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Chip蛋白在胰腺癌治療中的用途

文檔序號(hào):1254596閱讀:330來源:國(guó)知局
Chip蛋白在胰腺癌治療中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及CHIP蛋白在胰腺癌治療中的用途。特別地,本發(fā)明涉及CHIP蛋白以及編碼其的DNA序列在制備用于治療胰腺癌的藥物中的用途。更特別地,本發(fā)明涉及一種CHIP蛋白在制備增強(qiáng)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡中的用途,以及一種編碼CHIP蛋白的DNA序列在制備用于治療胰腺癌的藥物中的用途。
【專利說明】CHIP蛋白在胰腺癌治療中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種CHIP蛋白在制備用于治療胰腺癌的藥物中的用途。更特別地,本 發(fā)明涉及編碼CHIP蛋白的DNA序列在制備用于治療胰腺癌的藥物中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 胰腺癌是最難早期發(fā)現(xiàn)、惡性程度最高和預(yù)后最差的腫瘤之一。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)對(duì) 美國(guó)腫瘤發(fā)病率及死亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,胰腺癌占全部腫瘤死亡原因的第四位,5年生存 率在5%以下。其死亡的主要原因是超過50%患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期,腫瘤已包繞血管或 發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,且對(duì)傳統(tǒng)的放化療或靶向治療具有一定耐受性。因此,提高胰腺癌的早期診 斷率,抑制腫瘤的生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,提高藥物的治療效果,成為改善胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵 因素。
[0003] 化療是目前胰腺癌的主要輔助治療手段,吉西他濱是治療局部進(jìn)展期及轉(zhuǎn)移性胰 腺癌的一線藥物。但是吉西他濱存在臨床應(yīng)答率低、固有或獲得性耐藥等問題,導(dǎo)致吉西他 濱單藥化療療效并不理想。隨著對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的加深理解及其細(xì)胞分子學(xué)機(jī)制 的掌握,應(yīng)用分子靶向藥物治療胰腺癌目前已逐漸成為晚期胰腺癌治療的研究重點(diǎn)。胰腺 癌細(xì)胞常伴表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR,Herl)及其內(nèi)源配體的高表達(dá),在胰腺癌的形成、進(jìn) 展及轉(zhuǎn)移中具有重要作用。因此,目前針對(duì)EGFR的靶向治療在晚期胰腺癌的治療中得以重 視。
[0004] EGFR為I型受體酪氨酸激酶ErbB家族成員之一,其配體包括EGF、TGF-a等。EGFR 與配體結(jié)合后,激活受體中的酪氨酸激酶(TK)活性,導(dǎo)致其酪氨酸激酶殘基發(fā)生磷酸化,暴 露酪氨酸激酶作用靶蛋白的結(jié)合位點(diǎn),進(jìn)而激活下游的多條信號(hào)通路,最終影響細(xì)胞的增 殖和分化。研究表明,EGFR在胰腺癌中高表達(dá),與基因拷貝數(shù)的增加及其配體的高表達(dá)相 關(guān)。同時(shí)EGFR在胰腺癌中也高度保守,其酪氨酸激酶區(qū)域不易發(fā)生突變,這些結(jié)果為靶向 治療的可行性提供了研究基礎(chǔ)。目前用于胰腺癌的靶向藥物包括單克隆抗體西妥昔單抗, 小分子酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼等。2007年5月NCIC 研究報(bào)告第一次證實(shí)厄洛替尼對(duì)晚期胰腺癌有確切療效,研究發(fā)現(xiàn)厄洛替尼聯(lián)合吉西他濱 較吉西他濱單藥化療使病人的死亡風(fēng)險(xiǎn)下降了 18%,中位生存期從5. 91個(gè)月延長(zhǎng)到6. 37個(gè) 月,1年存活率從17%上升到23%。該項(xiàng)研究證實(shí)了厄洛替尼聯(lián)合吉西他濱作為一線藥物對(duì) 晚期胰腺癌的療效。但是,與其他腫瘤一樣,針對(duì)EGFR的多種靶向藥物在胰腺癌患者中的 總體應(yīng)答率仍不高,其機(jī)制仍不清楚。如何加強(qiáng)針對(duì)EGFR的靶向藥物的療效,成為值得深 入研究的問題。
