到上的分析中肽的情況那樣進(jìn)行推斷。另一優(yōu)點在于可以識別蛋白質(zhì)的替代形式，例如轉(zhuǎn)譯后修飾和拼接變體。然而，從上到下的分析當(dāng)與從下到上的分析相比時具有的缺點在于許多蛋白質(zhì)會難以隔離和純化。因此，不完全分離混合物中的每一蛋白質(zhì)可在質(zhì)譜分析后即刻產(chǎn)生多個離子物質(zhì)，每一物質(zhì)對應(yīng)于不同相應(yīng)質(zhì)子化程度和不同相應(yīng)電荷態(tài)，且每一此類離子物質(zhì)可帶來多個同位素變體。

依據(jù)質(zhì)譜法(ms)的細(xì)胞裂解物中完整蛋白質(zhì)的分析過程與若干困難相關(guān)聯(lián)。首先，來自細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)混合物的電噴射電離(esi)可歸因于多個蛋白質(zhì)的存在而產(chǎn)生極其復(fù)雜的質(zhì)譜，每一蛋白質(zhì)包括其自身的電荷態(tài)包絡(luò)，其中每一電荷態(tài)包絡(luò)為對應(yīng)于多個電荷態(tài)的質(zhì)譜線的集合，且其中每一電荷態(tài)與加合到其它無電荷分子的帶正電質(zhì)子的數(shù)目直接相關(guān)。因此，多個電荷態(tài)包絡(luò)可在任何給定質(zhì)荷比(m/z)范圍內(nèi)重疊。在此實例中，具有不同分子量和電荷的多個蛋白質(zhì)在相同m/z值處重疊。ms中的常用技術(shù)常常由于離子化組分的ms線的固有峰值重疊以及固有寬量值范圍而不足以簡化這些譜，其中此些組分可從不關(guān)注的小分子到對于相關(guān)蛋白質(zhì)自身的干擾生物分子變動。此些復(fù)雜譜內(nèi)的蛋白質(zhì)的指定電荷態(tài)的隔離通常并不能緩解多個蛋白質(zhì)峰值重疊的負(fù)擔(dān)，因為特定蛋白質(zhì)電荷態(tài)的離子的隔離將通常產(chǎn)生一或多個額外離子的共隔離。此共隔離使得不僅基于所產(chǎn)生的片段解離蛋白質(zhì)以試圖識別所述蛋白質(zhì)而且準(zhǔn)確地確定所述蛋白質(zhì)的完整質(zhì)量和序列覆蓋度，都成為一項挑戰(zhàn)。

可實施在將樣本引入到質(zhì)譜儀中之前執(zhí)行的例如液相層析(lc)或離子遷移譜(ims)等所謂的“前端”分離技術(shù)以減小總體復(fù)雜性且提供額外主要益處：電離源處電離競爭的減少。不同于從下到上實驗中通常分析的蛋白水解肽的混合物，完整蛋白質(zhì)混合物含有大范圍分子量、等電點、疏水性和其它生理化學(xué)性質(zhì)，這些使得以綜合方式經(jīng)由任何單一分離技術(shù)分析這些混合物具有挑戰(zhàn)性。以上分離方法兩者與其自身的益處和缺陷相關(guān)聯(lián)。液相層析往往會需要每樣本顯著量的時間來分離個別蛋白質(zhì)，但通常仍具有兩個或更多個蛋白質(zhì)共溶離。增強的分離可比標(biāo)準(zhǔn)化方法到達(dá)更遠(yuǎn)的“技術(shù)”點，且增強的分離可取決于當(dāng)前技術(shù)發(fā)展水平下的用戶技能。后一技術(shù)ims可快速使特定蛋白質(zhì)和/或電荷態(tài)與其它分離，但ims譜至少部分與質(zhì)譜相關(guān)(即，“不正交”)。ims方法還遭受電離競爭，需要廣泛優(yōu)化且通常涉及觀察含有所有電荷態(tài)的完全質(zhì)譜的動態(tài)條件。

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)-已經(jīng)在用于復(fù)雜混合物的快速分離的生物應(yīng)用中廣泛使用的離子-離子反應(yīng)類型，解決了許多這些上文提及的問題。以實驗方式，通過致使來自樣本的多帶正電的蛋白質(zhì)離子與所引入的單電荷反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)以便減少多電荷蛋白質(zhì)離子的電荷來實現(xiàn)質(zhì)子轉(zhuǎn)移。當(dāng)陰離子大量超過蛋白質(zhì)陽離子群體而存在時，這些反應(yīng)以偽一級反應(yīng)動力學(xué)繼續(xù)。反應(yīng)的速率與蛋白質(zhì)離子(或其它多電荷陽離子)的電荷的平方乘以陰離子上的電荷成正比。相同關(guān)系也適用于相反極性的反應(yīng)。這產(chǎn)生一系列偽一級連續(xù)反應(yīng)曲線，如由起始的多電荷蛋白質(zhì)離子群體界定。盡管所述反應(yīng)極度發(fā)熱(超過100千卡/摩爾)，但質(zhì)子轉(zhuǎn)移是在存在1毫托背景氣體(即，氦氣)的情況下執(zhí)行的均勻電子過程，且因此并不對起始的多電荷蛋白質(zhì)離子群體分段。碰撞氣體用以在微秒時間尺度(10⁸碰撞每秒)上移除過量能量，因此防止所得產(chǎn)物離子群體的分段。

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(ptr)已經(jīng)成功地用以識別蛋白質(zhì)混合物中的個別蛋白質(zhì)。此混合物簡化過程已用于確定高質(zhì)量蛋白質(zhì)的電荷態(tài)和分子量。ptr也已經(jīng)用于簡化從多電荷前驅(qū)體蛋白質(zhì)離子的碰撞激活導(dǎo)出的產(chǎn)物離子譜。雖然ptr減少了從多電荷蛋白質(zhì)離子導(dǎo)出的總體信號，但這由所得ptr產(chǎn)物離子的信噪比的顯著增益更多地補償。ptr過程是100％高效的，其產(chǎn)生僅單一系列的反應(yīng)產(chǎn)物，且不產(chǎn)生需要特殊解譯和數(shù)據(jù)分析的副反應(yīng)產(chǎn)品。

盡管所述反應(yīng)極度發(fā)熱(超過100千卡/摩爾)，但質(zhì)子轉(zhuǎn)移是在存在1毫托背景氣體(即，氦氣)的情況下執(zhí)行的均勻電子過程，且因此并不對起始的多電荷蛋白質(zhì)離子群體分段。mcluckey等人，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1998，70：1198-1202；stephenson等人，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，1998，8：637-644；stephenson等人，《美國化學(xué)學(xué)會期刊(j.am.chem.soc.)》，1996，118：7390-7397；mcluckey等人，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1995，67：2493-2497；stephenson等人，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1996，68：4026-4032；stephenson等人，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，1998，9：585-596；stephenson等人，《質(zhì)譜學(xué)期刊(j.massspectrom.)》，1998，33：664-672；stephenson等人，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1998，70：3533-3544；以及scalf等人，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2000，72：52-60。一般離子/離子化學(xué)方法的各種方面已經(jīng)在mcluckey和stephenson的《質(zhì)譜學(xué)回顧(massspecreviews)》，1998，17，369-407以及在發(fā)明人mcluckey等人的名義下的第7,550,5718b2號美國專利中描述。用于執(zhí)行ptr且用于減少質(zhì)譜儀中的離子電荷態(tài)的設(shè)備已經(jīng)在以下各者中描述：在發(fā)明人chen等人的名義下的第2011/0114835a1號美國預(yù)授權(quán)公開案，在發(fā)明人brown等人的名義下的第2011/0189788a1號美國預(yù)授權(quán)公開案，在發(fā)明人brown等人的名義下的第8,5283,5626b2號美國專利，以及在發(fā)明人frey等人的名義下的第7,5518,5108b2號美國專利。ptr電荷縮減技術(shù)對生物的檢測和識別的適配已由mcluckey等人描述(《用于生物的檢測和識別的電噴射/離子阱質(zhì)譜法(electrospray/iontrapmassspectrometryforthedetectionandidentificationoforganisms)》，生物質(zhì)譜法的首次聯(lián)合服務(wù)研討會會刊，巴爾的摩，馬里蘭州，1997年7月28-30日，127-132)。

由ptr過程產(chǎn)生的產(chǎn)物離子可通過使用被稱為“離子停車”的技術(shù)積聚到一個或若干電荷態(tài)中。離子停車在反應(yīng)周期期間使用補充ac電壓在特定m/z值下將由任何給定蛋白質(zhì)分子的原始不同地質(zhì)子化離子形成的ptr產(chǎn)物離子固結(jié)為特定電荷態(tài)。此技術(shù)可用以將產(chǎn)物離子信號集中到單個或有限數(shù)目的電荷態(tài)中(且因此集中到單個或幾個相應(yīng)質(zhì)荷比[m/z]值中)以用于較高靈敏度檢測或者使用碰撞激活、etd或其它離子操縱技術(shù)的進(jìn)一步操縱。離子停車的各種方面已經(jīng)在發(fā)明人leblanc的名義下的第8,5440,5962b2號美國專利以及以下文獻(xiàn)中描述：mcluckey等人，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2002，74，336-346；reid等人，《美國化學(xué)學(xué)會期刊(j.am.chem.soc.)》，2002，124：7353-7362；he等人，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2002，74：4653-4661；xia等人，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，2005，16：71-81；chrisman等人，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2005，77：3411-3414；以及chrisman等人，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2006，78：310-316。

與依據(jù)(ms)的細(xì)胞裂解物中蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析相關(guān)聯(lián)的另一困難是，針對蛋白質(zhì)的每一電荷態(tài)的分段行為在解離事件之前通常未知。確切地說，包括一些電荷態(tài)的離子可解離阱，而包括其它電荷態(tài)的離子可不充分地解離。特定電荷態(tài)的離子的隔離和解離因此并不保證有效解離或解離為一組診斷片段。

與完整蛋白質(zhì)分析相關(guān)聯(lián)的第三挑戰(zhàn)是，針對通常超過50kda的高分子量蛋白質(zhì)產(chǎn)生的電荷態(tài)的廣泛分布。此處，起始信號可劃分成超過30+電荷態(tài)，從而使任何給定電荷態(tài)的串連質(zhì)譜法產(chǎn)生具有低信噪比的譜。產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)識別的足夠序列覆蓋度的能力可因此對于單一串連質(zhì)譜來說較困難。

多種離子激活(分段)技術(shù)可用于產(chǎn)生關(guān)于完整蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。被稱為碰撞誘導(dǎo)解離(cid)的最常使用的方法涉及多電荷前驅(qū)體離子的隔離群體與中性背景氣體的碰撞。最常，多電荷前驅(qū)體離子使用所界定離子群體的運動的基頻加速以便與中性背景氣體碰撞從而產(chǎn)生單分子解離事件。此過程導(dǎo)致沿著蛋白質(zhì)的氨基主鏈的分段，因此產(chǎn)生氨基酸序列信息?？梢员环Q為hcd或高能量碰撞誘導(dǎo)解離的較高碰撞能量過程獲得蛋白質(zhì)的較廣泛分段。很多時候，此涉及碰撞池內(nèi)部的多個分段事件，因此產(chǎn)生較廣泛序列覆蓋度。用于經(jīng)由離子激活產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列覆蓋度的另一方法是光致解離(pd)，其中經(jīng)界定波長的光子用于激發(fā)所關(guān)注的離子。所采用的兩個常見類型包含超紫(uv-pd)和紅外多光子解離(irmpd)。后者是高能量過程，其中離子中能量沉積的速率遠(yuǎn)超出解離過程的速率。此處，可沿著蛋白質(zhì)主鏈中的任一點產(chǎn)生分段，或也可產(chǎn)生氨基酸側(cè)鏈分段。對于irmpd，此是能量低得多的過程，其表征為存在氨基鍵處的裂解，以及來自照射期間產(chǎn)生的完整蛋白質(zhì)和片段離子的氨和水的損失。irmpd實驗的時間幀也可擴展以產(chǎn)生較廣泛分段。使用電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)劑離子的離子-離子反應(yīng)也可采用作為用于完整蛋白質(zhì)的分段方法。此處，從多電荷蛋白質(zhì)到單電荷陰離子的電子轉(zhuǎn)移事件產(chǎn)生蛋白質(zhì)的主鏈分段，任何翻譯后修飾仍完整。

