本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種基于微流控芯片的蛋白質(zhì)小分子富集-檢測的系統(tǒng)及方法。

背景技術(shù)：

微流控芯片技術(shù)，是通過微尺度下流體的控制，將生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程中的樣品制備、富集、反應(yīng)、分離、檢測單元集成至芯片上，以達(dá)到自動分析目的的一種技術(shù)手段，已成為當(dāng)今世界最前沿的科技技術(shù)之一，具有小型化、微型化，液體流體可控，消耗試劑少，分析速度快，易于集成化規(guī)?；忍攸c(diǎn)。免疫層析試紙條是一種快速、便捷、可視化的檢測手段，利用微流控芯片技術(shù)結(jié)合免疫層析試紙條實現(xiàn)細(xì)胞因子的便攜、自動化檢測，能夠廣泛的應(yīng)用于疾病診斷、藥物篩選、航天等相關(guān)領(lǐng)域。

目前，如細(xì)胞因子這樣的蛋白質(zhì)小分子的檢測方法主要有elisa、免疫熒光檢測、免疫電化學(xué)檢測、表面等離子共振等，這些方法均涉及抗體孵育、樣品孵育、標(biāo)記以及許多洗脫的步驟，操作繁瑣，難以達(dá)到快速、簡便的檢測，并且難以在空間和設(shè)備有限的條件下進(jìn)行檢測。

但目前免疫層析試紙條的檢測限通常在幾十ng/ml，靈敏度不足，難以檢測水平較低的細(xì)胞因子。超順磁納米顆粒(superparamagneticnanobead,spmnb)是一種新興的納米材料，具有良好的磁學(xué)性質(zhì)和磁分離特性，在磁場存在下可被固定，而撤銷磁場時又能快速重懸，分散于溶液中。利用修飾相應(yīng)的細(xì)胞因子抗體的超順磁納米顆粒，可以簡便的實現(xiàn)細(xì)胞因子的富集和免疫層析試紙的快速、可視化檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)上的問題，本發(fā)明提供了一種基于微流控芯片的蛋白質(zhì)小分子富集-檢測的系統(tǒng)及方法，集成了磁免疫層析試紙條技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，具有快速、可視化、靈敏度高和自動化的優(yōu)點(diǎn)，能夠直接對液態(tài)待測樣品中的目標(biāo)小分子蛋白進(jìn)行富集、檢測，實現(xiàn)低水平目標(biāo)蛋白的檢測與分析。

本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種基于微流控芯片的蛋白質(zhì)小分子富集-檢測的系統(tǒng)，包括富集單元、檢測單元和液路單元，所述富集單元在富集芯片上涂布納米顆粒與目標(biāo)小分子蛋白質(zhì)單克隆抗體的偶聯(lián)物，檢測液中的目標(biāo)小分子蛋白質(zhì)與所述單克隆抗體特異性結(jié)合，富集在所述富集芯片表面；

所述檢測單元在檢測芯片上按檢測液流向先后設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線上包被有目標(biāo)小分子蛋白的多克隆抗體，當(dāng)檢測液中的目標(biāo)小分子蛋白與所述多克隆抗體結(jié)合后，檢測線處顯色，目標(biāo)小分子蛋白被檢出；所述質(zhì)控線上包被與所述單克隆抗體特異性結(jié)合的二抗抗體，當(dāng)檢測液中所述偶聯(lián)物的單克隆抗體抗體與所述二抗抗體結(jié)合，質(zhì)控線處顯色，效驗檢測過程是否有效；

所述液路系統(tǒng)將所述富集單元連接在所述檢測單元上游，通過液路系統(tǒng)中檢測液管路的變換連接，選擇性地控制檢測液通過富集單元、檢測單元和廢液池。

進(jìn)一步地，所述富集單元由富集芯片和納米顆粒與單克隆抗體的偶聯(lián)物組成，納米顆粒與單克隆抗體的偶聯(lián)物涂布在富集芯片表面，所述富集芯片由下至上依次設(shè)有富集芯片下層底板、連接層、中層通道層、上層連接層和上層蓋板，富集芯片表面還設(shè)有富集芯片接頭用于與液路系統(tǒng)的管路連接，使檢測液在富集芯片中層通道層流過，納米顆粒與單克隆抗體的偶聯(lián)物也置于中層通道層。

進(jìn)一步地，所述納米顆粒為超順磁納米顆粒，所述超順磁納米顆粒的直徑為100-300nm，在富集芯片上的添加密度為12-20ug/mm3，厚度為0.3-0.7mm；