[0005] 研究發(fā)現(xiàn),在不同的惡性腫瘤中EGFR的表達(dá)量并不相同。在乳腺癌、宮頸癌和胰 腺癌中,EGFR通常是高表達(dá)的,但在非小細(xì)胞肺癌中EGFR表達(dá)量卻較低甚至不表達(dá)。因 此,針對(duì)EGFR的調(diào)控機(jī)制的探索是目前研究的重點(diǎn)之一。EGFR基因CpG島甲基化的改變, microRNA對(duì)EGFR轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,以及轉(zhuǎn)錄后修飾對(duì)EGFR蛋白活性的影響成為EGFR發(fā) 揮其穩(wěn)定性的主要原因。轉(zhuǎn)錄后修飾主要包括蛋白的磷酸化、乙?;?、SUM0和泛素化等,其 中泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是蛋白活性和結(jié)構(gòu)修飾及異常蛋白清除的主要途徑。研究表 明,泛素E3連接酶Cbl蛋白是EGFR蛋白發(fā)生降解的主要限速酶,當(dāng)EGFR羧基末端酪氨酸 殘基(Tyr) 1045位點(diǎn)磷酸化激活后即與Cbl蛋白結(jié)合,后者通過募集泛素激活酶(E1)和泛 素結(jié)合酶(E2)進(jìn)而將泛素小分子傳遞到EGFR蛋白表面并與之結(jié)合,再通過蛋白酶體系統(tǒng) 使得EGFR發(fā)生降解。當(dāng)EGFR的Tyrl045位點(diǎn)發(fā)生突變的時(shí)候,EGFR即無法與Cbl蛋白結(jié) 合導(dǎo)致受體無法正常的泛素化,從而繼續(xù)接受其配體的刺激而促進(jìn)下游腫瘤相關(guān)信號(hào)通路 的持續(xù)激活。值得注意的是,Cbl蛋白介導(dǎo)的受體泛素化在EGFR內(nèi)化過程中并不起主要作 用,Cbl蛋白突變能夠阻止EGFR的下調(diào),但并不影響EGF-EGFR復(fù)合物的內(nèi)化。這一結(jié)果支 持Cbl介導(dǎo)的泛素化在內(nèi)化的初始階段并不起重要作用,而是作用于比較晚的階段,因此, EGFR泛素化的調(diào)控仍需要進(jìn)一步的研究。
[0006] C末端Hsc70反應(yīng)蛋白(命名為CHIP)是一個(gè)種屬間高度保守的胞漿蛋白,在平滑 肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌和大腦中高度表達(dá)。它含有三個(gè)功能區(qū),N末端的TPR功能區(qū)、 C-末端的U-盒子功能區(qū)和中間的正負(fù)電荷富集區(qū)。CHIP作為一個(gè)陪伴蛋白(chaperone) 即可通過TPR基序(motif)與熱休克蛋白Hsp70和Hsp90相互作用,輔助新生蛋白折疊,形 成具有正常結(jié)構(gòu)和功能的蛋白,抑制變性蛋白的聚集;又可通過U-盒子功能區(qū)作為E3連 接酶,促進(jìn)蛋白底物的泛素化降解。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CHIP在多種腫瘤中發(fā)揮重要的作用???與CHIP結(jié)合并發(fā)生降解的蛋白包括突變的p53,雌激素受體,erbB2, SMAD3, HIF-1,SRC-3, NF-κ B,c-Myc,以及磷酸化的AKT等,這些底物都與腫瘤的增殖、侵襲或轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)。 另一方面,CHIP在乳腺癌、胃癌及腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平要明顯低于癌旁的正常組織, 這些結(jié)果均提示CHIP在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌的作用,但是目前關(guān)于CHIP蛋白與胰腺癌的 關(guān)系國(guó)內(nèi)外均沒有報(bào)道。
[0007] 本發(fā)明來源于一個(gè)驚人的方法,S卩,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)CHIP蛋白的過度表達(dá)可以抑制 胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力,而沉默CHIP蛋白胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能 力明顯增強(qiáng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 通過慢病毒載體將CHIP的microRNA (作為RNAi)或CHIP基因插入胰腺癌細(xì)胞株 Panc-l、BxpC-3、SW1990中,建立穩(wěn)定沉默或穩(wěn)定過表達(dá)CHIP的胰腺癌細(xì)胞株,本發(fā)明人證 實(shí)CHIP蛋白的過度表達(dá)可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力,而沉默CHIP蛋白胰 腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步地,本發(fā)明人證實(shí)了 CHIP蛋白可以增 強(qiáng)抗腫瘤劑厄洛替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,沉默CHIP蛋白后厄洛替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力明顯 減弱。