結(jié)合在一起，用于串連質(zhì)譜法的這些離子激活方法產(chǎn)生可提供蛋白質(zhì)序列信息的許多不同互補形式的分段。理想地，這些方法可以寬帶方式應(yīng)用以便增加蛋白質(zhì)的序列覆蓋度且提供關(guān)于單一氨基酸突變的修改、拼接變型和表達(dá)式的額外信息。這些方法以寬帶格式(即，覆蓋相同完整蛋白質(zhì)的多個電荷態(tài))的應(yīng)用將提供蛋白質(zhì)表征和識別的較綜合視圖。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明教示質(zhì)譜方法，其采用質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(ptr)結(jié)合離子停車技術(shù)繼之以較高碰撞能量解離(hcd)以便產(chǎn)生寬m/z帶激活和分段。既定結(jié)果提供具有增強的譜信息的簡化譜分析。本發(fā)明教示組合使用ptr和hcd技術(shù)的定向、數(shù)據(jù)相依和數(shù)據(jù)獨立質(zhì)譜分析的方法。

本文中所揭示的方法并入有以協(xié)同方式來自ptr和hcd兩者的益處。在從天然樣本產(chǎn)生的復(fù)雜質(zhì)譜的分析期間，可選擇隔離窗口，且隔離窗口優(yōu)選地結(jié)合離子停車技術(shù)經(jīng)受ptr，使得前驅(qū)體離子電荷縮減到預(yù)設(shè)的m/z范圍?？纱嬖谟谒x擇的隔離窗口中的任何共隔離的低電荷態(tài)離子將很可能不下降到新電荷態(tài)m/z范圍中。此程序可從污染物或低電荷離子過濾蛋白質(zhì)，從而有效地純化所要蛋白質(zhì)離子。遵循ptr和離子停車，可實施第二ptr事件以從單一經(jīng)純化蛋白質(zhì)電荷態(tài)到多個較小(較低)電荷態(tài)再分布信號。自初始隔離提取的蛋白質(zhì)的新形成的電荷態(tài)包絡(luò)接著可經(jīng)受hcd。hcd碰撞能量可經(jīng)選擇使得較高電荷態(tài)被解離，同時較低電荷態(tài)維持完整(即，不分段)蛋白質(zhì)離子m/z值的至少一部分，使得分子態(tài)離子的完整質(zhì)量可容易識別，且使得過分分段(已經(jīng)形成的片段的進(jìn)一步分段)得以防止或顯著減小。

以實驗方式，可通過致使來自樣本的多正電荷蛋白質(zhì)離子(即，蛋白質(zhì)陽離子)與單電荷反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)以便減少個別蛋白質(zhì)陽離子的電荷態(tài)以及蛋白質(zhì)陽離子的此些電荷態(tài)的數(shù)目來執(zhí)行質(zhì)子轉(zhuǎn)移。當(dāng)反應(yīng)劑陰離子大量超過蛋白質(zhì)陽離子群體而存在時，這些反應(yīng)以偽一級反應(yīng)動力學(xué)繼續(xù)。反應(yīng)的速率與蛋白質(zhì)離子(或其它多電荷陽離子)的電荷的平方乘以反應(yīng)劑陰離子上的電荷成正比。因此，較高電荷蛋白質(zhì)與較低電荷態(tài)相比將以更快速率反應(yīng)。這些反應(yīng)的結(jié)果為各種多質(zhì)子蛋白質(zhì)的電荷態(tài)z的縮減，從而導(dǎo)致m/z比的增加。此過程可通過將蛋白質(zhì)離子的先前隔離的子群體的m/z范圍擴展到經(jīng)擴展m/z范圍而導(dǎo)致譜復(fù)雜性的減小。較低電荷小分子污染物的m/z比較慢地增加或完全不增加，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的譜簽名的分離和純化。

ptr過程是100％高效的，其產(chǎn)生僅單一系列的反應(yīng)產(chǎn)物，且不產(chǎn)生需要特殊解譯和數(shù)據(jù)分析的副反應(yīng)產(chǎn)品。盡管ptr反應(yīng)極度發(fā)熱(超過100千卡/摩爾)，但質(zhì)子轉(zhuǎn)移是在存在1毫托背景氣體(即，氦氣)的情況下執(zhí)行的均勻電子過程，且因此并不對起始的多電荷蛋白質(zhì)陽離子群體分段。碰撞氣體用以在微秒時間尺度(10⁸碰撞每秒)上移除過量能量，因此防止所得產(chǎn)物離子群體的分段。此技術(shù)可結(jié)合數(shù)據(jù)相依或數(shù)據(jù)獨立方法使用。

在根據(jù)本發(fā)明教示的復(fù)雜譜的質(zhì)譜分析期間，可通過使來自指定m/z窗口的離子經(jīng)歷電荷縮減反應(yīng)繼之以進(jìn)一步串連質(zhì)譜事件或質(zhì)量分析來實施ptr。此事件序列由于使用指定m/z窗口的定向方法而可被認(rèn)為是數(shù)據(jù)相依方法的一部分?；蛘撸赏ㄟ^將離子隔離在設(shè)定寬度的鄰近和連續(xù)m/z窗口內(nèi)，使如此隔離的離子經(jīng)歷ptr且對如此形成的ptr反應(yīng)產(chǎn)物執(zhí)行串連質(zhì)譜事件或質(zhì)量分析來實施數(shù)據(jù)獨立方法。

上文描述的相同關(guān)系對于相反極性ptr反應(yīng)同樣成立，相反極性ptr反應(yīng)在此處界定為單電荷反應(yīng)劑陽離子與從蛋白質(zhì)樣本導(dǎo)出的多電荷陰離子的群體之間的反應(yīng)。ptr對肽、多肽和蛋白質(zhì)的分析的應(yīng)用的各種方面已經(jīng)在以下文獻(xiàn)中描述：在發(fā)明人hunt等人的名義下的第7,749,769b2號美國專利、在發(fā)明人hartmer等人的名義下的第2012/0156707a1號美國專利預(yù)授權(quán)公開案、在發(fā)明人zabrouskov的名義下的第2012/0205531a1號美國預(yù)授權(quán)公開案；mcluckey等人的《離子/離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移動力學(xué)：用于從蛋白質(zhì)混合物的電噴射導(dǎo)出的離子的分析的暗示(ion/ionproton-transferkinetics：implicationsforanalysisofionsderivedfromelectrosprayofproteinmixtures)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1998，70，1198-1202；stephenson等人的《涉及非共價交互的生物離子的離子-離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)：全肌紅蛋白(ion-ionprotontransferreactionsofbio-ionsinvolvingnoncovalentinteractions：holomyoglobin)》，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，1998，8，637-644；stephenson等人的《氣相中的離子/離子反應(yīng)：涉及多電荷蛋白質(zhì)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(ion/ionreactionsinthegasphase：protontransferreactionsinvolvingmultiply-chargedproteins)》，《美國化學(xué)學(xué)會期刊(j.am.chem.soc.)》，1996，118，7390-7397；mcluckey等人的《用于電噴射質(zhì)譜法中改進(jìn)的有效質(zhì)量分辨率的離子/分子反應(yīng)(ion/moleculereactionsforimprovedeffectivemassresolutioninelectrospraymassspectrometry)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1995，67，2493-2497；stephenson等人的《用于蛋白質(zhì)混合物分析的離子/離子質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)(ion/ionprotontransferreactionsforproteinmixtureanalysis)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1996，68，4026-4032；stephenson等人的《用于寡肽混合物分析的離子/離子反應(yīng)：對由0.5-100kda組分構(gòu)成的混合物的應(yīng)用(ion/ionreactionsforoligopeptidemixtureanalysis：applicationtomixturescomprisedof0.5-100kdacomponents)》，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，1998，9，585-596；stephenson等人的《用于通過電噴射質(zhì)譜法的高質(zhì)量物質(zhì)和混合物組分的改進(jìn)質(zhì)量確定的電荷操縱(chargemanipulationforimprovedmassdeterminationofhigh-massspeciesandmixturecomponentsbyelectrospraymassspectrometry)》，《質(zhì)譜學(xué)期刊(j.massspectrom.)》，998，33，664-672；stephenson等人的《經(jīng)由離子/離子化學(xué)方法從多電荷母代離子導(dǎo)出的產(chǎn)物離子譜的簡化(simplificationofproductionspectraderivedfrommultiplychargedparentionsviaion/ionchemistry)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，1998，70，3533-3544，以及scalf等人的《電荷縮減電噴射質(zhì)譜法(chargereductionelectrospraymassspectrometry)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2000，72，52-60。一般離子/離子化學(xué)方法的各種方面已經(jīng)在mcluckey等人的《高質(zhì)量多電荷離子的離子/離子化學(xué)方法(ion/ionchemistryofhigh-massmultiplychargedions)》，《質(zhì)譜學(xué)回顧(massspectrom.rev.)》，1998，17，369-407以及在發(fā)明人mcluckey等人的名義下的第7,550,718b2號美國專利中描述。用于執(zhí)行ptr且用于減少質(zhì)譜儀中的離子電荷態(tài)的設(shè)備已經(jīng)在以下各者中描述：在發(fā)明人chen等人的名義下的第2011/0114835a1號美國預(yù)授權(quán)公開案，在發(fā)明人brown等人的名義下的第2011/0189788a1號美國預(yù)授權(quán)公開案，在發(fā)明人brown等人的名義下的第8,283,626b2號美國專利，以及在發(fā)明人frey等人的名義下的第7,518,108b2號美國專利。ptr電荷縮減技術(shù)對生物的檢測和識別的適配已由mcluckey等人描述(《用于生物的檢測和識別的電噴射/離子阱質(zhì)譜法(electrospray/iontrapmassspectrometryforthedetectionandidentificationoforganisms)》，生物質(zhì)譜法的首次聯(lián)合服務(wù)研討會會刊，巴爾的摩，馬里蘭州，1997年7月28-30日，127-132)。

質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)由于其熱力學(xué)有利程度而快速進(jìn)行。例如ptr等中和和電荷縮減反應(yīng)在能量上幾乎是完全有利的。因此，給定所述機會，ptr反應(yīng)過程完成將致使極度帶電前驅(qū)體離子經(jīng)由連續(xù)電荷縮減反應(yīng)繼續(xù)減少其電荷，直至其被中和(且借此從質(zhì)譜丟失)。此現(xiàn)象的不太極端的可能性是，單一初始電荷態(tài)的離子子群體將在ptr之后在若干較低電荷態(tài)上再分布，借此以略微不合需要的方式有效地衰減所述分子態(tài)離子的信號。

為減小或消除此譜衰減，可結(jié)合ptr反應(yīng)過程使用被稱為“離子停車”的補充技術(shù)來抑制或大大減小進(jìn)行中和反應(yīng)特定電荷態(tài)的反應(yīng)速率。離子停車使用施加到圍封離子阱設(shè)備的電極的補充或輔助振蕩(ac)電壓。輔助ac電壓通常具有相對低的振幅(約1伏)，且施加為針對維持離子在阱內(nèi)的包含的主射頻(rf)截留電壓波形的補充。如本文獻(xiàn)中參考離子停車期間施加的振蕩諧振激勵電壓所使用，術(shù)語“頻率”并不指代施加僅單一頻率振蕩，而是實際上指代共同具有帶寬的同時施加的頻率的頻帶(即，頻帶)的中央頻率。類似地，如本文參考離子停車所使用，“波形”指代同時施加各種頻帶寬度的此些頻帶中的兩者或兩者以上。注意上文的定義，選擇振蕩輔助電壓波形的頻率以便選擇性地匹配阱內(nèi)的特定質(zhì)荷比(m/z)的離子的運動頻率(其又由主捕獲場振幅和m/z比確定。輔助波形的施加因此選擇性地以諧振方式激發(fā)具有特定m/z比率的離子的運動。阱內(nèi)的運動以此方式諧振地激發(fā)的離子經(jīng)受減緩的反應(yīng)動力或通常被禁止進(jìn)行ptr反應(yīng)過程期間的進(jìn)一步電荷縮減。離子停車程序可因此在反應(yīng)周期期間在特定質(zhì)荷比(m/z)值下將由任何給定蛋白質(zhì)分子的原始不同地質(zhì)子化離子形成的ptr產(chǎn)物離子固結(jié)為特定電荷態(tài)。此技術(shù)可用以將產(chǎn)物離子信號集中(或“停放”)到單個或有限數(shù)目的電荷態(tài)中(且因此集中到單個或幾個相應(yīng)m/z值中)以用于較高靈敏度檢測或者使用碰撞激活、etd或其它離子操縱技術(shù)的進(jìn)一步操縱。離子停車的各種方面已經(jīng)在以下各者中描述：在發(fā)明人mcluckey的名義下的第7,064,317b2號美國專利；在發(fā)明人mcluckey的名義下的第7,355,169b2號美國專利；在發(fā)明人mcluckey的名義下的第8,334,503b2號美國專利；在發(fā)明人leblanc的名義下的第8,440,962b2號美國專利；且在以下文獻(xiàn)中描述：mcluckey等人的《在電動離子阱中的離子/離子反應(yīng)期間的離子停車(ionparkingduringion/ionreactionsinelectrodynamiciontraps)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2002，74，336-346；reid等人的《來自復(fù)雜混合物的完整蛋白質(zhì)的氣相濃度、純化和識別(gas-phaseconcentration，purification，andidentificationofwholeproteinsfromcomplexmixtures)》，《美國化學(xué)學(xué)會期刊(j.am.chem.soc.)》，2002，124，7353-7362；he等人的《在單個氣相純化和濃度程序之后多個蛋白質(zhì)離子電荷態(tài)的解離(dissociationofmultipleproteinionchargestatesfollowingasinglegas-phasepurificationandconcentrationprocedure)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2002，74，4653-4661；xia等人的《混合線性離子阱中的相互存儲模式離子/離子反應(yīng)(mutualstoragemodeion/ionreactionsinahybridlineariontrap)》，《美國質(zhì)譜學(xué)會期刊(j.am.soc.massspectrom.)》，2005，16，71-81；chrisman等人的《并行離子停車：改善電子轉(zhuǎn)移解離中的母代到第一代產(chǎn)物的轉(zhuǎn)換(parallelionparking：improvingconversionofparentstofirst-generationproductsinelectrontransferdissociation)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2005，77(10)，3411-3414，以及chrisman等人的《蛋白質(zhì)混合物的并行離子停車(parallelionparkingofproteinmixtures)》，《分析化學(xué)(anal.chem.)》，2006，78，310-316。

