本申請是申請日為2012年3月5日，申請?zhí)枮?01280021793.4，發(fā)明名稱為“確定胰腺癌存在的方法、陣列以及用途”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。本發(fā)明涉及用于診斷胰腺癌的方法，以及在該方法中使用的生物標志物和陣列。
背景技術：
：：雖然花費了大量力氣，但胰腺癌(pac)仍然難以預測[1]。盡管pac僅為第10大常見的癌癥，但其在美國是癌癥死亡的第4主要原因[2-4]。實際上，胰腺癌的5年存活率<5％，是所有惡性腫瘤中最低的[2-3]。但是，近期的數(shù)據(jù)已經顯示這種現(xiàn)象可以通過早期檢測來獲得顯著克服，早期檢測是當癌癥還主要在i期，如在早期pac切除之后所顯示的5年存活率為30-60％(≤20mm大小的腫瘤)和甚至>75％(≤10mm大小的腫瘤)的存活率[2-4]。pac的特征在于快速的腫瘤進展、早期轉移、以及對于大部分傳統(tǒng)治療不敏感[1,5]。難以預測主要是由于缺乏有效的早期診斷方法以及在疾病的過程中較晚出現(xiàn)的疾病特異性臨床癥狀。在確診的時刻，腫瘤通常已經達到30-40mm大小并且全部患者中的大部分(52％)已經發(fā)生轉移，26％患者為局部晚期癌癥，僅7％的患者具有局限在胰腺的腫瘤[2,4]。此時，約15％的患者仍可進行手術，但他們的平均存活時間僅為20個月。已經有大量非侵入性的方法用于pac診斷，包括(內窺鏡)超聲波、計算機斷層成像和/或內窺鏡逆行胰膽管造影[1-2,6]。盡管功能強大，但這些方法不是pac特異性的，并且不是針對在腫瘤仍較小且潛在可治愈時的早期診斷而設計的。使該情況變得更為復雜的是使用目前存在的診斷工具難以將pac與良性狀況(諸如慢性胰腺炎)區(qū)分[2]。因此，利用對于pac特異性并且用于早期診斷pac的生物標志物將具有無價的臨床價值。雖然花費了大量力氣，但與pac相關的分子指紋(特別是來自未經加工、未分離的血清和血漿)仍需要被破譯[2,7-9]。在到目前為止已經被提及的大量單生物標志物(包括crp、ca242、gdf-15、結合珠蛋白、m2-丙酮酸激酶、血清淀粉樣蛋白a、igfbp-1)中，還沒有任何一個被證明臨床效果優(yōu)于ca19-9[2,8-10]。ca19-9的使用仍然顯著地受到發(fā)現(xiàn)的如下的事實所阻礙：i)在非-惡性狀況(例如胰腺炎和急性膽管炎)以及其他腸胃癌(例如胃癌和大腸癌)中均有升高，ii)針對早期pac缺乏敏感性，以及iii)在約10％的人群中是缺失的[2,8-10]。當篩查pac時，ca19-9僅獲得了中等的靈敏性(范圍為69％～98％)和特異性(46％～98％)[2,9-11]。針對上述背景，本發(fā)明人在wo2008/117067中開發(fā)了進行癌癥的預后診斷的蛋白質組學方法，由此鑒定出用于檢測胰腺癌和用于預測存活率的第一組血清生物標志物。技術實現(xiàn)要素：受到近期研究(其中我們指出了親和蛋白質組學[12-13]可以用作pac血清生物標志物簽名(biomarkersignatures)的查明候選物(pin-pointcandidate)[14])的啟發(fā)，我們還進一步解碼了pac的血清蛋白質組。在本研究中，我們第一次預先驗證了用于pac診斷的復合血清生物標志物簽名，其表明診斷信息可以從未加工血液樣品中提取，并表現(xiàn)出高度的特異性和靈敏度。這提供了改善的pac診斷以及從而提高了預測，帶來了顯著增加的臨床價值，以及向相關的、復雜的疾病生物學射出了進一步的光芒。由此，本發(fā)明的第一方面提供用于檢測個體中胰腺癌存在的方法，該方法包括以下步驟或由以下步驟構成：a)提供來自個體的待檢測樣品；b)通過檢測一種或多種生物標志物在檢測樣品中的表達來確定檢測樣品的生物標志物簽名，該一種或多種生物標志物選自表iii中定義的組；其中，選自表iii中定義的組的一種或多種生物標志物在檢測樣品中的表達是罹患胰腺癌的個體的指示?！按龣z測樣品”、“檢測樣品”或“對照樣品”，適當?shù)匕▉碜源龣z測個體或對照個體的組織，流體蛋白質組和/或表達性樣品(expressomesample)。“表達(expression)”表示基因產物諸如mrna或蛋白質的水平或量。檢測和/或測定蛋白質和/或核酸的濃度的方法對于本領域技術人員而言是熟知的，參見例如sambrookandrussell,2001,coldspringharborlaboratorypress?！吧飿酥疚铩北硎咀匀淮嬖诘纳锓肿踊蚱浣M分或其片段，對其的測量可提供用于預測胰腺癌的信息。例如，生物標志物可以為自然存在的蛋白質或碳水化合物部分，或其抗原組分或其片段。在一個實施方式中，該方法包括步驟(a)和(b)以及下述步驟，或由步驟(a)和(b)，以及下述步驟構成：c)提供來自未患胰腺癌的個體的對照樣品(即陰性對照)；d)通過檢測在步驟(b)中檢測的一種或多種生物標志物在對照樣品中的表達來確定對照樣品的生物標志物簽名；其中，胰腺癌存在通過如下事件來鑒定，該事件為在步驟(b)中檢測的一種或多種生物標志物在檢測樣品中的表達不同于步驟(d)中檢測的一種或多種生物標志物在對照樣品中的表達。在另外的實施方式中，該方法包括步驟(a)、(b)、(c)和(d)，以及如下額外步驟，或者該方法由步驟(a)、(b)、(c)和(d)，以及如下額外步驟構成：e)提供來自患胰腺癌的個體的對照樣品(即陽性對照)；f)通過檢測在步驟(b)中檢測的一種或多種生物標志物在對照樣品中的表達來確定對照樣品的生物標志物簽名；其中，胰腺癌存在通過如下事件來鑒定，該事件為在步驟(b)中檢測的一種或多種生物標志物在檢測樣品中的表達相當于步驟(f)中檢測的一種或多種生物標志物在對照樣品中的表達?！跋喈斢谠趯φ諛悠分械谋磉_”包括，一種或多種生物標志物在待測樣品中的表達與其在陽性對照樣品中的表達相同或相似。優(yōu)選一種或多種生物標志物在待測樣品中的表達與其在陽性對照樣品中的表達相同。生物標志物的差異化表達(上調或下調)，或表達的缺乏可以通過本領域技術人員已知的任何合適的方式來確定。差異化表達通過至少小于0.05的p值(p＝<0.05)來確定，例如至少<0.04、<0.03、<0.02、<0.01、<0.009、<0.005、<0.001、<0.0001、<0.00001或至少<0.000001。優(yōu)選，使用支持向量機(svm)來確定差異化表達。優(yōu)選，svm為如下所述的svm。最優(yōu)選，svm是下述表v(a)所述的svm。本領域技術人員應當理解差異化表達可與單個生物標志物相關或與組合考慮的多個生物標志物(即作為生物標志物簽名)相關。因此，p值可以與單個生物標志物關聯(lián)或與一組生物標志物關聯(lián)。實際上，當單獨考慮時具有p值大于0.05差異化表達的蛋白質，在將它們的表達水平與一種或多種其他生物標志物結合考慮時，其作為根據(jù)本發(fā)明的生物標志物可仍然是有用的。在一個實施方式中，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(a)中列出的一種或多種生物標志物的表達，例如表iv(a)中列出的至少兩個生物標志物的表達。如在所附的實施例中所例證的，在血、血清或血漿檢測樣品中的特定蛋白質的表達可以是個體中胰腺癌的指示。例如，在單個檢測樣品中特定血清蛋白質的相對表達可以是個體中胰腺癌存在的指示。優(yōu)選地，個體為人類。但是，被檢測的個體可以是任何哺乳動物，諸如馴養(yǎng)哺乳動物(優(yōu)選具有農業(yè)或商業(yè)重要性的動物，包括馬、豬、牛、羊、狗和貓)。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測白細胞介素-7(il-7)和/或整合素α-10的表達，例如，檢測白細胞介素-7的表達，檢測整合素α-10的表達，或檢測白細胞介素-7和整合素α-10的表達。最優(yōu)選的，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(a)中列出的每個生物標志物的表達。在一個實施方式中，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(b)中列出的1或多種生物標志物的表達，例如，檢測表iv(b)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18種生物標志物的表達。因此，步驟(b)優(yōu)選包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(b)中列出的全部生物標志物的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(c)中列出的1或多種生物標志物的表達，例如，檢測在表iv(c)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33種生物標志物的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(c)中列出的全部生物標志物的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv中定義的全部生物標志物在檢測樣品中的表達。在一個實施方式中，該方法用于區(qū)分胰腺癌(pac)和另外的疾病狀態(tài)。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(a)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(a)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)還包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(b)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(b)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24種生物標志物在檢測樣品中的表達。還優(yōu)選步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(c)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(c)中列出的至少2、3、4或5種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(d)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(d)中列出的至少2或3種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(f)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(f)中列出的至少2、3、4、5或6種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表v(a)、表v(b)、表v(c)、表v(d)和/或表v(f)中列出的全部生物標志物在檢測樣品中的表達?！皡^(qū)分胰腺癌(pac)和另外的疾病狀態(tài)”包括區(qū)分pac和任何其他狀況，包括健康狀態(tài)。在一個實施方式中，其他疾病狀態(tài)或狀況為慢性胰腺炎(chronicpancreatitis，chp)、急性炎癥性胰腺炎(acuteinflammatorypancreatitis，aip)和/或正常，例如其他疾病狀態(tài)或狀況可以是單獨的慢性胰腺炎；單獨的急性炎癥性胰腺炎；慢性胰腺炎和急性炎癥性胰腺炎；慢性胰腺炎和正常；急性炎癥性胰腺炎和正常；或者慢性胰腺炎、急性炎癥性胰腺炎和正常。當涉及“正?！奔膊顟B(tài)時，我們包括未患慢性胰腺炎(chp)或急性炎癥性胰腺炎(aip)的個體。優(yōu)選未患任何胰腺疾病或病況的個體。最優(yōu)選，個體為健康的個體，即他們未患任何疾病或病況的。在另外的實施方案中，該方法用于區(qū)分胰腺癌和慢性胰腺炎(chp)。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(a)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(a)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種生物標志物在檢測樣品中的表達。步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(c)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(c)中列出的至少2、3、4或5種生物標志物在檢測樣品中的表達。步驟(b)可包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表v(a)和/或表v(c)中列出的全部生物標志物在檢測樣品中的表達。在另外的/可選的實施方式中，該方法用于區(qū)分胰腺癌和急性炎癥性胰腺炎(aip)，以及步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(a)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(a)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(b)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(b)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24種生物標志物在檢測樣品中的表達。步驟(b)可包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(c)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(c)中列出的至少2、3、4或5種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(e)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(f)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(f)中列出的至少2、3、4、5或6種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(h)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(h)中列出的至少2或3種生物標志物在檢測樣品中的表達。因此，步驟(b)優(yōu)選包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測表v(a)、表v(b)、表v(c)、表v(e)、表v(f)和/或表iv(h)中列出的全部生物標志物在檢測樣品中的表達。在一個實施方式中，該方法用于區(qū)分胰腺癌和正常個體(n)。對于“正?！奔膊顟B(tài)的定義參見上文。