[0009] 因而,在第一方面,本發(fā)明提供了一種CHIP蛋白在制備用于治療胰腺癌的藥物中 的用途。
[0010] 進(jìn)一步地,本發(fā)明涉及所述CHIP蛋白在制備用于抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和 轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
[0011] 在另一方面,本發(fā)明涉及CHIP蛋白在制備增強(qiáng)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡中 的用途。
[0012] 進(jìn)一步地,本發(fā)明涉及CHIP蛋白在制備增強(qiáng)厄洛替尼誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡中的用 途。
[0013] 在另一方面,本發(fā)明提供了一種編碼CHIP蛋白的DNA序列在制備用于治療胰腺癌 的藥物中的用途。進(jìn)一步地,所述編碼CHIP蛋白的DNA序列如SEQ ID N0 :11所示。
[0014] 進(jìn)一步地,本發(fā)明涉及編碼CHIP蛋白的DNA序列在制備用于抑制胰腺癌細(xì)胞的增 殖、侵襲和轉(zhuǎn)移藥物中的用途。
[0015] 在另一方面,本發(fā)明涉及編碼CHIP蛋白的DNA序列在制備增強(qiáng)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的 癌細(xì)胞凋亡中的用途。
[0016] 進(jìn)一步地,本發(fā)明涉及編碼CHIP蛋白的DNA序列在制備增強(qiáng)厄洛替尼誘導(dǎo)的癌細(xì) 胞凋亡中的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1顯示為pcDNA6. 2載體的結(jié)構(gòu)。
[0018] 圖2顯示為pcDNA3. 1 ( + )載體結(jié)構(gòu)。
[0019] 圖3顯示為pLenti6. 2質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。
[0020] 圖4分別顯不為pReceiver-MOl質(zhì)粒結(jié)構(gòu)(圖4A)和pReceiver-MOll質(zhì)粒結(jié)構(gòu)(圖 4B)。
[0021] 圖5顯示了九株胰腺癌細(xì)胞CHIP表達(dá)水平的差異。
[0022] 圖6顯示了 mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)Bxpc-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后CHIP的沉默情況。上 圖為RT-PCR檢測(cè)CHIP mRNA表達(dá)水平。其中1,2,3,4分別代表四個(gè)不同的干擾序列,下圖 為Western blot法檢測(cè)CHIP蛋白表達(dá)水平,其中2-1,2-2代表第二個(gè)干擾序列第一次和 第二次轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)CHIP表達(dá)的影響。
[0023] 圖7顯示了 mRNA水平和蛋白水平檢測(cè)Bxpc-3細(xì)胞轉(zhuǎn)染后CHIP的過表達(dá)情況。 CHIP°E代表CHIP過表達(dá)組。
[0024] 圖8顯示了三株細(xì)胞穩(wěn)定沉默或過表達(dá)CHIP蛋白。miR代表采用第二個(gè)干擾序列 包裝的病毒在六孔板中的2個(gè)孔中進(jìn)行感染細(xì)胞后獲得的兩個(gè)穩(wěn)定沉默細(xì)胞株。CHIP° eR 表過表達(dá)CHIP蛋白,后同。
[0025] 圖9顯示了 Bxpc-3細(xì)胞下調(diào)CHIP表達(dá)后其他蛋白表達(dá)情況。
[0026] 圖10顯示了沉默CHIP蛋白表達(dá)前后胰腺癌細(xì)胞株增殖情況。miRl,miR2分別代 表沉默CHIP蛋白的細(xì)胞亞克隆,對(duì)照代表沉默組的對(duì)照,以下同。
[0027] 圖11顯示了過表達(dá)CHIP蛋白前后胰腺癌細(xì)胞株增殖情況。CHIP°E代表過表達(dá) CHIP蛋白的細(xì)胞組,對(duì)照代表過表達(dá)組的對(duì)照,以下同。
[0028] 圖12顯示了沉默CHIP蛋白表達(dá)前后胰腺癌細(xì)胞株處于S期細(xì)胞比率。*代表 ρ〈0· 05, ** 代表 ρ〈0· 01,以下同。
[0029] 圖13顯示了過表達(dá)CHIP蛋白前后胰腺癌細(xì)胞株處于S期細(xì)胞比率。
[0030] 圖14顯示了厄洛替尼誘導(dǎo)不同細(xì)胞的抑制率。
[0031] 圖15顯示了 CHIP蛋白沉默前后對(duì)厄洛替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。