所述文獻(xiàn)中還論述的被稱為“并行離子停車”的技術(shù)是離子停車的擴展。離子停車與并行離子停車之間的差異是，在后者中，寬m/z范圍(相對于僅涵蓋所關(guān)注蛋白質(zhì)的一個電荷態(tài)的狹窄界定的范圍)內(nèi)的離子經(jīng)受諧振激發(fā)。因此，ptr反應(yīng)產(chǎn)物的m/z比停放在對應(yīng)于所述寬范圍內(nèi)的一個以上電荷態(tài)的多個值處。盡管文獻(xiàn)中存在并行停車的多種所描述的實施方案，所述技術(shù)始終涉及期望停放的離子的諧振激發(fā)(線性離子阱中徑向，四極離子阱中軸向)。有可能創(chuàng)建諧振激發(fā)波形，其通過定制唯一波形繼之以傅里葉逆變換技術(shù)或通過簡單地同時疊加多個單一頻率波形而允許預(yù)定m/z范圍內(nèi)ptr反應(yīng)產(chǎn)物離子的停放。在每一情況下，凈結(jié)果為使前驅(qū)體離子經(jīng)受ptr以便致使大多數(shù)離子再分布在三到五個電荷態(tài)上。

根據(jù)依據(jù)本發(fā)明教示的各種方法，從ptr反應(yīng)(如上文所描述)產(chǎn)生的離子可經(jīng)受由較高能量解離(hcd)技術(shù)進(jìn)行的分段。hcd技術(shù)是診斷上強大的程序，其用于有力地激發(fā)或激活(分段的預(yù)備)給定m/z范圍內(nèi)的所有離子，通常被稱作寬帶激活。在此方法中，離子可不僅到達(dá)用于鍵斷裂的最小閾值，而且具有施加到其的額外能量以到達(dá)較高能量解離閾值。此通常在存在電位差的情況下經(jīng)由離子的軸向加速度實施。施加在每一離子上的力為所述離子的電荷z與軸向離子路徑中兩個透鏡元件之間的電位差的乘積。因為此關(guān)系，當(dāng)涵蓋相同分子態(tài)離子的電荷態(tài)分布的離子經(jīng)受hcd時，包括較高z的那些離子將比具有較低z的那些離子經(jīng)受更大的力，使得較高z離子可潛在地經(jīng)由較高能量路徑解離。相反，較低z離子可保持部分完整，從而提供用于離子的分子量的直接信息。

已發(fā)現(xiàn)，在類似激活條件下，具有不同電荷態(tài)的蛋白質(zhì)可彼此不同地解離。因此，用于解離的單一電荷態(tài)的常規(guī)選擇歸因于未知分段效率而承載較差解離的固有風(fēng)險。相比之下，根據(jù)本發(fā)明教示的方法有利地組合ptr和hcd程序使得從單一蛋白質(zhì)分子導(dǎo)出且包括狀態(tài)包絡(luò)的離子被分段。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，組合ptr和hcd程序的使用能夠提供廣泛序列信息，借此最小化從單一電荷態(tài)的較差解離的風(fēng)險，同時還潛在地維持關(guān)于蛋白質(zhì)的完整質(zhì)量的信息，借此增強正確地識別所述蛋白質(zhì)的概率。本文教示的新穎ms分析方法的益處是，所要蛋白質(zhì)經(jīng)由ptr有效地純化且隨后以一方式解離使得所獲得的信息內(nèi)容比原本將從蛋白質(zhì)的單一電荷態(tài)的解離搜集的信息廣泛。最后，可在準(zhǔn)確質(zhì)量分析器(例如orbitrap^tm質(zhì)量分析器)中的質(zhì)量分析之后產(chǎn)生高分辨率、高質(zhì)量準(zhǔn)確性質(zhì)譜。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，組合ptr和hcd程序的使用能夠提供廣泛序列信息，借此最小化從單一電荷態(tài)的較差解離的風(fēng)險，同時還潛在地維持關(guān)于蛋白質(zhì)的完整質(zhì)量的信息，借此增強正確地識別所述蛋白質(zhì)的概率。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)出人意料的結(jié)果，所述結(jié)果與上文提到的各種有利因素結(jié)合在一起可實現(xiàn)從自然微生物樣本導(dǎo)出的極復(fù)雜混合物中準(zhǔn)確識別多個完整蛋白質(zhì)或大的肽。此識別可在物質(zhì)、亞種或甚至菌株層級上實現(xiàn)微生物識別。目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽離子單物質(zhì)或多物質(zhì)可經(jīng)選擇以便基于先驗知識或信息個別地或組合地指示特定微生物或細(xì)胞類型或者微生物或細(xì)胞類型的特定菌株或變體或者給定毒性因數(shù)或毒素在樣本中的存在，或者指示微生物或細(xì)胞抵抗抗菌劑化合物或抗生素藥品的能力。

本發(fā)明在一個方面中提供對傳統(tǒng)的從下到上蛋白質(zhì)組研究方法的替代，即經(jīng)由方法對從微生物細(xì)胞導(dǎo)出的完整蛋白質(zhì)的從上到下分析，所述方法適用于大體上所有微生物，包含革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、分枝桿菌、霉?jié){菌、酵母、原生動物、絲狀(即，微觀)真菌。本發(fā)明可幫助提供復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)識別，這又可幫助甚至在含有微生物的混合物和/或直接來自純的和/或混合培養(yǎng)基及來自直接樣本(例如，表面棉簽、體液等)分析的微生物的樣本中在種屬、物質(zhì)、亞種、菌株致病變型和血清變型層級對微生物的識別。另外，本文教示的方法可用于毒性因數(shù)、抗生素抗性和易感性標(biāo)記或其它特性的目標(biāo)檢測。本發(fā)明教示的從上到下方法是簡單且快速的，因為不需要樣本的化學(xué)或酶分解且實時地實現(xiàn)數(shù)據(jù)處理。

根據(jù)本發(fā)明教示的方法可包括以下步驟中的至少一或多個：微生物細(xì)胞中斷，蛋白質(zhì)的溶解，樣本凈化(脫鹽、移除不可溶組分和殘渣，和/或聚集)，樣本灌注或流動注入，快速部分液體層析分離，標(biāo)準(zhǔn)層析分離，等電點聚焦，溶液中蛋白質(zhì)的電離，離子的給定m/z范圍的隔離，致使離子的隔離范圍經(jīng)受ptr以便形成第一代ptr產(chǎn)物離子，第一代ptr產(chǎn)物離子的m/z范圍的任選隔離，ms或ms/ms模式中的任選質(zhì)譜法，任選地致使第一代ptr產(chǎn)物離子的隔離范圍經(jīng)受第二ptr反應(yīng)以便形成第二代ptr產(chǎn)物離子，ms或ms/ms模式中的質(zhì)譜法，以及經(jīng)由分子量和/或蛋白質(zhì)序列分析的蛋白質(zhì)識別，或使用任何統(tǒng)計分類方法。優(yōu)選但不一定地，以高分辨率、高準(zhǔn)確性質(zhì)譜儀執(zhí)行質(zhì)譜法步驟，例如包括orbitrap^tm質(zhì)量分析器的質(zhì)譜儀。

附圖說明

為進(jìn)一步闡明本發(fā)明的以上和其它優(yōu)點及特征，將參照附圖中說明的其特定實施例呈現(xiàn)本發(fā)明的更具體描述。應(yīng)了解，這些圖只是描繪了本發(fā)明的所說明的實施例，且因此不應(yīng)當(dāng)被看作限制了本發(fā)明的范圍。本發(fā)明將以額外特殊性和細(xì)節(jié)經(jīng)由使用隨附圖式進(jìn)行描述和闡述，附圖中：

圖1是示意性地說明用于來自至少一個微生物的可溶蛋白質(zhì)的快速提取和分析以用于識別所述至少一個微生物的系統(tǒng)的框圖；

圖2是適合于與根據(jù)本發(fā)明教示的方法結(jié)合采用的示范性質(zhì)譜儀的示意性表示，所述質(zhì)譜儀包括混合系統(tǒng)，所述混合系統(tǒng)包括四極濾質(zhì)器、雙壓力四極離子阱質(zhì)量分析器和靜電阱質(zhì)量分析器；

圖3a為根據(jù)本發(fā)明教示的第一示范性方法的示意性流程圖，所述第一方法針對確定目標(biāo)蛋白質(zhì)分析物的存在和/或濃度或不存在；

圖3b為根據(jù)本發(fā)明教示的第二示范性方法的示意性流程圖，所述第二方法針對樣本中一或多個蛋白質(zhì)的存在和/或濃度的數(shù)據(jù)相依確定；

圖3c為根據(jù)本發(fā)明教示的第三示范性方法的示意性流程圖，所述第三方法針對樣本中一或多個蛋白質(zhì)的存在和/或濃度的數(shù)據(jù)獨立確定；

圖3d為根據(jù)本發(fā)明教示的第四示范性方法的示意性流程圖，所述第四方法針對樣本中一或多個蛋白質(zhì)的存在和/或濃度的數(shù)據(jù)獨立確定；

圖4a為從含有充足的聚合污染物的泛素的溶液導(dǎo)出的離子的質(zhì)譜；

圖4b為在來自圖4a中所描繪的離子群體的m/z隔離之后包括電荷態(tài)+13的多質(zhì)子泛素分子的離子的質(zhì)譜；

圖4c為由圖4b中所描繪的隔離的群體的反應(yīng)利用ptr反應(yīng)劑離子持續(xù)50毫秒產(chǎn)生的包括具有電荷態(tài)+11或更小的多個多質(zhì)子泛素分子的離子的質(zhì)譜；

圖4d為通過較高能量碰撞解離技術(shù)使用正規(guī)化碰撞能量值20從圖4c中所描繪的離子群體產(chǎn)生的片段離子的質(zhì)譜；

圖5a為從含有碳酸酐酶與肌紅蛋白的混合物的溶液導(dǎo)出的離子的質(zhì)譜，其還展示樣本制備期間產(chǎn)生的血紅素單位的離子；

圖5b為在2th寬的隔離窗口(大約808m/z)內(nèi)圖5a中所描繪的離子群體的m/z隔離之后剩余的離子的質(zhì)譜，所述隔離窗口涵蓋具有電荷態(tài)+21的多質(zhì)子肌紅蛋白離子；

圖5c為利用ptr反應(yīng)劑離子持續(xù)30毫秒的圖5b中所描繪的隔離的離子群體的反應(yīng)產(chǎn)生的離子的說明性質(zhì)譜，其展現(xiàn)在無離子停車的情況下初始ptr階段中多個物質(zhì)的潛在信號增強(共隔離)的現(xiàn)象；

圖5d為在應(yīng)用離子停車期間利用ptr反應(yīng)劑離子持續(xù)30毫秒繼之以大致808th處的ptr產(chǎn)物離子的隔離的圖5b中所描繪的隔離的離子群體的反應(yīng)產(chǎn)生的具有電荷態(tài)+20的主要由經(jīng)純化多質(zhì)子肌紅蛋白分子組成的離子的質(zhì)譜，其展示肌紅蛋白質(zhì)譜簽名的有效濃度和隔離；