在富集芯片表面還設(shè)有磁片，所述磁片貼緊在富集芯片下表面時用于將所述超順磁納米顆粒與單克隆抗體偶聯(lián)物固定在富集芯片上，在所述磁盤下方還設(shè)有電磁閥，所述電磁閥控制所述磁片與富集芯片的貼近與遠(yuǎn)離。

進(jìn)一步地，所述磁片與富集芯片遠(yuǎn)離距離大于3mm，在富集芯片接頭上方還設(shè)有固定蓋板，富集芯片接頭與富集芯片固定蓋板的縫隙間填充環(huán)氧樹脂膠。

進(jìn)一步地，所述檢測單元上之下依次由檢測芯片、led燈、檢測鏡頭、檢測鏡頭可見光傳感器組成，led燈照射在檢測芯片上，所述檢測線或質(zhì)控線上的顯色線條被檢測鏡頭捕捉，通過所述可見光傳感器對數(shù)據(jù)進(jìn)行傳輸；

所述檢測芯片由下至上依次設(shè)有檢測芯片下層底板、下層連接層、中層通道層、上層連接層、蛋白質(zhì)持留膜和上層蓋板，檢測芯片表面還設(shè)有檢測芯片接頭用于與液路系統(tǒng)的管路連接，檢測液從中層通道層流過，檢測線和質(zhì)控線設(shè)置在硝酸纖維素膜層上。

進(jìn)一步地，所述檢測鏡頭的頂端距離所述檢測芯片下表面的距離為60-80mm，在檢測芯片接頭上方還設(shè)有固定蓋板，檢測芯片接頭與檢測芯片固定蓋板的縫隙間填充環(huán)氧樹脂膠。

進(jìn)一步地，所述蛋白質(zhì)持留膜為硝酸纖維素膜、pvdv膜或尼龍膜。

進(jìn)一步地，所述液路單元由管路、三通閥和廢液池組成，所述三通閥設(shè)有一個進(jìn)口端和兩個出口端，所述進(jìn)口端與富集單元連接，第一出口端連連接檢測單元，第二出口段連接廢液池；所述三通閥通電時，進(jìn)口端與第二出口端相連通，檢測液通過富集單元、三通閥到達(dá)廢液池；所述三通閥斷電時，進(jìn)口端與第一出口端連通，檢測液通過富集單元、三通閥和檢測單元到達(dá)廢液池。

進(jìn)一步地，還包括控制單元，所述控制單元控制所述富集單元的電磁閥和液路單元的三通閥的通斷，來控制檢測液的富集或檢測進(jìn)程。

蛋白質(zhì)小分子富集-檢測系統(tǒng)的控制單元完成以下工作步驟：

步驟一微處理器控制電磁閥斷電，三通閥供電，檢測液在富集單元進(jìn)行蛋白質(zhì)小分子富集；

步驟二微處理器定時器完成富集預(yù)設(shè)時間后，微處理器控制電磁閥通電，三通閥斷電，超順磁納米顆粒與單克隆抗體偶聯(lián)物到底檢測芯片，微處理器定時器開始進(jìn)行檢測計時，在檢測期間，每間隔一定預(yù)設(shè)時間，微處理器控制可見光傳感器進(jìn)行圖像拍攝、傳輸；

步驟三微處理器定時器完成檢測預(yù)設(shè)時間后，檢測液流至廢液池。

進(jìn)一步地，所述蛋白質(zhì)小分子為白細(xì)胞介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、趨化因子、生長因子。

一種蛋白質(zhì)小分子富集-檢測的系統(tǒng)的檢測方法，包括以下步驟：

步驟一制備富集芯片，將超順磁納米顆粒懸浮液洗滌、活化，將超順磁納米顆粒與目標(biāo)小分子蛋白質(zhì)單克隆抗體混合、偶聯(lián)，對偶聯(lián)物液體進(jìn)行封閉、保存，在偶聯(lián)物液體中繼續(xù)添加超順納米顆粒，混合后添加在富集芯片的中層通道層，富集芯片與液路系統(tǒng)管路連接；

步驟二對檢測芯片的硝酸纖維素膜進(jìn)行包被，在檢測線上包被目標(biāo)小分子蛋白的多克隆抗體，在質(zhì)控線上包被與單克隆抗體特異性結(jié)合的二抗抗體，檢測線與質(zhì)控線之間設(shè)有間隔，檢測芯片與液路系統(tǒng)管路連接；