[0032] 圖16顯示了過表達(dá)CHIP蛋白前后對(duì)厄洛替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。
[0033] 圖17顯示了 CHIP蛋白沉默前后對(duì)厄洛替尼誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性半胱天冬酶3/7的 影響。
[0034] 圖18顯示了 CHIP蛋白過表達(dá)前后對(duì)厄洛替尼誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性半胱天冬酶3/7 的影響。
[0035] 圖19顯示了 CHIP沉默前后對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。
[0036] 圖20顯示了 CHIP過表達(dá)前后對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。
[0037] 圖21顯示了三株胰腺癌細(xì)胞沉默或過表達(dá)CHIP后EGFR的改變。miRl和miR2分 別代表采用CHIP的microRNA序列沉默CHIP,CHIP° E代表過表達(dá)CHIP。
[0038] 圖22顯示了過表達(dá)或沉默CHIP后p-EGFR的表達(dá)水平改變。
[0039] 圖23顯示了穩(wěn)定沉默CHIP蛋白對(duì)三株胰腺癌細(xì)胞PI3K/AKT/mT0R通路的影響。 P-AKT代表磷酸化AKT蛋白,t-AKT代表總的AKT蛋白,后同。
[0040] 圖24顯示了穩(wěn)定沉默CHIP蛋白對(duì)三株胰腺癌細(xì)胞Src/FAK通路的影響。
[0041] 圖25顯示了穩(wěn)定沉默CHIP及對(duì)照細(xì)胞小鼠皮下移植瘤體積及重量檢測(cè)(**代表 ρ〈0· 01)。
[0042] 圖26顯示了穩(wěn)定過表達(dá)CHIP及對(duì)照細(xì)胞小鼠皮下移植瘤體積及重量檢測(cè)(**代 表 ρ〈0· 01)。
[0043] 圖27顯示了厄洛替尼干預(yù)穩(wěn)定沉默CHIP及對(duì)照細(xì)胞小鼠皮下移植瘤的體積及重 量檢測(cè)(*代表P〈〇. 05)。
[0044] 圖28顯示了厄洛替尼干預(yù)穩(wěn)定過表達(dá)CHIP及對(duì)照細(xì)胞小鼠皮下移植瘤的體積及 重量檢測(cè)0*代表ρ〈〇· 01)。
[0045] 圖29顯示了沉默CHIP組及其對(duì)照的免疫組化研究和Ki67表達(dá)水平(X 400, *代 表 ρ〈0· 05)。
[0046] 圖30顯示了過表達(dá)CHIP組及其對(duì)照的免疫組化研究和Ki67表達(dá)水平(X 400, * 代表 ρ〈〇· 05)。
[0047] 圖31顯示了同一組織切片不同蛋白的表達(dá)差異檢測(cè)(Χ400)。
[0048] 圖32顯示了厄洛替尼誘導(dǎo)穩(wěn)定沉默CHIP組和對(duì)照組切斷的半胱天冬酶-3表達(dá) 水平檢測(cè)(X 400)。
[0049] 圖33顯示了厄洛替尼誘導(dǎo)穩(wěn)定過表達(dá)CHIP組和對(duì)照組切斷的半胱天冬酶-3表 達(dá)檢測(cè)(X 400)。
[0050] 圖34顯示了脾臟注射穩(wěn)定CHIP沉默和對(duì)照組細(xì)胞后肝轉(zhuǎn)移情況。
[0051] 圖35顯示了脾臟注射穩(wěn)定CHIP過表達(dá)和對(duì)照組細(xì)胞后肝轉(zhuǎn)移情況。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 本發(fā)明首先通過構(gòu)建和CHIP及EGFR相關(guān)質(zhì)粒進(jìn)行胰腺癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染,觀察 CHIP表達(dá)水平與胰腺癌細(xì)胞株的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究,了解CHIP水平的改變是 否影響胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為;其次觀察胰腺癌細(xì)胞株中CHIP與其靶蛋白EGFR的相關(guān) 性,了解其磷酸化位點(diǎn)與CHIP的相互作用,并觀察CHIP對(duì)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路激活的影響; 通過小鼠移植瘤模型進(jìn)一步觀察小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況,并觀察CHIP是否對(duì)靶 向藥物誘導(dǎo)的組織或細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用;最后通過收集組織和血標(biāo)本和病例資料,觀察 CHIP在腫瘤組織和血中的表達(dá)水平,觀察其對(duì)患者預(yù)后的影響,為尋找新的早期診斷和治 療靶點(diǎn),改善胰腺癌治療效果提供一個(gè)新的思路。