圖5e為如圖5d中所描繪的電荷態(tài)+20的經(jīng)純化多質(zhì)子肌紅蛋白分子的更進(jìn)一步反應(yīng)產(chǎn)生的離子的群體的質(zhì)譜，其利用ptr反應(yīng)劑持續(xù)2毫秒以便產(chǎn)生具有一范圍的電荷態(tài)的多質(zhì)子肌紅蛋白分子；

圖5f為通過較高能量碰撞解離技術(shù)從圖5e中所描繪的離子群體產(chǎn)生的片段離子的質(zhì)譜；

圖6a為從含有添加的肌紅蛋白的細(xì)菌大腸桿菌的裂解物產(chǎn)生的離子的質(zhì)譜；

圖6b為在2th寬的隔離窗口(大約808m/z)內(nèi)圖6a中所描繪的離子群體的m/z隔離之后剩余的離子的質(zhì)譜，所述隔離窗口涵蓋具有電荷態(tài)+21的多質(zhì)子肌紅蛋白離子；

圖6c為在不應(yīng)用離子停車的情況下利用ptr反應(yīng)劑離子持續(xù)30毫秒的圖6b中所描繪的隔離的離子群體的反應(yīng)產(chǎn)生的離子的說明性質(zhì)譜，其展現(xiàn)在無離子停車的情況下初始ptr階段中多個物質(zhì)的潛在信號增強(共隔離)的現(xiàn)象；

圖6d為在應(yīng)用離子停車期間利用ptr反應(yīng)劑離子持續(xù)30毫秒繼之以質(zhì)量隔離的圖6b中所描繪的隔離的離子群體的反應(yīng)產(chǎn)生的具有電荷態(tài)+20的主要由經(jīng)純化多質(zhì)子肌紅蛋白分子組成的離子的質(zhì)譜；

圖6e為如圖6d中所描繪通過進(jìn)一步反應(yīng)從電荷態(tài)+20肌紅蛋白離子產(chǎn)生的離子的質(zhì)譜，其在不應(yīng)用離子停車的情況下利用ptr反應(yīng)劑持續(xù)1毫秒以便產(chǎn)生具有一范圍的電荷態(tài)的多質(zhì)子肌紅蛋白分子；

圖6f為通過較高能量碰撞解離技術(shù)使用正規(guī)化碰撞能量值20從圖6e中所描繪的離子群體產(chǎn)生的片段離子的質(zhì)譜；以及

圖6g是為通過較高能量碰撞解離技術(shù)從圖6d中所描繪的離子群體產(chǎn)生的片段離子的質(zhì)譜。

圖7為質(zhì)譜線的兩個重疊集合的示意性表示，每一集合包括不同相應(yīng)分析物的電荷態(tài)分布。

具體實施方式

呈現(xiàn)以下描述以使所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠制作并使用本發(fā)明，并且在特定應(yīng)用和其要求的情況下提供以下描述。對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，對所描述的實施例的各種修改將易于顯而易見的，并且本文中的一般原理可以應(yīng)用到其它實施例。因此，本發(fā)明并不希望限于所示的實施例和實例，而是應(yīng)被賦予根據(jù)權(quán)利要求書的最廣可能的范圍。參照附圖1到11結(jié)合以下描述，本發(fā)明的具體特征和優(yōu)點將變得更加清楚。

現(xiàn)參看圖1，示意性地說明用于從一或多種微生物提取蛋白質(zhì)、檢測所述蛋白質(zhì)且識別所述一或多種微生物的系統(tǒng)100。系統(tǒng)100包含樣本處置裝置115、可由樣本處置裝置115接達(dá)的樣本110，以及反應(yīng)劑、緩沖劑及類似物的源120，這些源通過各種管道或其它傳輸線流體地耦合到樣本處置裝置115。系統(tǒng)100進(jìn)一步包含第一以及任選地第二樣本純化裝置135(例如固相萃取盒)，其經(jīng)配置以用于清潔樣本(例如，去鹽、移除污染物、聚集蛋白質(zhì))，以及任選的層析柱140，其可經(jīng)配置以用于通過在質(zhì)譜分析之前的液相層析而至少部分地純化樣本110。至少一個樣本純化裝置135可包括直列式尺寸排阻層析柱，其可用以不僅移除鹽而且還移除小分子和脂質(zhì)。樣本110、第一和任選的第二樣本純化裝置135以及任選的層析柱140與流體處置泵130、各種反應(yīng)劑、緩沖劑和其它流體120以及質(zhì)譜儀150成流體連通。

樣本處置裝置115能夠準(zhǔn)備含有一或多種微生物的某一范圍的樣本類型，且將從所述微生物提取的可溶蛋白質(zhì)部分遞送到質(zhì)譜儀150用于分析。樣本110可為疑似含有一或多種微生物的任何類型，包含但不限于來自培養(yǎng)基板的隔離的群落、來自液體生長介質(zhì)的細(xì)胞、血液、血培養(yǎng)基、唾液、尿、糞便、痰液、傷口和身體部位棉簽、土壤、食物、飲料、水、空氣以及環(huán)境表面棉簽。

樣本處置裝置115可包含細(xì)胞中斷構(gòu)件、機器人液體處置構(gòu)件、離心機、過濾構(gòu)件、孵育箱、混合構(gòu)件、真空泵、流體泵以及反應(yīng)劑120中的一或多者，其可用于微生物的中斷以及可溶蛋白質(zhì)部分的隔離。細(xì)菌、真菌、霉?jié){菌細(xì)胞、病毒及類似物的中斷可通過機械、化學(xué)、酶和其它方式實現(xiàn)，如此項技術(shù)中通常已知。機械方法包含打珠、例如french壓機及類似物的壓力的使用、超聲處理或此項技術(shù)中已知的其它方法?；瘜W(xué)方法包含暴露于例如尿素、硫脲或胍hcl等離液劑以使微生物細(xì)胞裂解且溶解其內(nèi)含物。替代地，有機酸/溶劑混合物可用來破壞細(xì)胞。酶方法包含使用溶菌酶、溶葡球菌酶或其它裂解酶類以在細(xì)菌細(xì)胞壁中形成“孔”，其允許內(nèi)含物滲出到周圍溶液中。

如圖1中所說明，系統(tǒng)100進(jìn)一步包含任選的控制單元160，其可通過聯(lián)動裝置170a-170d鏈接到系統(tǒng)100的各種組件。舉例來說，控制單元160可鏈接到樣本110以控制樣本施加，鏈接到反應(yīng)劑120以控制各種反應(yīng)劑的施加，鏈接到泵130以控制流體處置、流動速率等，鏈接到樣本處置裝置115以控制樣本準(zhǔn)備，且鏈接到質(zhì)譜儀150以控制質(zhì)譜法參數(shù)。在所說明的實施例中，控制單元160也可充當(dāng)數(shù)據(jù)處理單元以例如處理來自質(zhì)譜儀150的數(shù)據(jù)，或?qū)?shù)據(jù)轉(zhuǎn)發(fā)到服務(wù)器以用于處理和存儲(圖1中未圖示服務(wù)器)?？刂茊卧?60也可實時確定ptr產(chǎn)物離子的任何產(chǎn)生的分子量和電荷態(tài)以用于ms/ms、msⁿ或分子量確定?？刂茊卧?60也可用以將結(jié)果自動轉(zhuǎn)發(fā)到醫(yī)療保健專業(yè)人士。

在一些實施例中，系統(tǒng)100經(jīng)設(shè)計以由臨床醫(yī)生或一般實驗室技術(shù)員使用，其不一定在樣本準(zhǔn)備、lc-ms操作、lc-ms方法開發(fā)及類似等所有方面中都有專業(yè)技能。因此，控制單元160可經(jīng)設(shè)計以通過為用戶提供簡化應(yīng)用程序接口而囊封數(shù)據(jù)系統(tǒng)環(huán)境，所述應(yīng)用程序接口可用以起始且監(jiān)視測定樣本110的基本上所有方面而不需要用戶與系統(tǒng)100的總體硬件和控制系統(tǒng)交互?？刂茊卧?60因此經(jīng)配置以提供用戶與控制著裝置、數(shù)據(jù)文件和用于將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為用戶可讀形式的算法的底層服務(wù)之間的分離程度。即，控制單元160使得用戶不需要知道或控制硬件以用于分析臨床樣本，且提供簡化接口以從質(zhì)譜儀發(fā)送和接收信息。

控制單元160可經(jīng)配置以內(nèi)部地監(jiān)視每一樣本分析請求，且能夠通過系統(tǒng)100始終跟蹤分析請求。一旦系統(tǒng)100正在獲取或已經(jīng)獲取樣本110的數(shù)據(jù)，則控制單元160可經(jīng)配置以基于由用戶選擇的測定類型而自動開始后處理數(shù)據(jù)。最重要的是，控制單元160可經(jīng)配置以在獲取過程期間實時處理數(shù)據(jù)。此處實時地將結(jié)果返回到用戶，其包含微生物識別、毒性和抗性表征、菌株匹配信息，以及關(guān)于抗生素易感性測試的數(shù)據(jù)。此外，控制單元160可經(jīng)配置以基于由用戶選擇的測定類型而自動選擇后處理參數(shù)，從而一旦測定已選定且開始用于分析則進(jìn)一步減少用戶與系統(tǒng)交互的需要。控制單元160可被設(shè)計為配合于系統(tǒng)100與用戶之間的層，以減少設(shè)置樣本測定以用于獲取所需的復(fù)雜性?？刂葡到y(tǒng)160還可經(jīng)配置以僅將最相關(guān)數(shù)據(jù)返回到用戶以避免用戶接收太多的額外信息。

在一個實施例中，系統(tǒng)100可進(jìn)一步包含可操作地耦合到樣本處置裝置115或與其集成的樣本檢測裝置(未圖示)。所述樣本檢測裝置可與樣本處置裝置115一起工作或獨立于樣本處置裝置115而執(zhí)行以下功能中的至少一者：i.識別進(jìn)入系統(tǒng)的樣本；ⅱ.識別用于進(jìn)入系統(tǒng)的樣本的測定類型；iii.基于預(yù)期測定類型和/或所關(guān)注的分析物而選擇測定協(xié)議；ⅳ.引導(dǎo)樣本處置裝置和/或控制系統(tǒng)以起始對樣本中所關(guān)注的分析物的分析；v.引導(dǎo)控制系統(tǒng)基于針對測定類型和/或所關(guān)注的分析物選定的測定協(xié)議而選擇一或多種反應(yīng)劑；vi.引導(dǎo)控制系統(tǒng)基于針對測定類型和/或所關(guān)注的分析物選定的測定協(xié)議而選擇液相層析移動相條件，且致使液相層析系統(tǒng)執(zhí)行測定和/或純化所關(guān)注的分析物；vii.引導(dǎo)控制系統(tǒng)基于針對測定類型和/或所關(guān)注的分析物選定的測定協(xié)議而選擇質(zhì)譜儀設(shè)定，且致使質(zhì)譜儀產(chǎn)生與選定測定類型和/或所關(guān)注的分析物相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)；以及viii.引導(dǎo)控制系統(tǒng)分析與選定測定類型和/或所關(guān)注的分析物相關(guān)聯(lián)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)以識別所關(guān)注的分析物的存在和/或濃度。

樣本或經(jīng)處理樣本可在質(zhì)譜法的分析之前經(jīng)凈化和或純化。此純化或樣本凈化可指代從粗細(xì)胞提取物移除鹽或脂質(zhì)的程序，或使所關(guān)注的一或多種分析物相對于樣本的一或多種其它組分變豐富的程序。其也可指代具有用于處置分枝桿菌或絲狀真菌的生物安全三級機構(gòu)的單獨實驗室中的樣本處理和凈化。在此實施例中，樣本傳送到系統(tǒng)且可如先前所描述進(jìn)行分析。在一個實施例中，此純化或樣本凈化可通過固相萃取裝置、直列式尺寸排阻層析和/或任選的層析柱140實現(xiàn)。

在一個實施例中，第一和/或第二樣本純化裝置135可包含固相萃取(spe)盒。在一些實施例中，spe盒可直接與高分辨率/高質(zhì)量準(zhǔn)確性質(zhì)譜儀150成直列式。在一個實施例中，spe盒可為具有具有小體積的二氧化硅或其它吸附劑的聚丙烯尖端，其含有固定于盒中的鍵合的c4、c8或c18或其它官能團(tuán)，例如stagetip^tm盒(thermofisherscientific)。在替代實施例中，可使用聚合吸附劑或螯合劑。床體積可小達(dá)1μl或更小，但也可以使用較大體積。所述設(shè)備和方法良好地適合于從微生物細(xì)胞導(dǎo)出的復(fù)雜樣本，因為每一spe盒僅使用一次，從而使從一個樣本到另一樣本的殘留問題最小化。