步驟三富集階段，電磁閥斷電，三通閥供電，電磁片緊貼在富集芯片，內(nèi)部超順磁納米顆粒與目標(biāo)小分子蛋白質(zhì)單克隆抗體的偶聯(lián)物固定在富集芯片上，檢測液流經(jīng)富集芯片，目標(biāo)小分子蛋白質(zhì)與抗體結(jié)合連接在磁納米顆粒上，檢測液通過液路單元流向廢液池；

步驟四檢測階段，電磁閥供電，三通閥斷電，電磁片遠(yuǎn)離富集芯片，檢測液從富集單元通過液路系統(tǒng)流到檢測單元，超順磁納米顆粒與目標(biāo)小分子蛋白質(zhì)單克隆抗體抗體的偶聯(lián)物達(dá)到檢測芯片表面，通過檢測單元形成影像拍攝、傳輸，完成檢測，檢測液再通過液路單元流向廢液池。

采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、該本發(fā)明可以完成液體中目標(biāo)生物小分子蛋白質(zhì)的富集，隨后將富集后的蛋白質(zhì)隨液體帶到檢測芯片處進(jìn)行目標(biāo)蛋白檢測，基于芯片技術(shù)將富集、檢測過程集成在一起，高效、精準(zhǔn)，本系統(tǒng)檢測目標(biāo)蛋白小分子的靈敏度優(yōu)于傳統(tǒng)試紙條檢測。

2、本發(fā)明的系統(tǒng)具有一定的抗震能力，能適應(yīng)地面常規(guī)環(huán)境，同時適應(yīng)空間微重力環(huán)境，可使用在空間環(huán)境下。

3、本發(fā)明的系統(tǒng)降低了在空間等特殊環(huán)境下目標(biāo)細(xì)胞因子等小分子蛋白的富集及檢測的成本，同時系統(tǒng)長時間工作下功耗低，節(jié)約了太空空間資源以及電力資源。

4、本發(fā)明的系統(tǒng)可遠(yuǎn)程操作，也可自動化完成，可以節(jié)省大量的人力資源。

附圖說明

圖1是本發(fā)明基于微流控芯片的蛋白質(zhì)小分子富集-檢測的系統(tǒng)的檢測液流向控制圖；

圖2是本發(fā)明蛋白質(zhì)小分子富集-檢測的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是實施例中富集芯片結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是實施例中檢測芯片結(jié)構(gòu)示意圖。

其中，1-管路、2-富集芯片接頭、3-富集芯片固定蓋板、4-富集芯片、5-磁片、6-電磁閥、7-系統(tǒng)支架、8-檢測芯片接頭、9-三通閥、10-檢測芯片固定蓋板、11-檢測芯片、12-led燈、13-廣角鏡頭、14-檢測鏡頭加固支架、15-面陣可見光傳感器、16-富集芯片上層蓋板、17-富集芯片連接層、18-富集芯片中層通道層、19-富集芯片連接層、20-富集芯片下層底板、21-檢測芯片上層pet蓋板、22-檢測芯片連接層、23-檢測芯片中層通道層、24-檢測芯片連接層、25-檢測芯片下層底板、26-硝酸纖維素膜。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的結(jié)構(gòu)圖及具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實施例1

本發(fā)明提供了一種基于微流控芯片的蛋白質(zhì)小分子富集-檢測的系統(tǒng)，包括富集單元、檢測單元和液路單元，如圖2所示，富集單元在富集芯片4上涂布納米顆粒與目標(biāo)小分子蛋白質(zhì)單克隆抗體的偶聯(lián)物，檢測液中的目標(biāo)小分子蛋白質(zhì)與所述單克隆抗體特異性結(jié)合，富集在所述富集芯片表面。

檢測單元在檢測芯片11上按檢測液流向先后設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，檢測線上包被有目標(biāo)小分子蛋白的多克隆抗體，當(dāng)檢測液中的目標(biāo)小分子蛋白與所述多克隆抗體結(jié)合后，檢測線處顯色，目標(biāo)小分子蛋白被檢出；質(zhì)控線上包被與單克隆抗體(一抗)特異性結(jié)合的二抗抗體，當(dāng)檢測液中偶聯(lián)物的一抗與二抗抗體結(jié)合，質(zhì)控線處顯色，效驗檢測過程是否成功。