[0053] 本發(fā)明通過慢病毒載體將CHIP的microRNA (作為RNAi)或CHIP基因插入胰腺癌 細(xì)胞株P(guān)anc-l、BxpC-3、SW1990中,建立穩(wěn)定沉默或穩(wěn)定過表達(dá)CHIP的胰腺癌細(xì)胞株。
[0054] 本發(fā)明通過CCK-8法觀察CHIP沉默或過表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖水平的影響。
[0055] 本發(fā)明通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CHIP沉默或過表達(dá)對(duì)靶向藥物厄洛替尼誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡的影響;通過Transwell小室檢測(cè)CHIP沉默或過表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的影響。
[0056] 本發(fā)明通過免疫共沉淀技術(shù)尋找CHIP的靶蛋白,通過時(shí)間依賴梯度觀察CHIP對(duì) 革巴蛋白表達(dá)水平的影響;通過蛋白電泳和Western blot檢測(cè)CHIP蛋白對(duì)腫瘤相關(guān)信號(hào)通 路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響。
[0057] 本發(fā)明通過建立小鼠皮下移植瘤模型觀察CHIP蛋白沉默或過表達(dá)對(duì)小鼠成瘤的 影響,觀察CHIP蛋白沉默或過表達(dá)對(duì)厄洛替尼誘導(dǎo)腫瘤組織凋亡的影響;通過胰腺癌細(xì)胞 脾臟注射肝轉(zhuǎn)移模型觀察CHIP蛋白沉默或過表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響;通過免疫 組化觀察腫瘤組織中CHIP蛋白和靶蛋白表達(dá)水平的差異。
[0058] 本發(fā)明通過免疫組化研究明確CHIP蛋白在胰腺癌患者組織中的表達(dá)水平及其對(duì) 患者預(yù)后的影響,通過ELISA法檢測(cè)人CHIP蛋白在腫瘤患者血清中的表達(dá)水平,評(píng)估其作 為鑒別診斷及判斷預(yù)后的價(jià)值。
[0059] 本發(fā)明中術(shù)語的"細(xì)胞凋亡"是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞自主的有 序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用。細(xì)胞凋亡首先出現(xiàn)的是細(xì) 胞體積縮小、連接消失,然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加,通透性改變,核質(zhì)濃縮,核膜核仁破碎,DNA 降解成為約180bp-200bp片段;胞膜有小泡狀形成,膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面,胞 膜結(jié)構(gòu)仍然完整,最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為多個(gè)凋亡小體。Annexin V作為一種磷 脂結(jié)合蛋白,可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。由于本實(shí) 驗(yàn)所采用的胰腺癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染質(zhì)?;虿《疽院缶磉_(dá)綠色熒光蛋白,因此常用的FITC染 料作為熒光探針可和綠色熒光蛋白互相產(chǎn)生干擾;因此本實(shí)驗(yàn)改用PE的Annexin V作為熒 光探針,可以有效避開綠色熒光波長(zhǎng)從而檢測(cè)到早期凋亡事件。7-AAD是一種核酸染料,在 合適的膜通透性情況下,7-AAD可以與細(xì)胞核的核酸結(jié)合,在合適波長(zhǎng)激發(fā)光的激發(fā)下可發(fā) 出明亮的紅色熒光,7-AAD可與Annexin V-PE聯(lián)合使用。
[0060] 本文中的半胱天冬酶是一組天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶,它們?cè)诘蛲鲋邪l(fā)揮 重要作用。一般來說,哺乳動(dòng)物的半胱天冬酶可根據(jù)功能分為三類類:細(xì)胞因子激活(包 括半胱天冬酶sl、4、5、13),凋亡起始(包括半胱天冬酶s2、8、9、10)和凋亡執(zhí)行(包括半 胱天冬酶s3、6、7)。其中半胱天冬酶-3/7的被剪切形成激活體則代表凋亡已經(jīng)不可逆轉(zhuǎn)。 本實(shí)驗(yàn)采用的半胱天冬酶-3/7凋亡檢測(cè)方法是一種均質(zhì)發(fā)光檢測(cè)方法,半胱天冬酶-3/7 在細(xì)胞凋亡過程中如果被激活形成剪切體后,即可剪切試劑盒中的底物Z-DEVD-氨基螢光 素,該底物本身并不發(fā)光,但是如果被剪切后釋放出氨基螢光素,即可產(chǎn)生由重組螢光素酶 生成的輝光型發(fā)光信號(hào)(Luminescence)。該信號(hào)可以被輝光接收儀器檢測(cè)到,其發(fā)光強(qiáng)度 與存在的半胱天冬酶-3/7活性成正比,通過檢測(cè)輝光強(qiáng)度即可判斷半胱天冬酶-3/7激活 成分的含量。