在一個實施例中，樣本純化裝置135可為直列式尺寸排阻層析柱，其經(jīng)設(shè)計以從樣本110移除鹽、小分子和脂質(zhì)。所述方法還可用以分離媒介與大分子量蛋白質(zhì)。將相選擇為與部分(即，少于100％)有機溶液和有機酸相容。相可適應(yīng)分子量從10³到10⁸da不同的蛋白質(zhì)尺寸分布。實時經(jīng)調(diào)流動速率以實現(xiàn)完整蛋白質(zhì)從小分子的分離，其中分離流動速率通常比用以從系統(tǒng)移除小分子、脂質(zhì)和鹽的較高流動速率小得多。在此實施例中，樣本純化裝置135也可以經(jīng)加熱以促進(jìn)完整蛋白質(zhì)的較快擴散速率，因此顯著縮短運行時間。移動相通過樣本純化裝置135的流動也可以在凈化過程的一部分期間分流，以從流動的流移除某些雜質(zhì)且防止其進(jìn)入質(zhì)譜儀150。

在一個實施例中，任選的層析柱140可包含經(jīng)配置以用于樣本中的蛋白質(zhì)的至少部分層析分離的柱。層析柱中的固定相可為多孔或非多孔的二氧化硅或瓊脂糖顆粒，或所述柱內(nèi)部聚合或另外形成的單塊材料。所述固定相可涂覆有適當(dāng)材料，例如c18、c8、c4或另一合適的衍生物，或含有陽離子交換劑或其它材料，或以上的組合以促進(jìn)蛋白質(zhì)的分離，且此材料可以化學(xué)方式鍵合到顆?；蛟谒鲋鶅?nèi)為單塊的。顆粒大小通常在1.5μm到30μm的范圍內(nèi)變化?？讖娇梢栽?0到300埃的范圍內(nèi)變化。柱的內(nèi)徑通常在50μm到2.1mm的范圍內(nèi)變化，且柱長度在約0.5cm到25cm的范圍內(nèi)或以其它方式變化。移動相或溶離劑可為純?nèi)軇┗蛘邇煞N或更多種溶劑的混合物，且可含有添加的鹽、酸和/或其它化學(xué)改質(zhì)劑。蛋白質(zhì)基于一或多個生理化學(xué)性質(zhì)在柱上分離，包含大小、凈電荷、疏水性、親和力或其它生理化學(xué)性質(zhì)。層析分離方法包含離子交換、尺寸排阻、hilic、疏水性交互、親和力、正常相或反向相層析法中的一或多者。

純化樣本的額外方法可包含(不限于)液相層析、hplc、uhplc、沉淀、固相萃取、液-液提取、透析、親和力捕獲、電泳、過濾、超過濾或此項技術(shù)中已知用于純化的其它合適的方法。

已經(jīng)描述涉及在質(zhì)譜法分析之前使用hplc用于樣本凈化的各種方法。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇適合于在本發(fā)明中使用的hplc儀器和柱。層析柱通常包含媒介(即，填充材料)以在空間和時間上促進(jìn)化學(xué)部分的分離。所述媒介可包含極小顆粒，其可具有與各種化學(xué)部分交互以促進(jìn)所關(guān)注的分析物的分離的鍵合表面。一個合適的鍵合表面是疏水性鍵合表面，例如烷基鍵合表面。烷基鍵合表面可包含c4、c8或c18鍵合烷基。另外，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)水平中已知的單塊和其它相。層析柱包含用于接收樣本的入口端口以及用于排放包含部分分離樣本的流出物的出口端口。舉例來說，測試樣本可在入口端口處施加于柱，以溶劑或溶劑混合物溶離，且在出口端口處排放。在另一實例中，多于一個柱可循序地使用或作為二維(2d)層析法系統(tǒng)，其中測試樣本可在入口端口處施加于第一柱，以溶劑或溶劑混合物溶離到第二柱上，且以溶劑或溶劑混合物從所述第二柱溶離到出口端口?？蛇x擇不同溶劑模式用于溶離分析物。舉例來說，可使用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式執(zhí)行液相層析。

圖2是可用作圖1的質(zhì)譜儀150的示范性質(zhì)譜儀150a的示意性繪圖。在圖2中說明的質(zhì)譜儀是混合質(zhì)譜儀，包括多于一個類型的質(zhì)量分析器。具體地說，質(zhì)譜儀150a包含離子阱質(zhì)量分析器216以及orbitrap^tm分析器，其為一類靜電阱質(zhì)量分析器。如下文將描述，由于根據(jù)本發(fā)明教示的各種分析方法采用多次質(zhì)量分析數(shù)據(jù)采集，因此混合質(zhì)譜儀系統(tǒng)可有利地用以通過同時使用兩個或更多個分析器而改善工作循環(huán)。orbitrap^tm質(zhì)量分析器212采用圖像電荷檢測，其中通過由質(zhì)量分析器的電場內(nèi)離子的運動在一組電極上感應(yīng)的圖像電流的檢測間接檢測離子。在廣泛使用的數(shù)據(jù)相依實驗方案中，初始“調(diào)查”掃描用于識別從液體層析儀(lc)溶離的所關(guān)注特征，且隨后，執(zhí)行可包括串連質(zhì)譜掃描(msn)的若干(處于10-50的范圍內(nèi))“相依”質(zhì)量掃描以詢問調(diào)查掃描中識別的前驅(qū)體物質(zhì)。如果所述儀器為混合型，具有一個以上類型的質(zhì)量分析器，那么可通過使用一個分析器用于調(diào)查掃描且另一分析器用于相依m(xù)sn掃描來增加工作循環(huán)。

在質(zhì)譜儀150a的操作中，電噴射離子源201提供待分析的樣本的離子到撇渣器202的孔隙，在此處離子進(jìn)入第一真空腔室。在進(jìn)入之后，由堆疊環(huán)離子導(dǎo)向器204將離子捕獲且聚焦為密集束。第一離子光學(xué)傳送組件203a將束傳送到下游的質(zhì)譜儀的高真空區(qū)。大多數(shù)剩余的中性分子和不合意的高速度離子群集(例如溶合離子)通過彎曲束導(dǎo)向器206從離子束分離。中性分子和離子群集跟隨直線路徑，而所關(guān)注的離子由曳力場引起彎曲約九十度轉(zhuǎn)彎，從而產(chǎn)生分離。

質(zhì)譜儀150a的四極濾質(zhì)器208在其常規(guī)意義上用作可調(diào)諧的濾質(zhì)器以便僅在選定窄的m/z范圍內(nèi)使離子通過。后續(xù)離子光學(xué)傳送組件203b將經(jīng)過濾離子遞送到彎曲四極離子阱(“c阱”)組件210。c阱210能夠沿著四極濾質(zhì)器208與離子阱質(zhì)量分析器216之間的路徑傳送離子。c阱210也具有臨時收集且存儲離子群體并且然后將離子作為脈沖或包遞送到orbitrap^tm質(zhì)量分析器212中的能力。離子包的傳送是通過在c阱210與安置于c阱210和orbitrap^tm質(zhì)量分析器212之間的一組注入電極211之間施加電位差來控制。c阱的曲率經(jīng)設(shè)計以使得離子群體在空間上聚焦以便匹配orbitrap^tm質(zhì)量分析器212的入口孔徑的接受角。

多極離子導(dǎo)向器214和光學(xué)傳送組件203b用來在c阱210與離子阱質(zhì)量分析器216之間導(dǎo)引離子。多極離子導(dǎo)向器214提供臨時離子存儲能力以使得在分析方法的第一處理步驟中產(chǎn)生的離子可稍后被取得以用于后續(xù)步驟中的處理。多極離子導(dǎo)向器214也可充當(dāng)分段單元。沿著c阱210與離子阱質(zhì)量分析器216之間的路徑的各種柵電極是可控的，以使得離子可在任一方向上傳送，這取決于任何特定分析方法中所需的離子處理步驟的序列。

離子阱質(zhì)量分析器216是雙壓力線性離子阱(即，二維阱)，其包括高壓線性阱單元217a和低壓線性阱單元217b，所述兩個單元定位成鄰近于彼此，通過具有小孔隙的板透鏡分隔開，所述小孔隙準(zhǔn)許所述兩個單元之間的離子傳送且呈現(xiàn)泵送限制并允許在所述兩個阱中維持不同的壓力。高壓單元217a的環(huán)境有利于離子冷卻、并且有利于在受控條件下通過碰撞引起的解離或電子轉(zhuǎn)移解離的離子分段，或例如質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)等離子-離子反應(yīng)。低壓單元217b的環(huán)境有利于以高分辨力和質(zhì)量準(zhǔn)確性進(jìn)行分析掃描。低壓單元包含雙倍增極離子檢測器215。

質(zhì)量分析方法內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移解離或質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的步驟的使用需要在質(zhì)譜儀內(nèi)引起受控離子-離子反應(yīng)的能力。離子-離子反應(yīng)又需要產(chǎn)生反應(yīng)劑離子以及致使反應(yīng)劑離子與樣本離子混合的能力。如圖2中所描繪的質(zhì)譜儀150a說明兩個替代的反應(yīng)劑離子來源，第一反應(yīng)劑離子源299a安置于堆疊環(huán)離子導(dǎo)向器204與彎曲束導(dǎo)向器206之間，且第二反應(yīng)劑離子源299b安置在儀器的相對端，鄰近于線性離子阱質(zhì)量分析器216的低壓單元217b。大體上，任何特定系統(tǒng)將至多僅包含一個反應(yīng)劑離子源。然而，此處為了說明性目的而描繪且論述兩個不同反應(yīng)劑離子源。雖然以下論述是針對用于ptr的反應(yīng)劑離子源，但類似論述可應(yīng)用于etd反應(yīng)劑離子源。

第一可能的反應(yīng)劑離子源299a可位于堆疊環(huán)離子導(dǎo)向器204與彎曲束導(dǎo)向器206之間。反應(yīng)劑離子源299a包括輝光放電單元，其包括暴露于反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管298a的一對電極(陽極和陰極)，所述反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管從具有使反應(yīng)劑化合物揮發(fā)的加熱器的反應(yīng)劑液體(或固體)儲集器297a遞送反應(yīng)劑氣體。當(dāng)跨電極施加高電壓時，起始輝光放電，其使在電極之間流動的反應(yīng)劑電離。來自輝光放電源的反應(yīng)劑陰離子被引入到在四極濾質(zhì)器208前方的離子光學(xué)元件路徑，在其內(nèi)它們可進(jìn)行m/z選擇。反應(yīng)劑離子接著可在多極離子導(dǎo)向器214中積聚，且隨后傳送到雙壓力線性離子阱216的高壓單元217b中，在其內(nèi)使得它們可用于ptr反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物可直接傳送到低壓力單元217a或orbitrap^tm質(zhì)量分析器212用于m/z分析。

可能的替代反應(yīng)劑離子源299a可鄰近于低壓力線性阱單元217b定位，在此其可包括額外高真空腔室292，反應(yīng)劑離子可以從所述高真空腔室通過腔室292與高壓單元之間的孔隙而引導(dǎo)到高壓力單元217b中。在操作中，氣態(tài)反應(yīng)劑化合物從具有使反應(yīng)劑化合物揮發(fā)的加熱器的反應(yīng)劑液體(或固體)儲集器297b供應(yīng)，且被引導(dǎo)通過反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管298b，所述反應(yīng)劑氣體導(dǎo)管將反應(yīng)劑氣體遞送到部分地被限制的離子產(chǎn)生體積296中。在操作中，從電加熱長絲294供應(yīng)的熱離子電子通過在長絲294與加速器電極(未圖示)之間施加電位而以某一預(yù)定能量引導(dǎo)到離子產(chǎn)生體積296中。供應(yīng)的高能電子造成反應(yīng)劑氣體的電離以便產(chǎn)生反應(yīng)劑離子。反應(yīng)劑離子接著可在柵電極(未圖示)的操作下由離子光學(xué)傳送組件203a導(dǎo)引到高壓單元217b中。