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(a)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(a)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(b)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(b)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(d)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(d)中列出的至少2或3種生物標志物在檢測樣品中的表達。優(yōu)選地，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(e)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達。還優(yōu)選步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(g)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(g)中列出的至少2或3種生物標志物在檢測樣品中的表達。因此，步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測表v(a)、表v(b)、表v(d)、表v(e)和/或表iv(g)中列出的全部生物標志物在檢測樣品中的表達。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測il-3的表達或由檢測il-3的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測整合素α-10的表達或由檢測整合素α-10的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測粘蛋白-1的表達或由檢測粘蛋白-1的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測c1s的表達或由檢測c1s的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測mcp-3的表達或由檢測mcp-3的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測血管抑素結合蛋白(angiomotin)的表達或由檢測血管抑素結合蛋白的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測btk的表達或由檢測btk的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測c1q的表達或由檢測c1q的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測cd40配體的表達或由檢測cd40配體的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測gm-csf的表達或由檢測gm-csf的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測igm的表達或由檢測igm的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-11的表達或由檢測il-11的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-16的表達或由檢測il-16的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-1-ra的表達或由檢測il-1-ra的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-1α的表達或由檢測il-1α的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測il-1β的表達或由檢測il-1β的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-2的表達或由檢測il-2的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-7的表達或由檢測il-7的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-9的表達或由檢測il-9的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測inf-γ的表達或由檢測inf-γ的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測整合素α-11的表達或由檢測整合素α-11的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測jak3的表達或由檢測jak3的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測瘦素的表達或由檢測瘦素的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測lewisy的表達或由檢測lewisy的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測mcp-4的表達或由檢測mcp-4的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測組織蛋白酶原(procathepsin)w的表達或由檢測組織蛋白酶原w的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測備解素(properdin)的表達或由檢測備解素的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測psa的表達或由檢測psa的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測rantes的表達或由檢測rantes的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測唾液酸路易斯抗原x(sialyllewisx)的表達或由檢測唾液酸路易斯抗原x的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測tm肽的表達或由檢測tm肽的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測tnf-α的表達或由檢測tnf-α的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測c4的表達或由檢測c4的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測β-半乳糖苷酶的表達或由檢測β-半乳糖苷酶的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-12的表達或由檢測il-12的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測tgf-β1的表達或由檢測tgf-β1的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測vegf的表達或由檢測vegf的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-8的表達或由檢測il-8的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測c3的表達或由檢測c3的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測ifn-γ的表達或由檢測ifn-γ的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測il-10的表達或由檢測il-10的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-13的表達或由檢測il-13的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-18的表達或由檢測il-18的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-6的表達或由檢測il-6的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測lewisx的表達或由檢測lewisx的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測嗜酸細胞活化趨化因子(eotaxin)的表達或由檢測嗜酸細胞活化趨化因子的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測c1酯酶抑制劑的表達或由檢測c1酯酶抑制劑的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測mcp-1的表達或由檢測mcp-1的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測tnf-β的表達或由檢測tnf-β的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測glp-1的表達或由檢測glp-1的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)包括檢測il-5的表達或由檢測il-5的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測il-4的表達或由檢測il-4的表達構成。在還另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測b因子的表達或由檢測b因子的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測c5的表達或由檢測c5的表達構成。在另外的實施方式中，步驟(b)包括檢測cd40的表達或由檢測cd40的表達構成。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-3的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測整合素α-10的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測粘蛋白-1的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測c1s的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測mcp-3的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測血管抑素結合蛋白的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測btk的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測c1q的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測cd40配體的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測gm-csf的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測igm的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-11的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-16的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-1-ra的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-1α的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-1β的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-2的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-7的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-9的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測inf-γ的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測整合素α-11的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測jak3的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測瘦素的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測lewisy的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測mcp-4的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測組織蛋白酶原w的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測備解素的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測psa的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測rantes的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測唾液酸路易斯抗原x的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測tm肽的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測tnf-α的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測c4的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測β-半乳糖苷酶的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-12的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測tgf-β1的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測vegf的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-8的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測c3的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測ifn-γ的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-10的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-13的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-18的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-6的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測lewisx的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測嗜酸細胞活化趨化因子的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測c1酯酶抑制劑的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測mcp-1的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測tnf-β的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測glp-1的表達。