[0061] 本發(fā)明中涉及的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移檢測(cè)是應(yīng)用Transwell小室,其是一種可放置在 孔板中的小室,其小室底部底為聚碳酸酯膜,進(jìn)行侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的膜為含8um小孔的膜,小 室內(nèi)稱上室,培養(yǎng)皿內(nèi)稱下室,通常下室內(nèi)放入含趨化因子或高濃度營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基,而 將細(xì)胞接種在上室內(nèi)。由于聚碳酸酯膜具有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室 內(nèi)的細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室移動(dòng)。對(duì)于腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)需要預(yù)先在小室內(nèi)膜 鋪上一層基質(zhì)膠以模仿細(xì)胞外基質(zhì),腫瘤細(xì)胞需要把基質(zhì)消化后才可以從低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基跑 到高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中,最后通過檢測(cè)小室膜的外側(cè)面細(xì)胞數(shù)量即可明確細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能 力。
[0062] 文中的BCA(Bicinchoninic acid)法是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理是 在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cul+。BCA與Cul+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫 藍(lán)色復(fù)合物,在562nM處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比,據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 BCA蛋白測(cè)定方法靈敏度高,操作簡(jiǎn)單,試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳,而且不易 受去垢劑的影響。
[0063] 本發(fā)明涉及的SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)是目前最常用 的分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵,破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié) 構(gòu),蛋白質(zhì)同SDS分子按比例結(jié)合,形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,這種復(fù)合物由于結(jié) 合大量的SDS,使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子 團(tuán)塊,從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異,由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合 是按重量成比例的,因此在進(jìn)行電泳時(shí),蛋白質(zhì)分子的遷移速度僅取決于分子大小,因此可 以根據(jù)蛋白分子量大小將不同的蛋白拉出不同的梯度進(jìn)而檢測(cè)。
[0064] Western blot即蛋白質(zhì)印跡。被檢測(cè)物是蛋白質(zhì),"探針"是抗體,"顯色"用標(biāo)記 的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如PVDF薄膜)上,固相載體以非 共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體 上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與辣根過氧化物酶或同位素標(biāo) 記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá) 的蛋白成分。發(fā)光值得高低反映蛋白濃度的高低水平。