根據(jù)本發(fā)明教示的示范性方法在圖3a到3d中所示的流程圖中示意性地說明。圖3a示意性地說明用于監(jiān)視樣本中的某些特定目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)的存在并任選地對其進(jìn)行量化的第一種此類示范性方法，方法300。初始步驟302a(或者，步驟302b)為樣本制備和提供步驟。倘若樣本從(例如)細(xì)菌集落導(dǎo)出，則步驟302a包含微生物中斷(例如，裂解)和提取。在例如圖3a中概述的目標(biāo)分析中，預(yù)先已知關(guān)于分析物的質(zhì)譜簽名(例如一或多個特定診斷離子物質(zhì))的特定信息。已知信息將通常包含分析物的分子量。因此，將同樣已知從分子產(chǎn)生的離子的各種電荷態(tài)的m/z值(例如，如電噴射電離期間產(chǎn)生的分析物分子的不同多質(zhì)子版本)。通常，還將已知離子的分段反應(yīng)期間產(chǎn)生的診斷片段離子的m/z值。因此，在步驟303中，關(guān)于待搜索的此些特定離子的一或多個預(yù)定質(zhì)荷比(m/z)和對應(yīng)電荷態(tài)(zp)輸入到控制程序或控制單元，例如控制單元或處理器160(圖1)。假定每一目標(biāo)離子通過離子源中的分析物分子的質(zhì)子化形成，那么針對每一此特定離子，加合質(zhì)子的數(shù)目由zp給出，且用以形成離子的化合物的分子量mw由mw＝[zpx(m/z)p]-nxmproton給出，其中n是小整數(shù)(例如，1≤n≤5)且mproton為原子單位(au)的質(zhì)子的質(zhì)量。

方法300的接下來的步驟304和306分別是固相凈化或尺寸排阻層析以及層析分離的步驟，如上文所描述。在一些實驗情形中，可在后續(xù)樣本引入步驟308中將所提取樣本直接灌注到質(zhì)譜儀中，因此，步驟304和306由虛線展示為任選的。作為執(zhí)行步驟304和306的替代方案，樣本還可在樣本制備步驟302b期間“離線”期間使用包含透析或現(xiàn)有技術(shù)水平中已知的其它技術(shù)的方法至少部分純化。

當(dāng)必須根據(jù)時間約束完成分析時，如一些臨床應(yīng)用中，分析所需的時間可通過采用spe步驟304(如發(fā)明人enke的u.s.5,175,430中所描述的時間壓縮層析法步驟)或如國際(pct)專利申請公開案wo2013/166169a1中所描述的層析法步驟306中的“快速部分層析分離”(fpcs)的方法而縮短。大體上，在執(zhí)行fpcs中，含有各種有機和無機分析物的復(fù)雜混合物的微生物細(xì)胞的粗提取物(小有機分子、蛋白質(zhì)及其天然產(chǎn)生片段、脂質(zhì)、核酸、多糖、脂蛋白等)加載于層析柱上且經(jīng)受層析法。然而，并非允許梯度來單獨地溶離每一分析物(理想地，每層析峰一種分析物)，而是有意加速所述梯度以使得在例如近似八分鐘或更短時間內(nèi)、且優(yōu)選地五分鐘或更短時間內(nèi)大體上不獲得層析峰，而不是獲得基線分離原本將需要的長得多的運行時間。在fpcs分離中，許多分析物是根據(jù)其性質(zhì)以及使用的層析法的類型(反相、hilic等)而在任何給定時間從柱有意地共溶離。部分或不完全分離也可通過所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方法實現(xiàn)，包含但不限于減少化合物在柱上的保持的移動相溶劑和/或改質(zhì)劑的使用，減少化合物在柱上的保持的固定相媒介的選擇(包含粒度、微孔尺寸等)，層析系統(tǒng)以較高流動速率的操作，層析系統(tǒng)以高溫的操作，或不同層析分離模式(即，反相、尺寸排阻等)的選擇。fpcs技術(shù)產(chǎn)生很少或可能不產(chǎn)生跨越整個梯度的解析層析峰。因此，從層析圖導(dǎo)出的大體上僅相關(guān)信息是從柱的溶離時間。記錄的每一質(zhì)譜表示共溶離分析物的“子集”，其隨后經(jīng)電離、在質(zhì)量分析器中分離且被檢測。

在步驟308(圖3a)中，所述樣本引入到質(zhì)譜儀，且所述樣本經(jīng)離子化。所述樣本可提供為從spe盒、層析法設(shè)備或替代地通過溶離液溶液的直接輸注而出現(xiàn)的溶離液材料。在提供到質(zhì)譜儀后，通過質(zhì)譜儀的電噴射電離源將樣本化合物電離(步驟308)。這些電噴射產(chǎn)生的離子在本文稱為“原始”離子。在此時，可任選地執(zhí)行完整或分段ms¹掃描(步驟309)以便識別m/z空間中的富蛋白質(zhì)區(qū)。(應(yīng)注意在本文檔中，可采用術(shù)語“掃描”來當(dāng)用作名詞時一般指代質(zhì)譜，或替代地當(dāng)用作動詞時指代質(zhì)譜的獲取)。調(diào)查掃描將通常涵蓋質(zhì)荷比的特定實驗范圍，δ(m/z)survey。在目標(biāo)分析的情況下，如方法300(圖3a)中概述，ms¹掃描可能是不必要的，且方法300的執(zhí)行可直接繼續(xù)到步驟310，其中隨后隔離離子的子集以用于進(jìn)一步反應(yīng)和分析。在步驟310中執(zhí)行的隔離可以使得某一預(yù)定m/z范圍或可能多個預(yù)定m/z范圍內(nèi)的離子被保持以用于后續(xù)反應(yīng)和分析，而一或多個預(yù)定m/z范圍外的離子被丟棄。預(yù)定m/z范圍經(jīng)設(shè)定以便對應(yīng)于目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的輸入m/z比(步驟303)，在方法的執(zhí)行中檢測或監(jiān)視所述目標(biāo)分析物蛋白質(zhì)或肽的存在或數(shù)量。

大體上，可以已知方式通過將來自離子源的離子引入到離子阱(例如三維離子阱、彎曲離子阱(有時稱為“c阱”)、單片段線性離子阱、多分段線性離子阱、多極離子導(dǎo)向器或四極濾質(zhì)器)中，并且然后通過跨離子阱的電極對施加補充ac電壓或施加適當(dāng)rf/dc電壓比以隔離所關(guān)注的離子群體而共振地噴出m/z比在所希望范圍之外的離子，來執(zhí)行步驟310的隔離。在一些實施例中，補充電壓的頻率可掃過各種頻率以使得離子根據(jù)其m/z比按順序噴出。在一些實施例中，疊加頻率的組合可具備遺失頻率的多個片段(即，“缺口”)以使得包括兩個或更多個非鄰接m/z比范圍的離子在阱內(nèi)同時隔離。

四極濾質(zhì)器也可(或作為替代)用以隔離所關(guān)注的經(jīng)界定或目標(biāo)質(zhì)量范圍。原始離子的特定m/z范圍是通過單個或一系列固定rf/dc電壓比率而選擇以便選擇適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量隔離窗口。在此情況下采用的起作用的配置可為混合質(zhì)譜儀儀器，其包括四極、c阱、orbitrap^tm質(zhì)量分析器以及高能量碰撞池(hcd)，其中隔離的離子群體可存儲在c阱或hcd池中用于ptr實驗。原始離子的隔離群體可視為包括“前驅(qū)體”離子，因為在步驟310之后，這些離子經(jīng)受后續(xù)離子-離子反應(yīng)或分段。

在優(yōu)選實施例中，前驅(qū)體離子群體的隔離可在分段線性離子阱的第一片段中執(zhí)行。在所需離子群體的隔離之后，多電荷蛋白質(zhì)離子群體可有利地移動到線性離子阱的另一片段。這些步驟可在ptr過程之前針對前驅(qū)體離子的隔離的經(jīng)界定范圍重復(fù)多次。

方法300(圖3a)的步驟312為包含離子停車的ptr步驟。在ptr程序中，使用具有化學(xué)電離的基于錸的長絲或輝光放電電離源從合適的基于高電子親和性的氣態(tài)反應(yīng)劑產(chǎn)生陰離子?？墒褂玫獨?、甲烷、異丁烷或現(xiàn)有技術(shù)水平中的其它已知氣體執(zhí)行化學(xué)電離。陰離子反應(yīng)劑可為在室溫下的氣體，或可為具有足夠蒸氣壓力以產(chǎn)生過量陰離子的液體，所述過量陰離子將在偽一級反應(yīng)條件下驅(qū)動ptr過程。陰離子隨后從源區(qū)傳送到分段線性阱，借此使用如上文所描述的補充ac電壓使特定陰離子反應(yīng)劑質(zhì)量隔離。陰離子源可與電噴射源成直列式或安裝在分段線性離子阱的相對端上。替代地，四極濾質(zhì)器也可執(zhí)行陰離子隔離，其中后續(xù)ptr過程在儀器的c阱或hcd池中發(fā)生。

步驟312的執(zhí)行包含跨越離子阱的一對電極施加補充ac激勵波形，在離子阱內(nèi)，樣本導(dǎo)出的陽離子與ptr反應(yīng)劑陰離子反應(yīng)持續(xù)預(yù)定時間周期。此“離子停車”程序的采用將從任何特定第一代蛋白質(zhì)或多肽離子導(dǎo)出的離子的分布集中到如所施加波形確定的m/z值的特定限制范圍中。此程序?qū)⑼ǔ娜魏翁囟ǖ鞍踪|(zhì)或多肽離子導(dǎo)出的離子限制到特定電荷態(tài)，借此簡化所得質(zhì)譜且增加對應(yīng)于特定蛋白質(zhì)或多肽的任何質(zhì)譜峰值的強度。離子被限制到的m/z值的特定范圍可包括從第一代離子物質(zhì)導(dǎo)出的不同相應(yīng)電荷態(tài)的離子。通常，離子將停放在比初始目標(biāo)前驅(qū)體離子的電荷態(tài)zp少幾個單位(例如，少不超過五個單位)的電荷態(tài)中。相應(yīng)地，用于離子停車的所施加波形將具有與具有質(zhì)荷比(m/z)2的離子的運動頻率匹配的頻率，所述質(zhì)荷比(m/z)2由下式給出

(m/z)2＝(mp-nxmproton)/(zp–n)等式1

其中n為小整數(shù)(例如，1≤n≤5)，且mproton為原子單位(au)的質(zhì)子的質(zhì)量。優(yōu)選地，(m/z)2大于先前步驟310中采用的隔離窗口涵蓋的所有質(zhì)荷比以便借此優(yōu)化污染物離子與對應(yīng)于潛在蛋白質(zhì)或多肽分析物的離子的分離。

步驟312期間離子停車的應(yīng)用致使分析物導(dǎo)出的離子與非分析物或污染物離子譜上分離，非分析物或污染物離子可在較早質(zhì)量隔離步驟(例如，步驟310)期間連同分析物離子一起共隔離。分析物離子(其m/z比使得其阱振蕩的頻率對應(yīng)于所施加的補充ac激勵頻率)從與ptr反應(yīng)劑離子的進(jìn)一步電荷縮減反應(yīng)有效地移除，而不同m/z比的非分析物離子經(jīng)受進(jìn)一步電荷縮減乃至抵消。其中n為小整數(shù)(例如，1≤n≤5)，且mproton為原子單位(au)的質(zhì)子的質(zhì)量。如果電荷縮減的程度小于分析物的單一電荷單位，那么分析物離子將不“停車”，但非分析物離子可能不合需要地停放；如果分析物離子的電荷縮減的程度太大，那么分析物離子的質(zhì)荷比可增加到質(zhì)量分析器的檢測范圍以外的范圍。

因為在步驟312中分析物離子與其它離子譜上分離，所以根據(jù)m/z比的額外隔離步驟(步驟314)產(chǎn)生所要電荷態(tài)中的目標(biāo)分析物的基本上純的離子群體(其條件是此些分析物離子存在于所述樣本中)。電荷縮減狀態(tài)(相對于步驟310中初始地隔離的分析物離子的電荷態(tài))中的隔離的分析物離子在此處關(guān)于論述中的方法稱為第一代產(chǎn)物離子。施加到這些經(jīng)純化第一代產(chǎn)物離子的第二ptr步驟(步驟316)隨后產(chǎn)生多個相應(yīng)電荷態(tài)中的離子物質(zhì)的新的分布，其中每一此離子物質(zhì)從目標(biāo)分析物導(dǎo)出。所述分布除第二ptr步驟316期間形成的新物質(zhì)(此處被稱作第二代產(chǎn)物離子物質(zhì))外還可包含殘余第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)。電荷縮減的程度取決于在此期間允許分析物離子與ptr反應(yīng)劑離子反應(yīng)的時間量。實際反應(yīng)時間可在少至1ms到大致100ms的范圍內(nèi)變化。在較短反應(yīng)時間的情況下，可保持殘余量的第一代產(chǎn)物離子物質(zhì)。步驟316可任選地包含并行停車以便產(chǎn)生具有相應(yīng)電荷態(tài)的多個離子物質(zhì)。在此些情況下，用于離子停車的所施加的輔助波形將包括求和的多個相應(yīng)分量波形(總共n個此類分量波形)，每一分量波形具有與具有質(zhì)荷比(m/z)j，(1≤j≤n)的相應(yīng)縮減電荷態(tài)離子物質(zhì)的運動頻率匹配的頻率fj，(1≤j≤n)，所述質(zhì)荷比(m/z)由下式給出