在一個實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-5的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測il-4的表達。在還另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測b因子的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測c5的表達。在另外的實施方式中，步驟(b)不包括檢測cd40的表達。“tm肽”表示來源于10tm蛋白質的肽，針對該肽，下述seqidno:1所示的scfv抗體具有特異性(其中，cdr序列通過黑體且斜體字母表示)：因此，可用該scfv或任何抗體或其抗原結合片段，其可以與該scfv競爭結合至10tm蛋白質。例如，該抗體或其抗原結合片段可以包括與seqidno:1所示的相同的cdr。本領域技術人員應當理解這樣的抗體可以通過用于純化目的的親和標簽(例如，在c-末端)來制備。例如可使用下述seqidno:2的親和標簽。dykdhdgdykdhdidykddddkaaahhhhhh[seqidno:2]在一個實施方式中，胰腺癌存在通過下述事件來鑒定：下述物質在檢測樣品中的表達與陰性對照(一個或多個)相比被上調和/或相當于陽性對照(一個或多個)的表達，所述物質為：il-3、整合素α-10、粘蛋白-1、c1s、glp-1r、mcp-3、血管抑素結合蛋白、btk、cd40配體、gm-csf、igm、il-11、il-16、il-1-ra、il-1α、il-1β、il-2、il-7、il-9、inf-γ、整合素α-11、jak3、瘦素、lewisy、mcp-4、組織蛋白酶原w、psa、rantes、唾液酸路易斯抗原x、tm肽、tnf-α、c4、β-半乳糖苷酶、il-12、tgf-β1、vegf、il-8、c3、ifn-γ、il-10、il-13、il-18、il-6、lewisx、嗜酸細胞活化趨化因子、c1酯酶抑制劑、mcp-1、tnf-β、glp-1、il-5、il-4、b因子、c5和/或cd40。在另外的實施方式中，胰腺癌存在通過下述事件來鑒定：c1q和/或備解素在檢測樣品中的表達與陰性對照(一個或多個)相比被下調和/或相當于陽性對照(一個或多個)的表達。通常，診斷在具有至少為0.55的rocauc時進行，例如具有至少0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99的rocauc或1.00的rocauc。優(yōu)選，診斷在具有至少0.85的rocauc時進行，以及最優(yōu)選rocauc為1。通常，使用支持向量機(svm)，例如可購自http://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html的那些(例如，e10711.5-24)來進行診斷。但是也可以使用任何其他合適的手段。支持向量機(svm)是用于分類和回歸的一組相關的經監(jiān)督的學習方法。給定一組訓練實例，每一個被標記為屬于兩類中的一類，svm訓練算法構建了用于預測新的實例是否落入一類或另一類的模型。直觀地，svm模型是如空間中指出的實例的代表，被繪制成使得不同分類的實例被盡量寬的明顯的間隙分開。然后，新的實例被繪制到相同的空間中并基于它們落入間隙的那一側來預測其屬于哪一類。更正式的是，支持向量機在一定高度或無窮維空間構建超平面或一組超平面，其可被用于分類、回歸或其他任務。直觀地，良好的分離通過與任何類別的最近訓練數(shù)據(jù)點具有最大距離(被稱為功能邊緣)來實現(xiàn)，因為通常邊緣越大分類機的泛化錯誤約低。關于svm的更多信息，可以參考例如burges,1998,dataminingandknowledgediscovery,2:121–167。在本發(fā)明的一個實施方式中，在使用來自已知疾病狀態(tài)的個體(例如，已知個體具有胰腺癌，已知個體具有急性炎癥性胰腺炎，已知個體具有慢性胰腺炎或已知個體是健康的)的生物標志物概貌進行本發(fā)明的方法之前，對svm進行‘訓練’。通過運行這樣的訓練樣品，svm能夠學習什么樣的生物標志物概貌與胰腺癌相關。一旦訓練過程結束，然后svm能夠確認是否已檢測的樣品的生物標志物是來自具有胰腺癌的個體。但是，通過在svm中用必須的訓練參數(shù)進行預編程可以省略該訓練步驟。例如，可以根據(jù)使用在表v中詳細描述的svm算法，基于在表iii或表iv中列出的任意或全部生物標志物的測定值，根據(jù)已知的svm參數(shù)進行診斷。本領域技術人員應當理解通過利用適當選擇的數(shù)據(jù)(即，來自已知具有胰腺癌狀態(tài)的個體的生物標志物的測定值)來訓練svm機，可以針對表iii或表iv中列出的生物標志物的任何組合來確定適當?shù)膕vm參數(shù)。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法具有至少60％的準確度，例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的準確度。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法具有至少60％的靈敏度，例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的靈敏度。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法具有至少60％的特異性，例如61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的特異性?！皽蚀_度”表示方法的正確結果的比例，“靈敏度”表示被正確分類為陽性的所有pac陽性樣品的比例，以及“特異性”表示被正確分類為陰性的所有pac陰性樣品的比例。在一個實施方式中，未患胰腺癌的個體未患胰腺癌(pac)、慢性胰腺炎(chp)或急性炎癥性胰腺炎(aip)。更優(yōu)選地，健康個體未患任何胰腺疾病或病況。甚至更優(yōu)選地，未患胰腺癌的個體未患任何疾病或病況。最優(yōu)選的，未患胰腺癌的個體是健康個體。“健康個體”包括被本領域技術人員認為身體強壯以及沒有身體疾病的個體。但在另外的實施方式中，未患胰腺癌的個體是患慢性胰腺炎的。在仍另外的實施方式中，未患胰腺癌的個體是患急性炎癥性胰腺炎的。如上所述本發(fā)明的方法用于檢測個體中胰腺癌存在。在一個實施方式中，胰腺癌選自下組：腺癌(adenocarcinoma)、腺鱗癌(adenosquamouscarcinoma)、印戒細胞癌(signetringcellcarcinoma)、肝樣癌(hepatoidcarcinoma)、膠樣癌(colloidcarcinoma)、未分化癌和伴有破骨細胞樣巨細胞(osteoclast-likegiantcells)的未分化癌。優(yōu)選的胰腺癌是胰腺腺癌(pancreaticadenocarcinoma)。更優(yōu)選的胰腺癌是胰腺導管腺癌(pancreaticductaladenocarcinoma)，也已知為胰腺外分泌腫瘤(exocrinepancreaticcancer)。在另外的實施方式中，使用能夠與一種或多種生物標志物結合的第一結合試劑來進行步驟(b)、(d)和/或步驟(f)。本領域技術人員應當理解第一結合試劑可包括下述物質或由下述物質構成：針對蛋白質生物標志物中的一種具有特異性的單一種類或大量不同種類，每個對于不同的蛋白質生物標志物具有特異性。合適的結合試劑(也被稱為結合分子)可以選自如下所述的基于它們結合給定的基元(motif)的能力的庫。至少一種結合試劑，以及更通常地全部類型可包括下述物質或由下述物質構成：抗體或其抗原結合片段，或其變體?？贵w的制備和利用的方法在本領域中是已知的，例如參見antibodies:alaboratorymanual,1988,harlow&lane,coldspringharborpress,isbn-13:978-0879693145,usingantibodies:alaboratorymanual,1998,harlow&lane,coldspringharborpress,isbn-13:978-0879695446和makingandusingantibodies:apracticalhandbook,2006,howard&kaser,crcpress,isbn-13:978-0849335280(通過參考將其公開內容并入本文)。因此，片段可以包括一個或多個重鏈可變區(qū)(vh)或輕鏈可變區(qū)(vl)。例如，術語抗體片段包括fab-類分子(better等人(1988)science240,1041)；fv分子(skerra等人(1988)science240,1038)；單鏈fv(scfv)分子，其中vh和vl伴侶區(qū)域(partnerdomain)通過柔性的寡肽連接(bird等人(1988)science242,423；huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85,5879)以及包括分離的v區(qū)域的單域抗體(dabs)(ward等人(1989)nature341,544)。術語“抗體變體”包括任何合成抗體、重組抗體或抗體雜交物，例如但不限于：通過免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈可變區(qū)和/或恒定區(qū)的噬菌體展示制備的單鏈抗體分子，或在本領域人員已知的免疫測定方法中能夠與抗原結合的其他免疫相互作用分子?？梢栽趙inter&milstein(1991)nature349,293-299中找到涉及包括它們的特異性結合位點的抗體片段合成技術的一般性綜述。分子庫例如抗體庫(clackson等人，1991,nature352,624-628；marks等人，1991,jmolbiol222(3):581-97)、肽庫(smith,1985,science228(4705):1315-7)、表達的cdna庫(santi等人(2000)jmolbiol296(2):497-508)、除抗體結構之外的其他支架例如親合體(affibody)的庫(gunneriusson等人，1999,applenvironmicrobiol65(9):4134-40)或適體(aptamer)庫(kenan等人，1999,methodsmolbiol118,217-31)可以用作從中選擇用于本發(fā)明方法的對于給定的基礎片段具有特異性的結合分子的源。分子庫可以在原核生物(clackson等人，1991，同上；marks等人，1991，同上)或真核生物細胞(kieke等人，1999,procnatlacadsciusa,96(10):5651-6)中體內表達，或可以不涉及細胞體外表達(hanes&pluckthun,1997,procnatlacadsciusa94(10):4937-42；he&taussig,1997,nucleicacidsres25(24):5132-4；nemoto等人，1997,febslet,414(2):405-8)。在使用基于蛋白質的庫的情況下，通常編碼潛在結合分子庫的基因被包裝到病毒中并且在病毒的表面展示潛在結合分子(clacksonetal,1991，同上；marks等人，1991，同上；smith,1985，同上)。目前最常見的這樣的系統(tǒng)是絲狀噬菌體在它們的表面展示抗體片段，被表達的抗體片段融合至噬菌體的次要衣殼蛋白(clackson等人，1991，同上；marks等人，1991，同上)。但是，還已經使用了利用其他病毒(ep39578)、細菌(gunneriusson等人，1999，同上；daugherty等人，1998,proteineng11(9):825-32；daugherty等人，1999,proteineng12(7):613-21)、以及酵母(shusta等人，1999,jmolbiol292(5):949-56)展示的其他系統(tǒng)。另外，還開發(fā)了利用多肽產物連接至其編碼mrna的展示系統(tǒng)，稱為核糖體展示系統(tǒng)(hanes&pluckthun,1997，同上；he&taussig,1997，同上；nemoto等人，1997，同上)，或任選的將多肽產物連接至編碼dna(參見美國專利no.5,856,090和wo98/37186)的展示系統(tǒng)。當從庫中選擇了潛在結合分子時，通常使用具有給定的基元的一個或幾個篩選肽(selectorpeptide)?？梢允褂锰峁┙Y構、降低肽的靈活性的氨基酸殘基或能夠與結合分子相互作用的帶電、極性的或疏水側鏈用于設計篩選肽的基元。例如：(i)脯氨酸由于其側鏈結合至α碳以及氮兩者而穩(wěn)定肽結構；(ii)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有芳香側鏈并且是非常疏水的，而亮氨酸和異亮氨酸具有脂肪側鏈并且也是非常疏水的；(iii)賴氨酸、精氨酸和組氨酸具有堿性側鏈并且在中性ph下會帶正電，而天冬氨酸和谷氨酸具有酸性側鏈并且在中性ph下會帶負電；(iv)天冬酰胺和谷氨酰胺在中性ph時為中性的，但它們含有可以形成氫鍵的酰胺鍵；(v)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸側鏈含有羥基，其可以形成氫鍵。通常，結合試劑的選擇可以涉及利用陣列技術和系統(tǒng)來根據(jù)結合分子的類型分析結合點。在一個實施方式中，第一結合試劑(一個或多個)被固定在表面上(例如，在多孔板或陣列上)?？