[0065] 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合 以及細(xì)菌的Protein A或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象開發(fā)出來的方法。 其基本原理是,在細(xì)胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體,孵育后再加入結(jié)合于Agarose珠 上的Protein A或G,抗體的Fc片段即和protein A/G上,若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目 的蛋白,就可以形成這樣一種復(fù)合物:"目的蛋白一興趣蛋白一抗興趣蛋白抗體一Protein A或G",經(jīng)變性聚丙烯凝膠電泳,復(fù)合物又被分開。然后經(jīng)Western blot檢測(cè)目的蛋白。這 種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的,符合體內(nèi)實(shí)際情況,得到的結(jié) 果可信度高。應(yīng)該注意的是,細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋 白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用,一般多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100),同時(shí)應(yīng)提高相 應(yīng)的鹽濃度以去除較多的非特異雜帶。
[0066] 熒光免疫是根據(jù)抗原抗體反應(yīng),先將已知抗體標(biāo)記熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用 這種熒光抗體作為分子探針檢測(cè)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原。在細(xì)胞或組織中形成抗原抗體 復(fù)合物上含有突光素,利用突光顯微鏡觀察標(biāo)本,突光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的突 光,從而確定抗原的性質(zhì),定位,以及利用定量技術(shù)測(cè)定抗原在細(xì)胞或組織中的含量。
[0067] ELISA檢測(cè)人血清中的CHIP表達(dá)水平是結(jié)合在固相載體(如96孔板)表面的抗體 仍保持其免疫活性,受檢標(biāo)本中的抗原可以與固相載體表面的抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng),用 洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體符合物與液體中的其他物質(zhì)分開,再加入酶標(biāo)記 的抗體,使之也通過反應(yīng)而結(jié)合在固體載體上。此時(shí)固相上的酶含量即與標(biāo)本中受監(jiān)測(cè)物 質(zhì)的量呈正比,通過酶催化的底物顏色即可確定標(biāo)本中抗原的含量。
[0068] 實(shí)施例1 :質(zhì)粒構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立
[0069] 本實(shí)施例涉及構(gòu)建實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒,包括CHIP沉默所需microRNA質(zhì)粒、CHIP過表 達(dá)質(zhì)粒(CHIP° E)、CHIP的截段體質(zhì)粒(u-box質(zhì)粒和TPR質(zhì)粒)、構(gòu)建CHIP沉默和過表達(dá)的 慢病毒載體,以及構(gòu)建EGFR質(zhì)粒;將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或感染到胰腺癌細(xì)胞中建立瞬時(shí)或穩(wěn)定 表達(dá)/沉默細(xì)胞株,并對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的一些和CHIP可能的靶蛋白進(jìn)行初步的篩選和檢測(cè)。
[0070] 1. 1實(shí)驗(yàn)材料
[0071] 細(xì)胞株:本實(shí)驗(yàn)時(shí)所用細(xì)胞株為人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-l,BXpc-3和SW1990。均由 德國(guó)海德堡大學(xué)Freiss. Η教授惠贈(zèng),本實(shí)驗(yàn)室液氮保存。
[0072] 實(shí)驗(yàn)所用載體
[0073] microRNA干擾質(zhì)粒載體