(m/z)j＝(mp-jxmproton)/(zp–j)等式2

其中mproton為原子單位(au)的質(zhì)子的質(zhì)量。每一(m/z)j可大于先前步驟314中采用的隔離窗口涵蓋的所有質(zhì)荷比以便進(jìn)一步增強污染物離子與對應(yīng)于潛在蛋白質(zhì)或多肽分析物的離子的分離。

由ptr步驟316產(chǎn)生的離子物質(zhì)的整個群體可在步驟318中經(jīng)受使用較高碰撞能量解離(hcd)技術(shù)的分段。因為步驟316之后保持的每一離子物質(zhì)理論上從目標(biāo)分析物導(dǎo)出，所以所有此些片段可提供分析物特定診斷信息。因為具有不同電荷態(tài)的離子可彼此不同地解離，所以具有不同電荷態(tài)的離子的同時分段可導(dǎo)致與單一電荷態(tài)的分段相比較豐富的診斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息(肽序列信息)。分段期間，所施加的碰撞能量可經(jīng)控制以便避免過分分段-換句話說，片段的進(jìn)一步分段。在后續(xù)步驟320中，片段由質(zhì)量分析器分析以便產(chǎn)生片段的質(zhì)譜。在步驟322中，可使用片段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)確認(rèn)原始樣本中目標(biāo)分析物的存在(或其缺乏)。關(guān)于片段的觀察到的質(zhì)譜峰值的強度還可與樣本中分析物的量有關(guān)。

在許多情形中，可在單一樣本中搜索一個以上目標(biāo)分析物。在此些情形中，方法300的執(zhí)行可返回(虛線標(biāo)記的“任選重復(fù)”)到步驟303，或取決于樣本和所采用的儀器，回到步驟304-310中的任一者以便獲取數(shù)據(jù)和作出關(guān)于不同分析物的確定。最后，可采用(步驟324)關(guān)于一個或幾個分析物的數(shù)據(jù)來自動識別從其導(dǎo)出所述樣本的微生物。

圖3b為根據(jù)本發(fā)明教示的第二示范性方法(方法340)的示意性流程圖。方法340針對樣本中一或多個蛋白質(zhì)的存在和/或濃度的數(shù)據(jù)相依確定。相對于其中預(yù)先已知待搜索的蛋白質(zhì)分析物的身份的目標(biāo)實驗(例如，方法300)，數(shù)據(jù)相依實驗并不假定此了解。實際上，在數(shù)據(jù)相依實驗中，在分析本身期間取決于相同實驗的較早步驟期間獲取的數(shù)據(jù)確定由質(zhì)譜儀執(zhí)行的步驟的特定細(xì)節(jié)。因此，方法340并不包含對應(yīng)于方法300的步驟303的數(shù)據(jù)輸入步驟，且與方法300的對應(yīng)步驟309相比，高分辨率ms調(diào)查掃描(步驟349)不是任選的。此外，隔離的(步驟351和355)原始離子的m/z范圍的選擇取決于先前調(diào)查掃描(步驟349)中獲得的結(jié)果，這與其中預(yù)先確定此些m/z范圍的方法300的質(zhì)量隔離步驟310形成對比。

在其它方面，方法340(圖3b)的許多步驟類似或等同于方法300(圖3a)的對應(yīng)步驟。因此，方法340的步驟341a、341b、343、345和347分別對應(yīng)于方法300的步驟302a、302b、304、306和308。類似地，方法340的步驟357、359、361、363和365分別對應(yīng)于方法300的步驟312、314、316、318和320。由于對應(yīng)步驟之間的類似性，此處不再呈現(xiàn)此些步驟的上文呈現(xiàn)的詳細(xì)論述。

數(shù)據(jù)相依方法340在其中所關(guān)注的化合物的身份預(yù)先未知且其中每一所分析的樣本部分具有有限復(fù)雜性的情形中有用，使得所獲取的調(diào)查數(shù)據(jù)提供足夠信息以實現(xiàn)自動確定待探究的m/z比范圍。樣本部分的有限復(fù)雜性可與所述樣本部分中的化學(xué)組分的數(shù)目的限制有關(guān)，這可能是由于先前極有效樣本凈化(步驟343)或極高分辨率層析分離(步驟345)用于提供所述樣本部分。

在方法340(圖3b)的步驟351中，基于原始離子的先前調(diào)查掃描的結(jié)果(步驟349)選擇用于原始離子的隔離的m/z范圍(即，“隔離窗口”)。與常規(guī)數(shù)據(jù)相依質(zhì)譜分析方法類似性，所述選擇可基于調(diào)查掃描中觀察到的有限數(shù)目的質(zhì)譜峰值的相對強度而作出。具體地說，如果調(diào)查掃描質(zhì)譜主要由比譜基線強得多的相對較小數(shù)目(小于約20)良好解析的峰值組成，那么步驟351-367的每一迭代(遵循根據(jù)圖3b中的虛線標(biāo)記的“任選重復(fù)”的執(zhí)行流程)可對應(yīng)于挑選涵蓋這些最強峰值中的每一者的隔離窗口。

已在yip等人的名義下且標(biāo)題為“混合生物分子分析物的數(shù)據(jù)相依質(zhì)譜法的方法(methodsfordata-dependentmassspectrometryofmixedbiomolecularanalytes)”的2015年3月12日申請的第62/132,124號共同待決且共同轉(zhuǎn)讓的美國臨時申請案中描述涉及自動化實時質(zhì)譜解卷積的調(diào)查掃描分析的較復(fù)雜方法，所述申請案的揭示內(nèi)容在此全文以引用的方式并入本文中。前述臨時申請案描述解卷積程序，借此質(zhì)譜峰值的各種集合(其中峰值的每一集合對應(yīng)于單一分析物)可辨識為電荷態(tài)分布。示意性實例(如圖7中所說明)說明并入到步驟351時解卷積程序如何可導(dǎo)致分別由包絡(luò)905和包絡(luò)906描繪的線的兩個重疊集合的辨識。利用由此初始調(diào)查程序提供的信息，單一代表性質(zhì)譜線可在確定隔離窗口時從線的每一集合中選出以用于進(jìn)一步分析(步驟351)。此方法避免使用常規(guī)相對線強度準(zhǔn)則挑選產(chǎn)生冗余信息的隔離窗口的可能性。

在方法340(圖3b)的步驟353中，確定經(jīng)選擇用于后續(xù)隔離(步驟355)的質(zhì)譜線的電荷態(tài)，使得后續(xù)離子停車程序(例如，步驟357)可采用對應(yīng)于正確地計算的縮減的電荷態(tài)的激發(fā)波形。如果調(diào)查掃描包含同位素變型的解析線，那么可依據(jù)同位素變型的線的間距確定所選擇的線的電荷態(tài)。或者，可通過應(yīng)用前述第62/132,124號美國臨時申請案中所描述的方法確定電荷態(tài)。

方法340(圖3b)的步驟367代替方法300(圖3a)的步驟322，因為不存在關(guān)于對于其已知存在質(zhì)譜線的化合物的“存在”的問題。實際上，可在步驟367中作出嘗試以基于所選擇的線的m/z(步驟351)和所確定的電荷態(tài)z(步驟353)以及片段的觀察到的m/z值(步驟365)識別對應(yīng)于對于其在步驟351中選擇隔離范圍的線的化合物。化合物確定可有利地利用第一代離子和片段的質(zhì)譜線的標(biāo)注數(shù)據(jù)庫。最后，在步驟351和367之間界定的步驟的環(huán)路的所有迭代已經(jīng)完成之后，可(適當(dāng)時)作出從其導(dǎo)出樣本的微生物的自動識別(如果已經(jīng)識別足夠數(shù)目的診斷蛋白質(zhì)化合物)。

圖3c為根據(jù)本發(fā)明教示的第三示范性方法的示意流程圖。圖3c中說明的方法370針對樣本中一或多個蛋白質(zhì)的存在和/或濃度的數(shù)據(jù)獨立確定。圖3c中說明的數(shù)據(jù)獨立方法370(以及圖3d中說明的替代的數(shù)據(jù)獨立方法400)可在不存在目標(biāo)分析物時以及譜太復(fù)雜(例如許多重疊或未解析的線，很少或沒有線具有主導(dǎo)強度)而不能采用數(shù)據(jù)相依分析時采用。方法370(圖3c)的步驟371a、371b、373、375、377和379類似于方法300(圖3a)的相應(yīng)的對應(yīng)步驟302a、302b、304、306、308和309，且因此此處不作詳細(xì)描述。

在執(zhí)行高分辨率ms調(diào)查掃描步驟(379)之后，方法370繼續(xù)以重復(fù)循環(huán)穿過所述組步驟381到393。在所述組步驟381到393的每一執(zhí)行期間，通過執(zhí)行以下步驟詢問相應(yīng)m/z范圍：在相應(yīng)所詢問m/z范圍內(nèi)隔離原始離子的相應(yīng)子群體(步驟381)、在應(yīng)用離子停車的情況下使隔離的子離子群體與ptr反應(yīng)劑反應(yīng)持續(xù)指定反應(yīng)時間(步驟383)、ptr程序之后剩余的離子的任選質(zhì)量分析(步驟384)、由hcd對ptr程序之后剩余的離子的分段(步驟385)、由質(zhì)量分析器對分段步驟之后剩余的離子的質(zhì)量分析，借此產(chǎn)生片段的質(zhì)譜(步驟387)、確定是否已經(jīng)詢問所有m/z范圍(步驟391)，以及如果更多m/z范圍待詢問，那么改變或遞增接下來待詢問的m/z范圍。任選地，可作出嘗試(步驟389a)以識別對應(yīng)于步驟381到393的環(huán)路的每一迭代期間相應(yīng)所詢問m/z范圍內(nèi)發(fā)生的線的化合物，但這些嘗試可任選地在環(huán)路外部執(zhí)行(步驟389b)?；衔镒R別步驟(步驟389a或389b)可利用片段離子的質(zhì)量分析(或分析)(步驟387)期間確定的線的觀察到的質(zhì)譜位置，和可能如可在步驟384中觀察到的由hcd自其形成片段的離子的質(zhì)譜位置。

因為方法370關(guān)于數(shù)據(jù)獨立分析，所以各種所詢問m/z范圍的位置大體來說不由高分辨率ms調(diào)查掃描(步驟379)的結(jié)果確定，而是實際全部或大部分預(yù)先確定，在最低m/z范圍到最高m/z范圍(或反之亦然)的遞增步驟中以預(yù)定增量進(jìn)行。相繼m/z范圍之間的遞增間距可恒定，或者可在分析過程期間變化。鄰近所詢問m/z范圍(m/z窗口)可為連續(xù)的且可彼此重疊。不太優(yōu)選地，一些所詢問m/z范圍之間存在間隙。其中可在所詢問m/z范圍之間有利地發(fā)生間隙的一個情形是，基于來自高分辨率ms調(diào)查掃描(步驟379)的信息(此些跳過區(qū)中不存在峰值)跳過特定m/z范圍時。

在步驟381到393的環(huán)路的對應(yīng)于相應(yīng)所詢問m/z范圍的每一迭代期間執(zhí)行質(zhì)量隔離(步驟381)。因為樣本中化合物的身份通常預(yù)先未知，所以隔離窗口的寬度將通常選擇為足夠大使得具有潛在診斷興趣的化合物的至少一個質(zhì)譜線很可能存在于隔離窗口內(nèi)。因此，步驟381中使用的隔離窗口寬度將通常大于已知(如數(shù)據(jù)相依實驗中)或預(yù)期(如目標(biāo)實驗中)線的位置時通常采用的窗口寬度(大致2th)最佳隔離窗口寬度可基于類似或相同樣本的常規(guī)實驗預(yù)先選擇。最佳窗口寬度可在方法370的執(zhí)行開始時在額外輸入步驟期間作為參數(shù)輸入。如果無最佳窗口寬度可用，那么可采用例如范圍4-6th(包含4-6th)內(nèi)的窗口寬度等默認(rèn)窗口寬度。