贵w重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)參與抗原識別，這是由早期的蛋白酶消化實驗首先認識到的事實。后來在嚙齒類抗體的“人源化”工作中也得到確認。嚙齒類來源的可變區(qū)可以融合至人類來源的恒定區(qū)域，使得得到的抗體保留對嚙齒類親本抗體的抗原特異性(morrison等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa81,6851-6855)。關于抗原特異性由多個可變區(qū)賦予且其獨立于恒定區(qū)的事實是從多個涉及抗體片段的細菌表達的實驗知曉的，這些實驗都包括一個或多個可變區(qū)。這些分子包括fab-類分子(better等人，(1988)science240,1041)；fv分子(skerra等人(1988)science240,1038)；單鏈fv(scfv)分子，其中通過柔性的寡肽連接vh和vl伴侶區(qū)域(bird等人(1988)science242,423；huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85,5879)以及包括分離的v區(qū)域的單域抗體(dabs)(ward等人(1989)nature341,544)。可以在winter&milstein(1991)nature349,293-299中找到涉及保留它們的特異性結合位點的抗體片段的合成的技術的一般性綜述。“scfv分子”是指如下分子，其中vh和vl伴侶區(qū)域通過柔性的寡肽連接。使用抗體片段而非整個抗體的優(yōu)點是數(shù)倍的。片段的較小尺寸可導致改善的藥理性質，例如更好的固體組織滲透性。除去了整個抗體的效應功能，例如補體結合。fab、fv、scfv和dab抗體片段可以全部在大腸桿菌中表達并由大腸桿菌中分泌，從而使得容易進行所述片段的大量生產。整個抗體以及f(ab')2片段為“二價的”。“二價的”是指上述抗體和f(ab')2片段具有兩個抗原結合位點。相對地，fab、fv、scfv和dab片段是單價的，僅具有一個抗原結合位點?？贵w可以是單克隆或多克隆的。可以通過已知的技術來制備合適的單克隆抗體，例如在“monoclonalantibodies:amanualoftechniques”,hzola(crcpress,1988)和“monoclonalhybridomaantibodies:techniquesandapplications”,jgrhurrell(crcpress,1982)中描述的那些，在此通過參考將它們并入本文。在一個實施方式中，第一結合試劑被固定在表面上(例如在多孔板或陣列上)。抗體重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)參與抗原識別，這是由早期的蛋白酶消化實驗首先認識到的事實。后來在嚙齒類抗體的“人源化”工作中也得到確認。嚙齒類來源的可變區(qū)可以融合至人類來源的恒定區(qū)域，使得得到的抗體保留對嚙齒類親本抗體的抗原特異性(morrison等人(1984)proc.natl.acad.sci.usa81,6851-6855)。關于抗原特異性由多個可變區(qū)賦予且其獨立于恒定區(qū)的事實是從多個涉及抗體片段的細菌表達的實驗知曉的，這些實驗都包括一個或多個可變區(qū)。這些分子包括fab-類分子(better等人，(1988)science240,1041)；fv分子(skerra等人(1988)science240,1038)；單鏈fv(scfv)分子，其中通過柔性的寡肽連接vh和vl伴侶區(qū)域(bird等人(1988)science242,423；huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85,5879)以及包括分離的v區(qū)域的單域抗體(dabs)(ward等人(1989)nature341,544)?？梢栽趙inter&milstein(1991)nature349,293-299中找到涉及保留它們的特異性結合位點的抗體片段的合成的技術的一般性綜述?！皊cfv分子”是指如下分子，其中vh和vl伴侶區(qū)域通過柔性的寡肽連接。使用抗體片段而非整個抗體的優(yōu)點是數(shù)倍的。片段的較小尺寸可導致改善的藥理性質，例如更好的固體組織滲透性。除去了整個抗體的效應功能，例如補體結合。fab、fv、scfv和dab抗體片段可以全部在大腸桿菌中表達并由大腸桿菌中分泌，從而使得容易進行所述片段的大量生產。整個抗體以及f(ab')2片段為“二價的”?！岸r的”是指上述抗體和f(ab')2片段具有兩個抗原結合位點。相對地，fab、fv、scfv和dab片段是單價的，僅具有一個抗原結合位點?？贵w可以是單克隆或多克隆的?？梢酝ㄟ^已知的技術來制備合適的單克隆抗體，例如在“monoclonalantibodies:amanualoftechniques”,hzola(crcpress,1988)和“monoclonalhybridomaantibodies:techniquesandapplications”,jgrhurrell(crcpress,1982)中描述的那些，在此通過參考將它們并入本文。因此，第一結合試劑可以包括抗體或其抗原結合片段或由抗體或其抗原結合片段構成。優(yōu)選抗體或其抗原結合片段是重組抗體或其抗原結合片段?？贵w或其抗原結合片段可以選自下組：scfv、fab、和免疫球蛋白分子的結合域。優(yōu)選地，第一結合試劑被固定在表面上?？梢杂每蓹z測部分標記檢測樣品中的一種或多種生物標志物?！翱蓹z測部分(detectablemoiety)”包括如下含義，該部分可以被檢測以及可以確定該部分的相對量和/或位置(例如，在陣列上的位置)。本領域技術人員熟知合適的可檢測部分。因此，該可檢測部分可以是當暴露于特定的條件下時，可以被檢測的熒光和/或發(fā)光和/或化學發(fā)光部分。例如，熒光部分可需要被暴露于在特定波長和強度的放射(例如光)下以引起熒光部分的激發(fā)，從而使得其發(fā)射出可以被檢測的在特定波長的可檢測的熒光。另外的，可檢測部分可以是酶，該酶能夠將(優(yōu)選檢測不到的)基質變換成可視的和/或可檢測的可檢測產物。合適的酶的實例可以參考例如elisa分析在下文中詳細討論。另外的，可檢測部分可以是用于成像的放射性原子。合適的放射性原子包括用于顯像研究的99mtc和123i。其他容易的可檢測部分包括，例如用于磁共振成像(mri)的自旋標志物，諸如123iagain、131i、111in、19f、13c、15n、17o、釓、錳或鐵。顯然，待檢測的試劑(例如，在本文中描述的檢測樣品和/或對照樣品中的一種或多種生物標志物和/或用于檢測選擇的蛋白質的抗體分子)必須具有足夠的合適的原子同位素以使得可以容易地檢測可檢測部分?？梢园凑找阎姆绞綄⒎派?或其他標記組合到本發(fā)明的試劑(即，本發(fā)明方法的樣品中存在的蛋白質和/或本發(fā)明的結合試劑)中。例如，如果結合部分(bindingpoiety)是多肽，其可以通過生物合成或可以通過使用合適的氨基酸前體(涉及，例如用氟-19代替氫)通過化學氨基酸合成來合成?？梢岳缤ㄟ^半胱氨酸殘基將標志，諸如99mtc、123i、186rh、188rh和111in附著到結合部分中?？梢酝ㄟ^賴氨酸附著釔-90。可以使用iodogen方法(fraker等人(1978)biochem.biophys.res.comm.80,49-57)來結合123i。參考文獻(“monoclonalantibodiesinimmunoscintigraphy”,j-fchatal,crcpress,1989)詳細地描述了其他方法。用于將其他可檢測部分(諸如酶、熒光、發(fā)光、化學發(fā)光或放射性部分)偶聯(lián)至蛋白質的方法是本領域所熟知的。優(yōu)選的，用可檢測部分標記對照樣品(一個或多個)中的一種或多種生物標志物?？蓹z測部分可以選自下組：熒光部分；發(fā)光部分(luminescentmoiety)；化學發(fā)光部分(chemiluminescentmoiety)；放射性部分；酶部分。但是，優(yōu)選可檢測部分為生物素。在另外的實施方式中，使用包括能夠與一種或多種生物標志物結合的第二結合試劑的分析進行步驟(b)、(d)和/或步驟(f)，該第二結合試劑包括可檢測部分。優(yōu)選地，第二結合試劑包括或由以下物質構成：抗體或其抗原結合片段。優(yōu)選地，抗體或其抗原結合片段為重組抗體或其抗原結合片段。最優(yōu)選地，抗體或其抗原結合片段選自下組：scfv、fab、以及免疫球蛋白分子的結合域。在一個實施方式中，可檢測部分選自下組：熒光部分；發(fā)光部分；化學發(fā)光部分；放射性部分和酶部分。優(yōu)選地，可檢測部分為熒光部分(例如，alexafluor染料如alexa647)。在一個實施方式中，本發(fā)明第一方面的方法包括elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定)或由elisa構成。用于檢測血清或血漿蛋白質的優(yōu)選的分析包括酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、放射免疫分析(ria)、免疫放射分析(irma)以及免疫酶分析(iema)，包括使用單克隆和/或多克隆抗體的三明治分析。david等人在美國專利no.4,376,110和no.4,486,530中描述了示例性的三明治分析，通過參考并入本文。在片(slide)上的細胞抗體染色可以用于在細胞學實驗室診斷測試中已知的方法中，如本領域技術人員所述熟知的。通常，該分析為elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定)，其通常涉及使用產生有色的反應產物的酶，通常在固相分析中。酶諸如辣根過氧化物酶和磷酸酶已經被廣泛使用。放大磷酸酶反應的方式是使用nadp作為基質產生nad，其此時將作為用于第二酶系統(tǒng)的輔酶。來自大腸桿菌的焦磷酸酶提供了良好的偶聯(lián)物(conjugate)，因為該酶不存在于組織中，其是穩(wěn)定的并且提供良好的反應顏色。還可以使用基于酶諸如熒光素酶的化學-發(fā)光系統(tǒng)。本領域技術人員熟知elisa方法，例如參見theelisaguidebook(methodsinmolecularbiology),2000,crowther,humanapress,isbn-13:978-0896037281(通過參考將其公開內容并入)。通常使用與維生素生物素的結合，因為生物素可以通過其與酶連接的抗生素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白(生物素以大的特異性和親和性與其結合)的反應容易地被檢測。但是，備選地，使用陣列進行步驟(b)、(d)和/或步驟(f)。陣列本身是本領域所熟知的。通常它們是由具有分開的間距(即離散的)區(qū)域(“點”)的線性的或二維結構形成的，每個均具有有限的面積并形成在固體支撐體的表面上。陣列還可以是微珠結構的，其中每個微珠可以通過分子密碼或顏色密碼識別，或在連續(xù)流體中被識別。當樣品通過一系列點(每個點從溶液中吸附分子類型)來順序地進行分析。固體支撐物通常為玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固體支撐體可以為管、珠子、盤、硅芯片、微孔板、聚偏氟乙烯(pvdf)膜、硝基纖維素膜、尼龍膜、其他多空膜、非多空膜(例如，塑料、聚合物、有機玻璃、硅等)、大量聚合物針(polymericpin)、或大量微孔板、或適合用于固定蛋白質、多核苷酸和其他合適的分子和/或進行免疫分析的任何其他表面形式。結合方法是本領域所熟知的并且通常包括交聯(lián)共價結合或物理吸附蛋白質分子、多核苷酸或等至固體支撐體。通過使用熟知的技術，例如接觸式或非接觸式印刷、掩膜或光刻，可以確定每個點的位置。其綜述參見jenkins,r.e.,pennington,s.r.(2001,proteomics,2,13-29)和lal等人(2002,drugdiscovtoday15；7(18suppl):s143-9)。通常陣列為微陣列?！拔㈥嚵小笔侵溉缦潞x：具有至少約100/cm2，優(yōu)選至少約1000/cm2離散區(qū)域密度的區(qū)域的陣列。微陣列中的區(qū)域具有通常的維度，例如直徑在約10～250μm的范圍，并通過大致相同的距離與陣列中的其他區(qū)域分開。陣列還可以是宏陣列(macroarray)或納米陣列。一旦適合的結合分子(如上所述)被鑒定和分離出，本領域技術人員可以使用分子生物學領域中熟知的方法來制造陣列。因此，陣列可以是基于珠的陣列或基于表面的陣列。優(yōu)選地，陣列選自下組：宏陣列、微陣列和納米陣列。在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法包括：(i)利用生物素標記樣品中存在的生物標志物；(ii)使生物素-標記的蛋白質與陣列接觸，該陣列包括固定在其表面上的離散區(qū)域的大量scfv，該scfv對于表iii中的一種或多種蛋白質具有特異性；(iii)使已固定的scfv與包括熒光染料的鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)物接觸；以及(iv)檢測在陣列表面上的離散區(qū)域的染料存在，其中陣列表面上的染料的出現(xiàn)是來自表iiii的生物標志物在樣品中表達的指示。在備選的實施方式中，步驟(b)、(d)和/或(f)包括檢測編碼一種或多種生物標志物的核酸分子的表達。優(yōu)選核酸分子為cdna分子或mrna分子。最優(yōu)選核酸分子為mrna分子。因此，在步驟(b)、(d)和/或(f)中檢測一種或多種生物標志物的表達可使用選自下組的方法進行，該組由southern雜交、northern雜交、聚合酶鏈式反應(pcr)、反轉錄pcr(rt-pcr)、定量實時pcr(qrt-pcr)、納米陣列、微陣列、宏陣列、放射自顯影和原位雜交構成。優(yōu)選地，使用dna微陣列確定步驟(b)中一種或多種生物標志物(一個或多個)的表達。在一個實施方式中，在步驟(b)、(d)和/或(f)中檢測一種或多種生物標志物的表達通過使用一種或多種結合部分來進行，每個結合部分各自能夠選擇性地結合編碼在表iii中鑒定的一種生物標志物的核酸分子。在另外的實施方式中，一種或多種結合部分各自包括核酸分子或各自由核酸分子分子構成。因此，一種或多種結合部分可各自包括下述物質或由下述物質構成：dna、rna、pna、lna、gna、tna或pmo。但優(yōu)選一種或多種結合分子各自包括dna或由dna構成。優(yōu)選地，一種或多種結合部分的長度為5～100個核苷酸。更優(yōu)選地，一種或多種結合部分的長度為15～35個核苷酸。還更優(yōu)選地，結合部分包括可檢測部分。在另外的實施方式中，可檢測部分選自下組：熒光部分；發(fā)光部分；化學發(fā)光部分；放射性部分(例如放射性原子)；以及酶部分。優(yōu)選地，可檢測部分包括放射性原子或由放射性原子構成。放射性原子可選自下組：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、錸-186、錸-188和釔-90。但是，結合部分的可檢測部分可以是熒光部分(例如，alexafluor染料，例如alexa647)。在一個實施方式中，步驟(b)、(d)和/或(f)中提供的樣品選自下組：未分級分離的血、血漿、血清、組織液、胰組織、胰汁、膽汁和尿液。