[0074] 建立CHIP的干擾質(zhì)粒所需載體使用的是microRNA表達(dá)載體pcDNATM6. 2-GW/ EmGFPmiR中(Invitrogen,Catalog no. K4936-00,如圖1),該載體含壯觀霉素基因,質(zhì)粒擴(kuò) 增過程中可選壯觀霉素作為大腸桿菌篩選抗生素。篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的時(shí)候,可使用殺稻瘟菌 素作為篩選抗生素。插入序列位于BamH I和Bgl II兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。
[0075] CHIP過表達(dá)或截段體所需質(zhì)粒載體
[0076] 構(gòu)建CHIP過表達(dá)質(zhì)粒所需載體使用的是pcDNA3. 1 (+)載體(Invitrogen,V79020, 圖2)。該載體具有氨芐抗性,質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)可以可用氨芐青霉素作為大腸桿菌篩選抗生素。 篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的時(shí)候可用新霉素作為篩選抗生素。插入序列位于BamH I和Xho I兩個(gè) 酶切位點(diǎn)之間。
[0077] 慢病毒所需載體
[0078] 構(gòu)建慢病毒所需載體為 pLenti6. 2/V5-DEST(Invitrogen,編號(hào) V36820,圖 3)。該 載體具有氨芐抗性,質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)可以可用氨芐青霉素作為大腸桿菌篩選抗生素。篩選穩(wěn)定 細(xì)胞株的時(shí)候可用殺稻瘟菌素作為篩選抗生素。插入序列位于Nhe I和BamH I兩個(gè)酶切 位點(diǎn)之間。
[0079] 含標(biāo)簽載體
[0080] 構(gòu)建含F(xiàn)lag標(biāo)簽的CHIP或構(gòu)建含His標(biāo)簽的CHIP質(zhì)粒所需載體使用的是 pReceiver-M01/Mll載體(GeneCopoeia,V79020,圖4)。該載體具有氨節(jié)抗性,質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí) 可以可用氨芐青霉素作為大腸桿菌篩選抗生素。篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的時(shí)候可用新霉素作為篩 選抗生素。插入序列位于BamH I和Xho I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。(圖4)
[0081] 插入序列基因片段
[0082] CHIP的microRNA寡聚單鏈DNA序列,共4條作為可選microRNA
[0083]

【權(quán)利要求】
1. 一種CHIP蛋白在制備用于治療胰腺癌的藥物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的CHIP蛋白用于抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵 襲和轉(zhuǎn)移。
3. -種CHIP蛋白在制備增強(qiáng)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡中的用途。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的用途,其中所述的抗腫瘤藥物是厄洛替尼。
5. -種編碼CHIP蛋白的DNA序列在制備用于治療胰腺癌的藥物中的用途。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的用途,其中所述的編碼CHIP蛋白的DNA序列如SEQ ID NO :11所 /_J、1 〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6的用途,其中編碼CHIP蛋白的DNA序列用于抑制胰腺癌細(xì)胞的 增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。
8. -種編碼CHIP蛋白的DNA序列在制備增強(qiáng)抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡中的用途。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途,其中所述的抗腫瘤藥物是厄洛替尼。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104138593SQ201310170896
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月10日
【發(fā)明者】趙玉沛, 張?zhí)? 王天笑, 由磊, 周立, 廖泉, 戴夢(mèng)華, 舒紅, 徐建威, 李建, 曹喆 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院
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