類似地，在步驟381到393的環(huán)路的每一迭代期間執(zhí)行ptr步驟(步驟383)。在將補充離子停車ac波形施加到其內(nèi)發(fā)生ptr反應(yīng)的離子阱的電極的情況下執(zhí)行ptr步驟。波形的頻率對應(yīng)于特定m/z值，(m/z)park。反應(yīng)過程期間形成的且碰巧包括極接近地等于(m/z)park的m/z值的任何ptr產(chǎn)物離子將被禁止參與與ptr反應(yīng)劑離子的任何進(jìn)一步電荷縮減反應(yīng)。因此，此些離子物質(zhì)將聚積在(m/z)park處，而所有其它離子的電荷將繼續(xù)縮減或抵消。如果(m/z)bound為隔離窗口的最低邊界，那么步驟383期間對于其將停放質(zhì)譜線的唯一化合物將為對于其滿足以下條件的那些化合物：(包括化合物的多質(zhì)子版本的離子的)鄰近電荷態(tài)之間的間距δ(m/z)使得δ(m/z)≤[(m/z)park-(m/z)bound]。因為樣本中化合物的身份通常預(yù)先未知，所以通常不知道多少化合物的譜簽名將“停放”在(m/z)park處。大體來說，僅幾個化合物(至多)將預(yù)期滿足以上條件。然而，對于其滿足此條件的化合物的數(shù)目(如果存在的話)將隨著(m/z)park與(m/z)bound之間的間距的增加而增加。在某一程度上，可基于具有潛在診斷興趣的化合物的所估計或已知分子量范圍估計鄰近電荷態(tài)之間的所要間距δ(m/z)desired。在此些情形中，可選擇補充波形使得量[(m/z)park–(m/z)bound]僅稍微大于δ(m/z)desired。

圖3d為根據(jù)本發(fā)明教示的第四示范性方法的示意流程圖。圖3d中說明的方法400為用于確定樣本中一或多個蛋白質(zhì)的存在和/或濃度的替代的數(shù)據(jù)獨立方法。方法400(圖3d)的許多步驟類似于方法370(圖3c)中的對應(yīng)步驟。因此，這些對應(yīng)步驟在圖3c-3d中類似地編號。具體地說，方法400的步驟(371a或371b)到步驟393類似于且組織為類似于方法370的對應(yīng)步驟，只是ptr產(chǎn)物離子(步驟384)的質(zhì)量分析不再是任選的且為方法400中的高分辨率質(zhì)量分析。

類似于已經(jīng)描述的方法300，方法400包含重復(fù)執(zhí)行的一組步驟(具體地說，步驟381-393)，其中所述組步驟的每一執(zhí)行對應(yīng)于不同相應(yīng)m/z范圍的詢問。方法370與方法400之間的主要差異在已詢問最終m/z范圍之后執(zhí)行的步驟中發(fā)生。在方法400中，一旦已詢問最后m/z范圍(步驟391中確定)，步驟391的“y”(是)分支就將執(zhí)行轉(zhuǎn)向新步驟417，在新步驟417處，執(zhí)行每一獲得的高分辨率ptrms掃描(來自步驟384)的自動數(shù)學(xué)解卷積以便針對每一此掃描辨識：(1)每一ptr譜中的蛋白質(zhì)線、m/z和電荷態(tài)z；以及(2)每一初始隔離窗口中的蛋白質(zhì)線、m/z和電荷態(tài)z。發(fā)明人yip等人的名義下的且標(biāo)題為“用于混合生物分子分析物的數(shù)據(jù)相依質(zhì)譜法的方法(methodsfordata-dependentmassspectrometryofmixedbiomolecularanalytes)”的2015年3月12日申請的第62/132,124號前述共同待決且共同轉(zhuǎn)讓的美國臨時申請案中已描述合適的自動化實時質(zhì)譜解卷積技術(shù)。在后續(xù)步驟419中，如數(shù)學(xué)解卷積確定的所辨識的蛋白質(zhì)線和電荷態(tài)設(shè)定為用于一或多個目標(biāo)實驗(例如，方法300)的執(zhí)行的輸入，且隨后執(zhí)行(步驟431)各種目標(biāo)實驗。使用后續(xù)目標(biāo)實驗中獲得的數(shù)據(jù)(可能由方法400的步驟384和387中獲得的數(shù)據(jù)補充)，可作出嘗試以識別樣本中的化合物(步驟432)。使用足夠數(shù)目的識別的化合物，可在適當(dāng)時作出(步驟433)從其導(dǎo)出樣本的微生物的識別。

實例

實例1.泛素混合物的質(zhì)譜分析。圖4a、4b、4c和4d說明應(yīng)用ptr和hcd的組合技術(shù)來分析含有充足的聚合污染物的泛素的溶液。圖4a為樣本的調(diào)查掃描(ms¹掃描)的圖形描繪?？杀孀R為關(guān)于泛素化合物的峰值以其電荷態(tài)和m/z位置標(biāo)記?？杀孀R為關(guān)于泛素化合物的峰值以其電荷態(tài)和m/z位置標(biāo)記。大多數(shù)或所有剩余峰值(其中幾個選定者以其m/z位置標(biāo)記)對應(yīng)于聚合污染物。為了簡化譜，泛素+13-電荷態(tài)峰值的預(yù)期位置附近寬度2th的隔離窗口內(nèi)的子離子群體被隔離(圖4b中展示的隔離的質(zhì)譜)，且隔離的原始離子暴露于ptr反應(yīng)劑(而無離子停車)持續(xù)50ms。通過此ptr步驟產(chǎn)生的第一代產(chǎn)物離子的質(zhì)譜在圖4c中說明。在ptr步驟之后，觀察到由其電荷態(tài)和m/z位置指示的若干良好解析的泛素線。正如期望，先前存在的泛素離子的最高電荷態(tài)(+12和更大)通過與ptr反應(yīng)劑的反應(yīng)完全消除；因此，總體分布移位到較低電荷態(tài)。盡管圖4c中的泛素線完全暴露，但弱背景線指示在原始隔離步驟中小比例的污染物離子連同泛素+13離子共隔離。

圖4c中說明的第一代產(chǎn)物離子的群體經(jīng)受根據(jù)較高碰撞能量解離(hcd)技術(shù)的分段步驟。獲得所得片段和殘余未分段離子的質(zhì)譜，如圖4d中所展示。眾所周知，hcd程序期間施加到離子的動能取決于離子的初始電荷態(tài)。當(dāng)例如圖4c中展示的不同電荷態(tài)的一組離子同時加速到碰撞氣體中時，碰撞能量可經(jīng)調(diào)整使得導(dǎo)致僅具有大于特定值的電荷態(tài)的離子分段。在當(dāng)前例項中，施加根據(jù)正規(guī)化碰撞能量(nce)值20的碰撞電壓。圖4d與圖4c的比較展示，具有+10和+11電荷態(tài)的泛素離子完全分段，但具有電荷態(tài)+9、+8和+7的離子保持與預(yù)分段譜中基本上相同的相對比例，從而指示這些離子的極少分段或無分段。因此，結(jié)果指示，所施加的正規(guī)化碰撞能量不充分(在此情況下)而不能致使具有小于大致+8的電荷態(tài)的離子的分段。以此方式對正規(guī)化碰撞能量的控制提供對照過分分段的檢查。

實例2.兩個蛋白混合物的質(zhì)譜分析。圖5a、5b、5c、5d、5e和5f說明應(yīng)用ptr和hcd的組合技術(shù)來分析碳酸酐酶和肌紅蛋白的混合物。圖5a為碳酸酐酶和肌紅蛋白成溶液的混合物的ms¹調(diào)查譜。616th處的高峰值為以其它方式非共價附接到肌紅蛋白的血紅素部分的簽名。樣本制備導(dǎo)致血紅素的分離(全肌紅蛋白變成脫輔基肌紅蛋白)。通常觀察血紅素峰值。為了簡化譜，肌紅蛋白+21-電荷態(tài)峰值的預(yù)期位置附近寬度2th的隔離窗口內(nèi)的子離子群體被隔離(圖5b中展示的隔離的質(zhì)譜)，且隔離的原始離子暴露于ptr反應(yīng)劑(無離子停車)持續(xù)30ms。通過此ptr步驟產(chǎn)生的第一代產(chǎn)物離子的質(zhì)譜在圖5c中說明。圖5c中說明的質(zhì)譜的一般形式指示三個不同蛋白質(zhì)電荷態(tài)分布(肌紅蛋白、碳酸酐酶和一個其它)的存在，其中僅肌紅蛋白峰值被標(biāo)記。

圖5d為由ptr產(chǎn)生的離子的質(zhì)譜以及來自圖5b中展示的離子群體的肌紅蛋白的+21電荷態(tài)的離子停車，其中利用ptr反應(yīng)劑離子持續(xù)30毫秒，且使用經(jīng)選擇以防止848.55th(ptr步驟期間從808.10th處的+21峰值形成)處肌紅蛋白的+20峰值的m/z位置處的ptr電荷縮減的波形，繼之以+20離子的隔離。產(chǎn)生于這些步驟的離子基本上由+20電荷態(tài)中的肌紅蛋白的純離子物質(zhì)組成。此隔離的離子物質(zhì)隨后經(jīng)受第二ptr步驟以便產(chǎn)生電荷態(tài)分布，其質(zhì)譜在圖5e中展示。

肌紅蛋白電荷態(tài)分布(圖5e)的離子經(jīng)受hcd分段步驟。獲得所得片段和殘余未分段離子的質(zhì)譜，如圖5f所示。圖5f的質(zhì)譜展示大量的片段由+17到+20電荷態(tài)的離子的接近完整分段形成，且+16電荷態(tài)的離子的相當(dāng)大部分(若非電荷態(tài)+15及更低的肌紅蛋白離子)保持大體上未分段。圖5f中所描繪的所述組片段由購自northwestern大學(xué)的prosight軟件分析以重建肌紅蛋白序列。發(fā)現(xiàn)上文描述的程序(多個ptr步驟繼之以hcd分段)產(chǎn)生總共31個可辨識離子(30y-離子和1b-離子)，其足以明確地重建肌紅蛋白序列。這些結(jié)果比采用僅單一ptr步驟繼之以分段時獲得的結(jié)果優(yōu)良。在此后一情況中，辨識總共僅23個離子。應(yīng)用hcd自身(無先前ptr純化步驟)產(chǎn)生更壞的結(jié)果，僅辨識總共五個片段離子。

實例3.細(xì)菌裂解物中的肌紅蛋白的質(zhì)譜分析。圖6a、6b、6c、6d、6e和6f說明應(yīng)用ptr和hcd的組合技術(shù)來分析細(xì)菌裂解物內(nèi)的肌紅蛋白。通過將少量肌紅蛋白添加到細(xì)菌大腸桿菌的裂解物中來制備樣本。圖6a展示所述樣本的ms¹調(diào)查掃描?？蓺w于圖6a的質(zhì)譜中的肌紅蛋白(非標(biāo)記)的峰值在可歸于細(xì)菌導(dǎo)出的化合物的許多峰值的中間幾乎不可見。此樣本的質(zhì)譜分析期間，原始離子的子群體在808th的m/z值處居中的寬度2th的隔離窗口內(nèi)隔離，所述808th的m/z值為包括電荷態(tài)+21的多質(zhì)子肌紅蛋白分子的離子物質(zhì)的預(yù)期位置。圖6b展示隔離的離子的質(zhì)譜。

圖6c說明在無離子停車的情況下圖6b中描繪的隔離的離子的一部分與ptr反應(yīng)劑反應(yīng)持續(xù)30ms之后獲得的測試質(zhì)譜。在這些反應(yīng)條件下，電荷態(tài)+21的肌紅蛋白物質(zhì)的僅小部分反應(yīng)以便產(chǎn)生具有電荷態(tài)+20、+19、+18、+17、+16、+15、+14、+13和可能其它的縮減電荷態(tài)肌紅蛋白物質(zhì)(由圖6c中的星號指示)。圖6c的質(zhì)譜中的額外線的存在指示其它化合物的離子在原始隔離步驟期間連同肌紅蛋白一起共隔離。因此，為了消除污染物物質(zhì)，圖6b中所描繪的離子群體在應(yīng)用離子停車波形的情況下與ptr反應(yīng)劑反應(yīng)持續(xù)50ms以便在+20電荷態(tài)(848.55th)處終止肌紅蛋白離子的縮減。此m/z值處的離子物質(zhì)隨后隔離，因此產(chǎn)生如圖6d中所描繪的基本上純的肌紅蛋白物質(zhì)。

在其隔離之后，+20電荷態(tài)(圖6d)的經(jīng)純化肌紅蛋白離子物質(zhì)在無離子停車的情況下進(jìn)一步與ptr反應(yīng)劑反應(yīng)持續(xù)1ms以便創(chuàng)建如圖6e中所描繪的電荷態(tài)的分布。此帶電肌紅蛋白離子物質(zhì)的集合隨后由hcd使用正規(guī)化碰撞能量值20分段以便產(chǎn)生圖6f中所描繪的片段譜。除片段之外，圖6f的質(zhì)譜還展現(xiàn)可歸于未分段的完整肌紅蛋白離子的峰值。