優(yōu)選地，步驟(b)、(d)和/或(f)中提供的樣品選自下組：未分級分離的血、血漿和血清。更優(yōu)選地，步驟(b)、(d)和/或(f)中提供的樣品為血漿。在另外優(yōu)選的實施方式中，步驟(b)、(d)和/或(f)中提供的樣品為血清。本發(fā)明的第二方面提供用于檢測個體中胰腺癌存在的陣列，其包括如本發(fā)明第一方面所限定的一種或多種結合試劑。陣列適合用在如上所述的本發(fā)明的方法中。優(yōu)選一種或多種結合試劑能夠與表iii中定義的所有蛋白質結合。本發(fā)明的第三方面提供選自本發(fā)明第一方面定義的組的一種或多種生物標志物的用途，用作檢測個體中胰腺癌存在的診斷標志物。優(yōu)選地，表iii中定義的所有蛋白質用作檢測個體中胰腺癌存在的診斷標志物。本發(fā)明的第四方面提供用于診斷胰腺癌存在的試劑盒，其包括：a)一個或多個根據(jù)本發(fā)明第一方面的第一結合試劑或根據(jù)本發(fā)明第二方面的陣列；以及b)用于進行根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法的說明。下面將參考下述表和圖來描述體現(xiàn)本發(fā)明的某些方面的優(yōu)選的、非限制性示例：圖1：pac與n的分類a)與pac血清雜交的抗體微陣列的掃描圖像?？偣?60個探針，包括位置標志物和對照，被印在八個20×8亞陣列/片中。b)pac相比n的血清分析物差異化表達(p<0.05)。c)pac相比n的基于全部抗體的roc曲線，即，使用了未過濾的數(shù)據(jù)。d)使用基于全部抗體的svm預測值進行的pac相比n的分類(紅點-pac，藍點-n)。在熱圖中示出了前20個差異化表達(p<0.02)的非冗余分析物的相對表達水平。紅色-上調，綠色-下調，黑色-同等水平。(e)scfv抗體特異性的驗證，示出了高度差異化表達(p＝0.005)的分析物il-6的圖形，用的是278種人蛋白質的陣列。(f)scfv抗體特異性的驗證，示出了中等差異化表達(p＝0.005)的分析物il-10的圖形，用的是278種人蛋白質的陣列。圖2：用于pac與n分類的生物標志物簽名的預驗證(a)使用loo程序結合向后消除策略進行的第一患者隊列中pac類相比于n類的生物標志物簽名的縮圖。觀察的rocauc值針對于剩余的抗體數(shù)量作圖。(c)由第一患者隊列獲得的精簡的(condensed)18-分析物的非冗余生物標志物簽名。(d)第一患者隊列用作訓練組，并且然后使用輸出分類器(classifier)檢測新的、獨立的患者組，即第二患者隊列。(e)用于pac與n分類的生物標志物簽名的預驗證，由分離器在檢測組上所獲得的roc曲線例示。圖3：候選血清生物標志物簽名區(qū)分pac和胰腺炎(a)分別針對pac與chp、aip或chp+aip+n的差異化表達(p<0.05)的血清分析物。(b)用于pac、chp、aip或chp+aip+n分類的基于全部抗體的roc曲線，即，使用了未過濾的數(shù)據(jù)。(d)使用10-plex細胞因子夾心抗體微陣列(msd)對所選分析物進行抗體微陣列數(shù)據(jù)的驗證。僅針對分析物il-8示出了數(shù)據(jù)，其觀察的信號的大部分大于msd分析的檢測下限。圖4：用于pac診斷的候選血清生物標志物簽名的預驗證(a)將由pac、n、chp和aip構成的第一患者隊列分成訓練組(三分之二)和檢測組(三分之一)。(b)使用向后消除策略針對訓練組獲得的精簡的25個非冗余血清生物標志物簽名。(c)用于pac診斷的精簡的25-分析物的生物標志物簽名的預驗證，由分離器在檢測組上所得的roc曲線所例示。(d)通過向后消除策略獲得的精簡的生物標志物簽名的表現(xiàn)(實線)，由rocauc值表示，與i)1000個隨機25-標志物簽名(空心圓)、或ii)最低p-值(虛線)、或iii)最高差異倍數(shù)(點畫線)得到的25-分析物簽名相比。(e)當樣品注釋為正確(實線)或改變1000次(空心圓)時，比較檢測組上針對精簡的25-分析物生物標志物簽名得到的rocauc值。圖5：抗體微陣列策略的綱要圖6：用于區(qū)分(a)胰腺癌、以及(b)正常、慢性胰腺炎和/或急性炎癥性胰腺炎的roc-auc值示出了多個標志物簽名的roc-auc值，所述簽名具有全部的表iv(a)(即核心)標志物和全部的表(b)(即優(yōu)選的)標志物、以及具有增加數(shù)量的表(c)(即任選)標志物。從29個分析物簽名，即核心標志物+優(yōu)選標志物+15任選標志物，獲得最佳rocauc值(0.90)。但是，所有標志物的組合具有顯著的預測能力。實施例材料和方法血清樣品在診斷時收集血清樣品，即在開始任何治療之前，從兩個獨立的患者隊列收集并儲存在-80℃。在第一隊列中，篩查來自診斷患有腺癌(pac)(n＝34)、慢性胰腺炎(chp)(n＝16)、自身免疫性炎癥性胰腺炎(aip)(n＝23)、或健康個體(n)(n＝30)(無臨床癥狀)103位患者的血清樣品。表1描述了患者人口統(tǒng)計學。將該隊列隨機地分開并用作訓練組和檢測組。第二隊列，由診斷患有pac(n＝25)或n(n＝20)(針對患者人口統(tǒng)計學，參見[14])的45名患者構成，第二隊列僅用作獨立的檢測組，使用近期收集的抗體微陣列數(shù)據(jù)[14]。樣品隊列的大小受在診斷時收集的能夠良好表征的血清樣品的限制。抗體微陣列分析使用在先內部優(yōu)化的方案進行重組抗體微陣列分析[12-15](參見下述)。簡要來說，使用靶標57個主要的免疫調節(jié)分析物的121個人重組單鏈fv(scfv)抗體用作探針。通過使用i)嚴謹選擇方案[16]，ii)每個目標分析物的多克隆(≤4)和iii)通過分子設計改編的scfv庫微陣列(ref)來確定來源于scfv的噬菌體展示的特異性、親和性(nm范圍)和芯片上的功能[16]。使用非接觸式分配器通過逐一分散抗體和對照(330pl/滴)來制備平面抗體微陣列(陣列大小；160x8,<0.5cm2)。單獨篩選生物素化血清樣品以及通過添加熒光標記的鏈霉抗生物素蛋白并使用共聚焦熒光掃描儀來可視化特異性結合的分析物。每個單獨的陣列數(shù)據(jù)點代表四個重復樣品的平均值。使用半全局歸一算法來進行芯片至芯片的歸一。根據(jù)之前的研究[12,15,17]，點-至-點再現(xiàn)性和陣列-至-陣列再現(xiàn)性的相關系數(shù)分別為0.99和0.94。分別使用234個人蛋白質陣列和10-plex細胞因子三明治抗體微陣列來驗證選擇的抗體的特異性和微陣列數(shù)據(jù)(表ii)。另外，已經使用elisa、蛋白質陣列、攔網(wǎng)/扣球實驗(blocking/spikingexperiment)和/或質譜驗證了一些抗體的特異性(表ii)。微陣列數(shù)據(jù)分析在r中進行數(shù)據(jù)分析(參見下述)。簡要地說，使用支持向量機(svm)將樣品分為兩個確定的組中的一個(例如，癌癥vs.健康)，使用線性核估計并將制約成本設置為1。沒有進行嘗試來調節(jié)其以防止過度擬合的風險。使用留-出(leave-one-out(loo))交叉驗證程序對svm進行訓練和檢測。在對照的兩個中，該訓練部分包括通過在訓練組中選擇展示最高識別力(discriminatorypower)的抗體得到的抗體子面板。使用直接或交叉驗證向后消除策略來進行抗體的選擇。使用該方法，可以驗證精簡的候選生物標志物簽名，并隨后在獨立的檢測組上評估。使用0閾值水平，由svm決策值來計算靈敏度和特異性值。使用svm決策值來構建受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristics(roc))曲線。計算曲線下面積(auc)并用作預測性能的量度。另外，針對每個抗體計算wilcoxonp-值和倍數(shù)變化(foldchange)。按照針對腫瘤標志物預后研究的推薦來報告候選生物標志物簽[18]。血清樣品在通知同意后，在診斷時即在開始治療之前，從兩組獨立的患者隊列上收集血清樣品，并儲存在-80℃。使用組織學來驗證pc?；颊哧犃?由來自患有胰腺導管腺癌(pac)(n＝34)、慢性胰腺炎(hcp)(n＝16)、自身免疫性胰腺炎(aip)(n＝23)或健康個體(對照；n)(n＝30)(無臨床癥狀)的103個患者(mannheimuniversityhospital,germany)的血清樣品組成。表1描述了患者人口統(tǒng)計學。將該隊列隨機地分開并用作訓練組(樣品的三分之二)和檢測組(樣品的三分之一)?；颊哧犃?由診斷患有pac(n＝25)或n(n＝20)的45名患者構成(stockholmsouthgeneralhospitalandlunduniversityhospital,sweden)(針對患者人口統(tǒng)計學，參見[39])，并如最近描述的適于使用抗體微陣列數(shù)據(jù)[39]。進行了功效分析(如下所述)以確定樣品隊列的大小是否足夠提供統(tǒng)計功效>80％。針對患者隊列1進行主要實驗，患者隊列用作在一個實驗中用于驗證的獨立的數(shù)據(jù)組(參見圖5)。血清樣品的標記使用之前針對血清蛋白質組優(yōu)化的標記步驟來標記血清樣品[39-43]。簡要來說，將未加工血清樣品在冰上解凍并對30μl的等分樣品進行離心(16000xg，20分鐘，4℃)。在pbs中將5μl上清液稀釋45倍，得到的蛋白質濃度為約2mg/ml。在終濃度為0.6mm，在冰上利用硫-nhs-lc-生物素(pierce,rockford,il,usa)標記樣品2小時，并每20分鐘輕柔懸混樣品。使用3.5kdamw截留透析單元(thermoscientific,rockford,il,usa)，在4℃，通過相對于pbs的透析除去游離的生物素72小時。將樣品等分并在-20℃儲存。scfv的生產和純化從n-coder庫選擇了總共121個靶標57個主要免疫調節(jié)生物分子的人重組單鏈fv(scfv)抗體片段，并由bioinventinternationalab,lund,sweden善意提供，或由prof.matsohlin(lunduniversity,sweden)(針對粘蛋白-1的5個克隆)善意提供。通過使用i)嚴謹選擇方案[43]，ii)每個目標分析物的多克隆(≤4)和iii)通過分子設計改編的scfv庫微陣列[44,45]來確定來源于scfv的噬菌體展示的特異性、親和性(nm范圍)和芯片上的功能。在100ml大腸桿菌培養(yǎng)物中制備抗體片段并使用在ni-nta瓊脂糖上的親和性色譜(qiagen,hilden,germany)從各自的表達上清液或細胞周質純化。使用250mm咪唑洗脫結合分子，并針對pbs大規(guī)模地進行透析并在用于微陣列制造之前儲存在4℃。通過在280nm處的吸光度來確定抗體濃度(平均500μg/ml，范圍50～1840μg/ml)?？贵w微陣列的制備和處理為了制備平面抗體微陣列，我們使用了經預先優(yōu)化和驗證的設置[39-43,46]。簡要來說，使用非接觸式打印機(biochiparrayer,perkinelmerlife&analyticalsciences,wellesley,ma,usa)，通過沉積約330pl-滴，使用piezo技術，將scfv布置到balck聚合物maxisorb微陣列片(nunc,roskilde,denmark)上。在每個位置滴下兩滴，使得在第二滴分散之前第一滴干燥。平均地，在每個位置沉積5fmol抗體(范圍1.5～25)。為了保證充分的統(tǒng)計性和解決任何局部缺陷，每個探針重復印刷8個重復樣品。在每片上印刷了包括位置標志物和對照scfv的總共160個探針，排列在8個20x8亞陣列中。為了在定量過程中輔助柵極調整(gridalignment)，在選定的位點放置一行alexa647偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白(invitrogen,carlsband,ca,usa)(10μg/ml)。在pbs中的5％(w/v)無脂奶粉(semperab,sundbyberg,sweden)中對該陣列進行阻斷過夜。在proteinarrayworkstation(perkinelmerlife&analyticalsciences)中，根據(jù)先前的描述對微陣列片進行處理。簡要來說，利用在pbs中的0.5％(v/v)tween-20(pbs-t)，以60μl/min沖洗陣列4分鐘，然后利用75μl生物素化血清樣品(稀釋的1:2，得到1:90的總血清稀釋)溫浴，該75μl生物素化血清樣品在含1％(w/v)無脂奶粉和1％(v/v)tween-20的pbs(pbs-mt)中，培養(yǎng)1小時，且每15秒鐘進行攪拌。接下來，再次利用pbs-t沖洗并利用pbs-mt中的1μg/mlalexa-647偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白溫浴1小時。最終，利用pbs-t沖洗陣列，并在氮氣氣流下干燥，并利用共聚焦微陣列掃描儀(perkinelmerlife&analyticalsciences)在10μm分辨率下掃描，使用pmt電流增益(pmtgain)和激光功率的四種不同的掃描儀設置。在scanarrayexpresssoftwarev.4.0(perkinelmerlife&analyticalsciences)中，使用固定圈方法(fixedcirclemethod)對每個點的強度進行定量。減去局部背景。為了補償任何可能的局部缺陷，自動地除去兩個最高和兩個最低的重復樣品，并且使用剩余的四個重復樣品的平均值。對于抗體展示飽和的信號，來自較低的掃描儀設置的值被放大并代替使用。使用先前描述的半全局歸一算法[39,40,42]來進行芯片至芯片的歸一。首先，計算并排序全部樣品中的每個探針的cv。然后，鑒定出在所有樣品中展示最低cv-值的15％的探針并用于針對每個陣列計算芯片至芯片的歸一因子。歸一因子ni利用公式ni＝si/μ來計算，其中si是使用的抗體的信號強度之和，所有樣品取平均，以及μ是si的樣品平均值。在統(tǒng)計分析之前，重新計算強度取log2值?？贵w特異性的驗證使用278humanproteinarrayg系列(norcross,ga,usa)，根據(jù)制造商提供的說明書，對兩個選定的scfvs(抗-il-6(2)和抗-il-10(1))的特異性進行測試。利用硫-nhs-lc-生物素(pierce)標記scfv，2小時，在冰上，且生物素的量為3.5倍過量摩爾量。利用pbs透析72小時除去未結合的生物素。向每個陣列添加總共5μg抗體。使用1μg/mlalexa647狗鏈的鏈霉抗生物素蛋白(invitrogen)檢測結合。向一個陣列中添加pbs作為陰性對照以檢測鏈霉抗生物素蛋白的非特異性結合。對陣列進行掃描并減去由陰性對照陣列得到的信號。另外，使用良好定性的、標準化的血清樣品，以及獨立的方法，諸如質譜、elisa、msd和cba以及扣球和攔網(wǎng)實驗預先驗證了幾個抗體的特異性(表iii)。陣列數(shù)據(jù)的驗證進行了人th1/th210-plexmsd(mesoscalediscovery,gaithersburg,md,usa)分析以嘗試確認抗體微陣列結果。在空間上不同的電極點中，msd96-孔板的每個孔均利用抗ifn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-5、il-8、il-10、il-12p70、il-13和tnf-α的抗體進行了預功能化。分析了總計34個血清樣品(未稀釋的)，包括11個pac、11個健康樣品、9個chp和3個aip樣品(aip樣品的數(shù)量較少是因為受到亞組中樣品容量的限制)。根據(jù)制造商提供的說明書進行分析并且在msd儀器中進行了基于電化學發(fā)光的讀取。微陣列數(shù)據(jù)分析在r(http://www.r-project.org)中進行所有的統(tǒng)計和數(shù)據(jù)分析。簡要地說，使用支持向量機(svm)將樣品分為兩個確定的組中的一個(例如，癌癥vs.健康)，使用線性核估計并將制約成本設置為1。沒有進行嘗試來調節(jié)其以防止過度擬合的風險。使用留-出(loo)交叉驗證程序對svm進行訓練和檢測[42]。在對照的兩個中，該訓練部分包括通過在訓練組中選擇展示最高個人鑒別力的抗體得到的抗體子面板。使用直接或交叉驗證向后消除策略來進行抗體的選擇。使用該方法，可以驗證精簡的候選生物標志物簽名，并隨手在獨立的檢測組上評估。使用0閾值水平，由svm決策值來計算靈敏度和特異性值。使用svm決策值來構建受試者工作特征(roc)曲線。計算曲線下面積(auc)并用作預測性能的量度。另外，針對每個抗體計算wilcoxonp-值和倍數(shù)變化。按照針對腫瘤標志物預后研究的推薦來報告候選生物標志物簽[47]。生物標志物簽名的鑒定使用落后消除方案鑒定用于從健康個體中區(qū)分pac的生物標志物簽名。在該方法中，當時從數(shù)據(jù)集中排除一個樣品。使用剩余的樣品訓練svm，通過當時排除一個樣品并且使用剩余的抗體進行分類。當所有的抗體已經被除去一次時，最少信息抗體被定義為當針對分類得到最小kullback-leibler(kl)錯誤時排除的抗體，并將其從數(shù)據(jù)集中消除。重復進行l(wèi)oc步驟，直到僅剩下一個抗體，并記錄通過其消除抗體的命令。通過排除新樣品來重復步驟，該重復持續(xù)進行直到所有樣品被除去一次。在每次排除樣品時產生抗體被消除的命令列表。最終，當所有樣品已經被除去一次，并且構建了合意列表，其中每個抗體被分配了基于其忍受消除步驟的時間的分數(shù)，針對進行的所有重復取平均。在整個過程中，使用每個除去的樣品來檢測針對每個抗體亞組的新長度的svm模型構建，并返回根據(jù)性能的決策值。由此，收集了針對任何給定亞組長度的所有樣品的決策值。相對于抗體的數(shù)量繪制相應的roc區(qū)域，作為用于評估數(shù)據(jù)組能力和消除策略的手段。從合意列表中選擇了18個分析物的精簡簽名，并且將來自25個pac和20個n血清樣品的抗體微陣列分析的獨立數(shù)據(jù)組[39]用作檢測組以對候選簽名進行預驗證。在檢測組中，在svmloo交叉驗證程序中使用了簽名分析物，并在roc曲線中示出了用于從n中區(qū)分pac的簽名的能力。針對從n、chp和aip中區(qū)分pac產生了第二候選生物標志物簽名。首先，將數(shù)據(jù)隨機分成訓練組(樣品的三分之二)和檢測組(樣品的三分之一)。使用了修改的(甚至是更嚴謹?shù)?向后消除策略。代替當時除去一個樣品，僅訓練svm一次，使用訓練組中的全部樣品。由此，由選擇的25個分析物的精簡組產生了一個消除列表并用于在訓練組中構建svm。在獨立的檢測組上施用模型并且產生了roc曲線。另外，進行了統(tǒng)計功效分析以評估在r(根據(jù)shapiro-wilk檢測所建議的假定決策值正常分布)中使用功能“power.t.test”在檢測組中所需的患者的數(shù)量。在訓練組中由svm分析觀察的決策值顯示2.87的標準偏差，并且3.47的組間delta值(平均之間的差異)。將alpha水平(顯著水平)設定為0.05。另外，通過分別比較選定的簽名和1000個產生的相同長度的簽名的性能以及比較選定的簽名和通過選擇最低p值和最高倍數(shù)變化的抗體產生的簽名，對落后消除方案的有效性進行驗證。最后，分類器的強度和數(shù)據(jù)組通過比較檢測數(shù)據(jù)組的簽名相對于隨機數(shù)據(jù)的性能來檢測，在檢測數(shù)據(jù)組中生成1000個樣品注釋置換(permutationofthesampleannotations)。結果pac與健康對照的分類為了鑒定與pac相關的血清生物標志物簽名，我們使用第一患者列隊，進行了pac(n＝34)與n(n＝30)的差異化血清蛋白質表達概貌描繪?？贵w微陣列的代表性圖像如圖1a所示，說明獲得了動態(tài)信號強度、足夠的點形態(tài)學(spotmorphology)以及低的非特異性背景結合。結果顯示發(fā)現(xiàn)了33個非冗余蛋白質分析物(包括例如th1和th2細胞因子兩者)有差異化表達(p<0.05)，其中除了補體蛋白c1q和備解素以外全部都在pac中被上調了(圖1b)。為了研究是否pac和n可以被區(qū)分，我們運行了svmloo交叉驗證，基于所有的抗體，即，使用了未過濾數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示患者隊列可以通過0.94的rocauc值來分類(圖1c)。在圖1d中，通過減少svm決策值來對樣品作圖，并且在熱圖中示出了前20種最高水平差異化表達的分析物(p<0.02)的相對表達方式。通過使用0閾值(默認值)，分析顯示可以以靈敏度和特異性為82％和87％區(qū)分pac與n。接下來，使用了一個278種人蛋白質的陣列用于驗證所選抗體的特異性(圖1e和1f)。為此，選擇了抗較高水平差異化表達的分析物il-6(p＝0.005)的scfv抗體，和抗中等水平差異化表達的分析物il-10(p＝0.04)的scfv抗體。在兩種情況中，蛋白質陣列分析顯示scfv抗體片段特異性地結合至它們的靶標蛋白質。預驗證pac類與n類的精簡的生物標志物簽名為了檢測從第一患者隊列(n＝64)衍生的分類的強度，我們首先將分析物總數(shù)量壓縮至對于所述分類貢獻最多的18個非冗余生物標志物，方法是將我們的loo程序與一種重復的向后消除策略組合。在該過程中，kullback-leibler偏差誤差(divergenceserror)被最小化并且用于指導將所述抗體一個接一個地逐步去除。在每一輪之后，收集svm決策值，并且計算相應的roc曲線和auc值。在圖2a中，auc值針對于剩余的抗體數(shù)量作圖，顯示甚至在僅包括少量的抗體時也能有高水平的且穩(wěn)定的分類。18-分析物精簡候選血清生物標志物簽名(由諸如細胞因子、補體蛋白和酶等多種分析物組成)如圖2b所示。接下來，我們將所述的18-分析物分類器應用在新的獨立的檢測組，即第二患者列隊(n＝45)上(圖2c)。結果顯示該分類器能夠利用0.95的rocauc值將患者分成pac與n(圖2d)，對應于靈敏度88％以及特異性85％。因此，該數(shù)據(jù)描繪出了用于pac診斷的第一預驗證的血清生物標志物簽名。區(qū)分pac與胰腺炎的生物標志物簽名為了檢測是否可以將癌癥與胰腺的良性狀態(tài)區(qū)分開，我們使用第一患者隊列比較了pac(n＝34)的血清蛋白質表達概貌與chp(n＝16)或aip(n＝23)的血清蛋白質表達概貌。在pac與chp的情況下，查明了15個非冗余的差異化表達(p<0.05)的血清分析物，其中除了兩個(il-4和il-12)以外全部在pac中被上調了(圖3a)?；谖催^濾數(shù)據(jù)，結果顯示pac與chp可以利用0.86的rocauc值來區(qū)分(圖3b)，對應于97％靈敏度和69％特異性。在pac與aip的比較中，發(fā)現(xiàn)了總共49個非冗余血清分析物被差異化表達，除了c1q和備解素以外，它們全部在pac中被上調了(圖3a)。同樣，基于未過濾的數(shù)據(jù)，結果顯示可以利用0.99的roc值來區(qū)分pac與aip(圖3b)，靈敏度和特異性分別為97％和91％。為了更好地反映臨床實際，我們隨后用第一患者隊列(n＝103)調查了是否能辨別pac組與chp+aip+n多類型混合患者組之間的差異。結果顯示47個非冗余血清蛋白質被差異化表達(p<0.05)(圖3a)。這些分析物中大部分(47個中的45個)在pac中被發(fā)現(xiàn)上調，包括廣泛多種蛋白質?；谖催^濾的數(shù)據(jù)，結果顯示可以利用0.85的rocauc值來區(qū)分pac與該多類型患者組。在一個驗證所述陣列數(shù)據(jù)的嘗試中，使用了獨立的10-plex細胞因子夾心抗體微陣列(msd)(圖3c)。但在10個目標血清分析物中僅一個(il-8)在大部分樣品中高于msd分析的檢測下限。同樣地，通過msd分析發(fā)現(xiàn)，在pac相比于n、chp、aip及其混合的情況中，在除了pac與aip(p＝0.29)的所有情況中，il-8的上調都被統(tǒng)計確認了(p<0.05)。用于pac診斷的提煉的生物標志物簽名為了檢測整個第一患者隊列(包括pac、n、chp和aip(n＝103))的分類強度，我們將該隊列分成訓練組(三分之二)和檢測組(三分之一)(圖4a)。接下來，通過使用直接、重復的向后消除策略，解碼了由在訓練組中對分類貢獻最多的25個非冗余分析物構成的精簡的血清生物標志物簽名。所述25-分析物的精簡生物標志物簽名由例如多種細胞因子和補體蛋白構成，在圖4b中示出。接下來，我們將該25-分析物分類器用于獨立的檢測組(圖4c)。數(shù)據(jù)顯示可以利用0.88的rocauc值查明pac，靈敏度和特異性分別為73％和75％。為了進一步挑戰(zhàn)所述分類器，我們從統(tǒng)計上分析了其識別力。首先，在訓練組中產生了相同長度(25個抗體)的1000個隨機簽名，并用于檢測組。結果顯示在95％的例子中，針對這些隨機簽名的auc值低于分類器生物標志物簽名的auc值(auc＝0.88)(圖4d)。另外，基于最低p-值(auc＝0.77)或最高倍數(shù)改變(auc＝0.78)所選出的相應25-分析物簽名的auc值明顯低于分類器簽名的auc值。因此，所述數(shù)據(jù)進一步表明所述分類器的識別力，以及向后消除策略用于確定精簡的、高效率簽名的適用性。第二，將檢測組樣品的注釋改變1000次以比較相同數(shù)量樣品的特異性分類和隨機分類。結果顯示當使用正確的樣品注釋時auc值明顯地高于當使用隨機注釋時得到的auc值(0.88比0.19-0.86，平均值0.5)，進一步證實了所述分類的能力。討論在本研究中，我們應用了親和性蛋白質組學來駕馭免疫系統(tǒng)對靶標pac的診斷能力。我們根據(jù)了針對如下發(fā)現(xiàn)我們所采用的方法，該發(fā)現(xiàn)為：免疫系統(tǒng)對于由疾病引起的個體健康狀況的改變非常敏感，能通過尤其是免疫調節(jié)性分析物的水平的波動來記錄這些改變。為此，我們設計了我們的抗體微陣列，以主要靶定這些關鍵性的調節(jié)性血清分析物的類型。數(shù)據(jù)顯示，展現(xiàn)高診斷能力的與pac相關的候選生物標志物簽名能夠被解碼(de-convoluted)。以相似的方式，近來該親和蛋白質組學方法能夠鑒定用于區(qū)分其他癌癥跡象和健康對照的一些血清學生物標志物簽名[14-15,17,19]，進一步顯示了該平臺的實力。我們首次顯示了血清儲存的信息使得我們不僅能夠具有高度確信度區(qū)分pac與對照，以及pac與胰腺炎的經明確確定的患者隊列，還可以具有高度確信度地區(qū)分pac與對照和胰腺炎患者的混合隊列。后者的發(fā)現(xiàn)是特別關鍵的，因為在要篩選不同種類的患者組的臨床設置中，候選標志物簽名也應當表現(xiàn)良好。高效率的pac分類器的臨床影響會較高，因為尚無有效的血清學識別器出現(xiàn)[2,7-9,20-21]。在等待黃金的分類器被建立的過程中，ca-19-9仍然是針對pac診斷的最有效的分子標志物[2,8-10]。明顯地，相比較于ca-19-9所一貫顯示的靈敏度和特異性[2,9-11]，我們的數(shù)據(jù)顯示了針對pac診斷的顯著高的中值靈敏度(88％)和特異性(85％)，顯示了顯著的增加臨床價值。另外，我們最近還模擬了新的診斷可能性對成本、存活率和高?；颊叩纳|量的影響，顯示了親和性蛋白質組學具有成為篩選pac的經濟有效的工具的巨大前景(bolinetal,msinprep.)。分類器將會發(fā)揮其最大優(yōu)勢，如果能夠進行早期診斷，在當腫瘤仍然較小和可進行手術時[2,9]。在尋找癌癥生物標志物的過程中，系統(tǒng)性炎癥作為潛在的干擾因子經常被提及[23]，因為癌癥發(fā)展和炎癥是關聯(lián)的。在基于親和性蛋白質組學的早期工作中，結果還經常顯示普通疾病(炎癥的)簽名而不是癌癥-特異的指紋被鑒定出來[24-26]。明顯地，在本文中我們顯示了可以高度確信地區(qū)分pac和胰腺炎。另外，觀察的簽名(一個或多個)顯示了顯著的差異，即與在其他不同炎癥病況文獻[19,27](carlssonetal.,msinprep.)和其他癌癥[14-15,17,19]中觀察到的僅有少的重疊，進一步支持了破譯了pac-特異性簽名的想法。血清的免疫簽名可以被認為是在檢測時在患者中的免疫系統(tǒng)活性的快照。這些指紋特征將反映響應于癌癥的直接的和間接的(系統(tǒng)的)影響的組合。關注細胞因子表達概貌，之前的報道已經顯示胰腺癌細胞系表達的一組細胞因子被發(fā)現(xiàn)是過表達的，在本研究中也顯示出，一組細胞因子包括例如il-6、il-8、il-10、il-12、il-13、il-18和tgf-β1[28]。還發(fā)現(xiàn)這些和其他細胞因子(例如vegf和il-7)中的一些在pac腫瘤組織和/或血清/血漿中給過表達[29-33]，進一步支持了我們的觀察。盡管細胞因子在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關鍵作用，在生物演化關系(biologicalcontext)中解釋這些錯綜復雜的表達模式是需要的，因為這些分析物中的很多展現(xiàn)了多重功能，并且通過異常的細胞因子表達模式可以表征pac[29]。盡管例如ifn-γ的表達可以示意試圖的抗-腫瘤免疫響應[29]，pac的免疫環(huán)境經常被發(fā)現(xiàn)在免疫抑制位點中，如抗-炎癥細胞因子(例如tgf-β和il-10)，以及潛在的非活性促炎性細胞因子(例如il-12和il-18)的附隨表達所說明的[29]。細胞的免疫抑制是在多個患者中觀察到的pac的引人注目的生物特征[34]。盡管報道了th2傾斜響應，但也觀察到了本文所顯示的th1/th平衡[29,31,35]。還發(fā)現(xiàn)了細胞因子表達模式反應其他參數(shù)，諸如存活率[14,29]。觀察一些非細胞因子標志物，一些補體蛋白，例如c3(其已經被指出在針對腫瘤的免疫監(jiān)測中發(fā)揮功能[36-37])，糖類抗原lewisx之前也已經被發(fā)現(xiàn)與pac相關[38]。綜上，我們陳述了臨床需求并且顯示免疫簽名是用于破解針對pac診斷的第一預驗證的血清學生物標志物簽名的有效工具。這是通過高效率的平臺、經良好控制的樣品以及嚴謹?shù)纳镄畔W和驗證手段來實現(xiàn)的。將會在隨后的研究中驗證預測簽名的能力，其中將對獨立的樣品隊列進行分析。最終，這些發(fā)現(xiàn)會為改善pac診斷提供新的機會并且由此提高pac的預測和臨床管理。參考文獻1.hidalgo,m.,pancreaticcancer.nengljmed,2010.362(17):p.1605-17.2.chu,d.,w.kohlmann,andd.g.adler,identificationandscreeningofindividualsatincreasedriskforpancreaticcancerwithemphasisonknownenvironmentalandgeneticfactorsandhereditarysyndromes.jop,2010.11(3):p.203-12.3.jemala,s.r.,warde,haoy,xuj,thunmj.,cancerstatistics,2009.cacancerjclin,2009.59(4).4.pannala,r.,etal.,new-onsetdiabetes:apotentialcluetotheearlydiagnosisofpancreaticcancer.lancetoncol,2009.10(1):p.88-95.5.warshaw,a.l.andc.fernandez-delcastillo,pancreaticcarcinoma.nengljmed,1992.326(7):p.455-65.6.galasso,d.,a.carnuccio,anda.larghi,pancreaticcancer:diagnosisandendoscopicstaging.eurrevmedpharmacolsci,2010.14(4):p.375-85.7.chen,r.,etal.,proteomicsstudiesofpancreaticcancer.proteomicsclinappl,2007.1(12):p.1582-1591.8.duffy,m.j.,etal.,tumormarkersinpancreaticcancer:aeuropeangroupontumormarkers(egtm)statusreport.annoncol,2010.21(3):p.441-7.9.frylc,m.k.,malfertheinerp.,molecularmarkersofpancreaticcancer:developmentandclinicalrelevance.langenbecksarchsurg.,2008.393(6).10.koopmannj,r.c.,zhangz,cantomi,brownda,hunterm,yeoc,chandw,breitsn,gogginsm.,serummarkersinpatientswithresectablepancreaticadenocarcinoma:macrophageinhibitorycytokine1versusca19-9.clincancerres.,2006.15(12).11.boecks,s.p.,holdenrieders,wilkowskir,heinemannv.,prognosticandtherapeuticsignificanceofcarbohydrateantigen19-9astumormarkerinpatientswithpancreaticcancer.oncology,2006.70(4).12.ingvarssonj,l.a.,ag,truedssonl,janssonb,borrebaeckca,wingrenc.,designofrecombinantantibodymicroarraysforserumproteinprofiling:targetingofcomplementproteins.jproteomeres,2007.6(9).13.wingrenc,i.j.,dexlinl,szuld,borrebaeckca.,designofrecombinantantibodymicroarraysforcomplexproteomeanalysis:choiceofsamplelabeling-tagandsolidsupport.proteomics,2007.7(17).14.ingvarssonj,w.c.,carlssona,ellmarkp,wahrenb,g,harmenbergu,kroghm,petersonc,borrebaeckca.,detectionofpancreaticcancerusingantibodymicroarray-basedserumproteinprofiling.proteomics,2008.8(11).15.carlsson,a.,etal.,plasmaproteomeprofilingrevealsbiomarkerpaternsassociatedwithprognosisandtherapyselectioninglioblastomamultiformepatients.proteomicsclinicalapplications,2010.4(6-7):p.591-602.16.e,s.l.,jirholtp,kobayashin,alexeivav,abergam,nilssona,janssonb,ohlinm,wingrenc,danielssonl,carlssonr,borrebaeckca.,recombininggermline-derivedcdrsequencesforcreatingdiversesingle-frameworkantibodylibraries.natbiotechnol.,2000.18(8).17.carlssona,w.c.,ingvarssonj,ellmarkp,baldertorpb,m,olssonh,borrebaeckca.,serumproteomeprofilingofmetastaticbreastcancerusingrecombinantantibodymicroarrays.eurjcancer,2008.44(3).18.mcshane,l.m.,etal.,reportingrecommendationsfortumormarkerprognosticstudies(remark).natclinpractoncol,2005.2(8):p.416-22.19.ellmarkp,i.j.,carlssona,lundinbs,wingrenc,borrebaeckca.,identificationofproteinexpressionsignaturesassociatedwithhelicobacterpyloriinfectionandgastricadenocarcinomausingrecombinantantibodymicroarrays.molcellproteomics.,2006.5(9).20.garcea,g.,etal.,molecularprognosticmarkersinpancreaticcancer:asystematicreview.eurjcancer,2005.41(15):p.2213-36.21.rustgi,a.k.,pancreaticcancer:novelapproachestodiagnosisandtherapy.gastroenterology,2005.129(4):p.1344-7.22.biankin,a.v.,etal.,molecularpathogenesisofprecursorlesionsofpancreaticductaladenocarcinoma.pathology,2003.35(1):p.14-24.23.chechlinska,m.,m.kowalewska,andr.nowak,systemicinflammationasaconfoundingfactorincancerbiomarkerdiscoveryandvalidation.natrevcancer,2010.10(1):p.2-3.24.orchekowski,r.,etal.,antibodymicroarrayprofilingrevealsindividualandcombinedserumproteinsassociatedwithpancreaticcancer.cancerres,2005.65(23):p.11193-202.25.gao,w.m.,etal.,distinctiveserumproteinprofilesinvolvingabundantproteinsinlungcancerpatientsbaseduponantibodymicroarrayanalysis.bmccancer,2005.5:p.110.26.miller,j.c.,etal.,antibodymicroarrayprofilingofhumanprostatecancersera:antibodyscreeningandidentificationofpotentialbiomarkers.proteomics,2003.3(1):p.56-63.27.dexlin-mellby,l.,etal.,tissueproteomicprofilingofpreeclampticplacentatissueusingrecombinantantibodymicroarrays.proteomics-clinicalapplications,2010.4(10-11):p.794-807.28.bellone,g.,etal.,cytokineexpressionprofileinhumanpancreaticcarcinomacelsandinsurgicalspecimens:implicationsfor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述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(a)中列出的每個生物標志物的表達。7.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(b)中列出的1或多種生物標志物的表達，例如，檢測表iv(b)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18種生物標志物的表達。8.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(b)中列出的全部生物標志物的表達。9.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(c)中列出的1或多種生物標志物的表達，例如，檢測在表iv(c)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33種生物標志物的表達。10.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv(c)中列出的全部生物標志物的表達。11.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表iv中定義的全部生物標志物在檢測樣品中的表達。12.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中，該方法用于區(qū)分胰腺癌(pac)和任何其他疾病狀態(tài)或狀況。13.根據(jù)項12所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(a)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(a)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種生物標志物在檢測樣品中的表達。14.根據(jù)項12或13所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(b)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(b)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24種生物標志物在檢測樣品中的表達。15.根據(jù)項12、13或14所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(c)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(c)中列出的至少2、3、4或5種生物標志物在檢測樣品中的表達。16.根據(jù)項12～15中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(d)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(d)中列出的至少2或3種生物標志物在檢測樣品中的表達。17.根據(jù)項12～16中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(f)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(f)中列出的至少2、3、4、5或6種生物標志物在檢測樣品中的表達。18.根據(jù)項12～17中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表v(a)、表v(b)、表v(c)、表v(d)和/或表v(f)中列出的全部生物標志物在檢測樣品中的表達。19.根據(jù)項12～18中任一項所述的方法，其中其他疾病狀態(tài)或狀況為慢性胰腺炎(chp)、急性炎癥性胰腺炎(aip)和/或正常，例如其他疾病狀態(tài)或狀況可以是單獨的慢性胰腺炎；單獨的急性炎癥性胰腺炎；慢性胰腺炎和急性炎癥性胰腺炎；慢性胰腺炎和正常；急性炎癥性胰腺炎和正常；或者慢性胰腺炎、急性炎癥性胰腺炎和正常。20.根據(jù)項1～11中任一項所述的方法，其中，該方法用于區(qū)分胰腺癌和慢性胰腺炎(chp)。21.根據(jù)項20所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(a)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(a)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種生物標志物在檢測樣品中的表達。22.根據(jù)項20或21所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(c)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(c)中列出的至少2、3、4或5種生物標志物在檢測樣品中的表達。23.根據(jù)項20、21或22所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測在表v(a)和/或表v(c)中列出的全部生物標志物在檢測樣品中的表達。24.根據(jù)項1～11中任一項所述的方法，其中該方法用于區(qū)分胰腺癌和急性炎癥性胰腺炎(aip)。25.根據(jù)項24所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(a)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(a)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種生物標志物在檢測樣品中的表達。26.根據(jù)項24或25所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(b)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(b)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24種生物標志物在檢測樣品中的表達。27.根據(jù)項24、25或26所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(c)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(c)中列出的至少2、3、4或5種生物標志物在檢測樣品中的表達。28.根據(jù)項24～27中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(e)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達。29.根據(jù)項24～28中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(f)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(f)中列出的至少2、3、4、5或6種生物標志物在檢測樣品中的表達。30.根據(jù)項24～29中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(h)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(h)中列出的至少2或3種生物標志物在檢測樣品中的表達。31.根據(jù)項24～30中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測表v(a)、表v(b)、表v(c)、表v(e)、表v(f)和/或表iv(h)中列出的全部生物標志物在檢測樣品中的表達。32.根據(jù)項1～11中任一項所述的方法，其中該方法用于區(qū)分胰腺癌和正常個體(n)。33.根據(jù)項32所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(a)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(a)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種生物標志物在檢測樣品中的表達。34.根據(jù)項32或33所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(b)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(b)中列出的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24種生物標志物在檢測樣品中的表達。35.根據(jù)項32、33或34所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(d)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(d)中列出的至少2或3種生物標志物在檢測樣品中的表達。36.根據(jù)項32～35中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(e)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達。37.根據(jù)項32～36中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測來自表v(g)中列出的生物標志物中的1或多種生物標志物在檢測樣品中的表達，例如檢測表v(g)中列出的至少2或3種生物標志物在檢測樣品中的表達。38.根據(jù)項32～37中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括以下檢測或由以下檢測構成：檢測表v(a)、表v(b)、表v(d)、表v(e)和/或表iv(g)中列出的全部生物標志物在檢測樣品中的表達。39.根據(jù)項2～38中任一項所述的方法，其中未患胰腺癌的個體未患胰腺癌(pac)、慢性胰腺炎(chp)或急性炎癥性胰腺炎(aip)。40.根據(jù)項39所述的方法，其中未患胰腺癌的個體未患任何胰腺疾病或病況。41.根據(jù)項39或40所述的方法，其中未患胰腺癌的個體未患任何疾病或病況。42.根據(jù)項39、40或41所述的方法，其中未患胰腺癌的個體為健康的個體。43.根據(jù)項2～38中任一項所述的方法，其中未患胰腺癌的個體患慢性胰腺炎。44.根據(jù)項2～38中任一項所述的方法，其中未患胰腺癌的個體患急性炎癥性胰腺炎。45.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中胰腺癌選自下組：腺癌、腺鱗癌、印戒細胞癌、肝樣癌、膠樣癌、未分化癌和伴有破骨細胞樣巨細胞的未分化癌。46.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中胰腺癌為腺癌。47.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中使用能夠與所述一種或多種生物標志物結合的第一結合試劑來進行步驟(b)、(d)和/或步驟(f)。48.根據(jù)項47所述的方法，其中第一結合試劑包括下述物質或由下述物質構成：抗體或其抗原結合片段。49.根據(jù)項48所述的方法，其中抗體或其抗原結合片段是重組抗體或其抗原結合片段。50.根據(jù)項48或49所述的方法，其中抗體或其抗原結合片段選自下組：scfv；fab；免疫球蛋白分子的結合域。51.根據(jù)項48～50中任一項所述的方法，其中第一結合試劑被固定在表面上。52.根據(jù)項1～25中任一項所述的方法，其中用可檢測部分標記檢測樣品中的所述一種或多種生物標志物。53.根據(jù)項2～25中任一項所述的方法，其中用可檢測部分標記(一種或多種)對照樣品中的一種或多種生物標志物。54.根據(jù)項52或53所述的方法，其中可檢測部分選自下組：熒光部分；發(fā)光部分；化學發(fā)光部分；放射性部分；酶部分。55.根據(jù)項52或53所述的方法，其中可檢測部分是生物素。56.根據(jù)項47～55中任一項所述的方法，其中使用包括能夠與一種或多種生物標志物結合的第二結合試劑的分析進行步驟(b)、(d)和/或步驟(f)，該第二結合試劑包括可檢測部分。57.根據(jù)項56所述的方法，其中第二結合試劑包括或由以下物質構成：抗體或其抗原結合片段。58.根據(jù)項57所述的方法，其中抗體或其抗原結合片段為重組抗體或其抗原結合片段。59.根據(jù)項57或58所述的方法，其中抗體或其抗原結合片段選自下組：scfv；fab；免疫球蛋白分子的結合域。60.根據(jù)項56～59中任一項所述的方法，其中可檢測部分選自下組：熒光部分；發(fā)光部分；化學發(fā)光部分；放射性部分；酶部分。61.根據(jù)項60所述的方法，其中可檢測部分為熒光部分，例如alexafluor染料，如alexa647。62.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中該方法包括elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定)或由elisa構成。63.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中使用陣列進行步驟(b)、(d)和/或步驟(f)。64.根據(jù)項63所述的方法，其中陣列為基于珠的陣列。65.根據(jù)項63所述的方法，其中陣列為基于表面的陣列。66.根據(jù)項63～65中任一項所述的方法，其中陣列選自下組：宏陣列；微陣列；納米陣列。67.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中該方法包括：(v)利用生物素標記樣品中存在的生物標志物；(vi)使生物素-標記的蛋白質與陣列接觸，該陣列包括固定在其表面上的離散位置的多個scfv，所述scfv對于表iii中的一種或多種蛋白質具有特異性；(vii)使已固定的scfv與包括熒光染料的鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)物接觸；以及(viii)檢測在陣列表面上的離散位置的染料的存在，其中陣列表面上的染料的出現(xiàn)指示表iiii的生物標志物在樣品中的表達。68.根據(jù)上述項中任一項所述的方法，其中步驟(b)、(d)和/或(f)包括檢測編碼一種或多種生物標志物的核酸分子的表達。69.根據(jù)項68所述的方法，其中核酸分子是cdna分子或mrna分子。70.根據(jù)項68所述的方法，其中核酸分子是mrna分子。71.根據(jù)項68、69或70所述的方法，其中在步驟(b)、(d)和/或(f)中檢測一種或多種生物標志物的表達使用選自下組的方法進行：southern雜交、northern雜交、聚合酶鏈式反應(pcr)、反轉錄pcr(rt-pcr)、定量實時pcr(qrt-pcr)、納米陣列、微陣列、宏陣列、放射自顯影和原位雜交。72.根據(jù)項68～71中任一項所述的方法，其中在步驟(b)中檢測一種或多種生物標志物的表達通過使用dna微陣列來確定。73.根據(jù)項68～72中任一項所述的方法，其中在步驟(b)、(d)和/或(f)中檢測一種或多種生物標志物的表達通過使用一種或多種結合部分來進行，每個結合部分各自能夠選擇性地結合編碼表iii中一種生物標志物的核酸分子。74.根據(jù)項73所述的方法，其中一種或多種結合部分各自包括核酸分子或由核酸分子構成。75.根據(jù)項74所述的方法，其中一種或多種結合部分各自包括下述物質或由下述物質構成：dna、rna、pna、lna、gna、tna或pmo。76.根據(jù)項74或75所述的方法，其中一種或多種結合部分各自包括dna或由dna構成。77.根據(jù)項74～76中任一項所述的方法，其中一種或多種結合部分的長度為5～100個核苷酸。78.根據(jù)項74～76中任一項所述的方法，其中一種或多種核酸分子的長度為15～35個核苷酸。79.根據(jù)項74～78中任一項所述的方法，其中結合部分包括可檢測部分。80.根據(jù)項79所述的方法，其中可檢測部分選自下組：熒光部分；發(fā)光部分；化學發(fā)光部分；放射性部分，例如放射性原子；或酶部分。81.根據(jù)項80所述的方法，其中可檢測部分包括放射性原子或由放射性原子構成。82.根據(jù)項81所述的方法，其中放射性原子選自下組：锝-99m、碘-123、碘-125、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、磷-32、硫-35、氘、氚、錸-186、錸-188和釔-90。83.根據(jù)項80所述的方法，其中結合部分的可檢測部分為熒光部分。84.根據(jù)上述項中的任一項所述的方法，其中步驟(b)、(d)和/或(f)中提供的樣品選自下組：未分級分離的血、血漿、血清、組織液、胰組織、胰汁、膽汁和尿液。85.根據(jù)項84所述的方法，其中步驟(b)、(d)和/或(f)中提供的樣品選自下組：未分級分離的血、血漿和血清。86.根據(jù)項84或85所述的方法，其中步驟(b)、(d)和/或(f)中提供的樣品是血漿。87.一種用于檢測個體中胰腺癌存在的陣列，其包括如項47～61中任一項所限定的一種或多種結合試劑。88.根據(jù)項87所述的陣列，其中一種或多種結合試劑能夠與表iii中定義的所有蛋白質結合。89.選自表iii中定義的組的一種或多種生物標志物用作檢測個體中胰腺癌存在的診斷標志物的用途。90.根據(jù)項89所述的用途，其中表iii中定義的所有蛋白質都用作檢測個體中胰腺癌存在的診斷標志物。91.用于診斷胰腺癌存在的試劑盒，其包括：c)一個或多個如項47～55中任一項所定義的第一結合試劑或根據(jù)項63～66或項87或88的陣列；d)用于進行如項1～67或68～86中任一項所述的方法的說明。92.根據(jù)項91所述的試劑盒，其還包括如項56～61中任一項所定義的第二結合試劑。93.基本上如本文所述的用于檢測個體中胰腺癌存在的方法或用途。94.基本上如本文所述的用于檢測個體中胰腺癌存在的陣列或試劑盒。序列表<110>伊繆諾維亞公司(immunoviaab)<120>確定胰腺癌存在的方法、陣列以及用途<140>pct/gb2012/050483<141>2012-03-05<150>gb1103726.4<151>2011-03-04<160>2<170>seqwin99<210>1<211>242<212>prt<213>人(homosapiens)<400>1metalagluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnpro151015glyglyserleuargleusercysalaalaserglyphethrpheser202530sertyrglyphehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglu354045trpvalserleuilesertrpaspglyglyserthrtyrtyralaasp505560servallysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthr65707580leutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyr859095tyrcysalaargglythrtrppheaspprotrpglyglnglythrleu100105110valthrvalserserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly115120125glyglyglyserglnservalleuthrglnproproseralasergly130135140thrproglyglnargvalthrilesercysserglyserserserasn145150155160ileglyasnasnalavalasntrptyrglnglnleuproglythrala165170175prolysleuleuiletyrargasnasnglnargproserglyvalpro180185190aspargpheserglyserlysserglythrseralaserleualaile195200205serglyleuargsergluaspglualaasptyrtyrcysalaalatrp210215220aspaspserleusertrpvalpheglyglyglythrlysleuthrval225230235240leugly<210>2<211>31<212>prt<213>人工序列<220><223>6-his親和標簽<400>2asptyrlysasphisaspglyasptyrlysasphisaspileasptyr151015lysaspaspaspasplysalaalaalahishishishishishis202530當前第1頁12當前第1頁12