液路系統(tǒng)將所述富集單元連接在檢測單元上游，通過液路系統(tǒng)中的三通閥改變檢測液管路的流通位置，選擇性地控制檢測液通過富集單元、檢測單元和廢液池。

三通閥設(shè)有一個進(jìn)口端和兩個出口端，所述進(jìn)口端與富集單元連接，第一出口端連連接檢測單元，第二出口段連接廢液池；三通閥通電時，進(jìn)口端與第二出口端相連通，檢測液通過富集單元、三通閥到達(dá)廢液池；所述三通閥斷電時，進(jìn)口端與第一出口端連通，檢測液通過富集單元、三通閥和檢測單元到達(dá)廢液池。廢液池設(shè)有兩個端口分別可與檢測單元和三通閥連接，三通閥斷電時，從檢測單元流出的檢測液到達(dá)廢液池。

圖4為檢測芯片結(jié)構(gòu)示意圖，如圖2和4所示，檢測單元上之下依次由檢測芯片11、led燈12、廣角鏡頭13、檢測鏡頭加固支架14、面陣可見光傳感器15組成，led燈照射在檢測芯片上，檢測線或質(zhì)控線上的顯色線條被檢測鏡頭捕捉，通過面陣可見光傳感器對圖像進(jìn)行采集和傳輸。

檢測芯片由下至上依次設(shè)有檢測芯片下層底板25、下層連接層24、中層通道層23、上層連接層22、硝酸纖維素膜層26和上層蓋板21，檢測芯片表面還設(shè)有檢測芯片接頭8用于與液路系統(tǒng)的管路連接，檢測液從中層通道層流過，檢測線和質(zhì)控線設(shè)置在硝酸纖維素膜層上，檢測鏡頭的頂端距離所述檢測芯片下表面的距離為60-80mm。

液路單元由管路1、三通閥9和廢液池組成，三通閥通電狀態(tài)下的液路出口通過管路連接到廢液池，三通閥斷電狀態(tài)下的液路出口通過管路連接到檢測單元，檢測單元再通過管路連接到廢液池。

優(yōu)選地，在檢測芯片接頭上方還設(shè)有固定蓋板，檢測芯片接頭與檢測芯片固定蓋板的縫隙間填充環(huán)氧樹脂膠。

目標(biāo)小分子蛋白的富集、檢測過程集成在同一系統(tǒng)中，簡化了操作步驟，能夠高效地完成大通量的樣品檢測。

實施例2

為了實現(xiàn)納米顆粒從富集單元流向檢測單元，本實施例提供了一種示例，如圖1、3所示，富集單元由富集芯片和納米顆粒與單克隆抗體的偶聯(lián)物組成，納米顆粒選用超順磁納米顆粒，直徑為100-300nm，超順磁納米顆粒的直徑為100-300nm，在富集芯片上的添加密度為12-20ug/mm3，厚度為0.3-0.7mm。

超順磁納米顆粒與目標(biāo)小分子蛋白的單克隆抗體的偶聯(lián)物涂布在富集芯片表面，富集芯片由下至上依次設(shè)有富集芯片下層底板20、下層連接層19、中層通道層18、上層連接層17和上層蓋板16，富集芯片表面還設(shè)有富集芯片接頭用于與液路系統(tǒng)的管路連接，使檢測液在富集芯片中層通道層流過。

磁片5貼緊在富集芯片下表面時用于將超順磁納米顆粒與單克隆抗體偶聯(lián)物固定在富集芯片上，在磁盤下方還設(shè)有電磁閥6，電磁閥控制磁片與富集芯片的貼近與遠(yuǎn)離，磁力法通電后磁片與富集芯片遠(yuǎn)離距離要大于3mm。

在富集芯片接頭上方還設(shè)有固定蓋板，富集芯片接頭與富集芯片固定蓋板的縫隙間填充環(huán)氧樹脂膠。

實施例3

il-6的富集、檢測方法。

步驟一：制備超順磁納米顆粒-il-6抗體偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物用于目標(biāo)細(xì)胞因子白介素6-(il-6)的富集。具體制備方法如下：

a)選用直徑為100-300nm的商品化超順磁納米顆粒，取1mg磁顆粒到1.5ml離心管中，用500ulmest(ph6.0，0.05％tween20)洗滌3次，磁分離后移除上清；加入新配置的100uledc(5mg/ml)和100ulnhs(5mg/ml)溶液到裝有磁顆粒的離心管中，并加入300ulpbst溶液；4℃活化8h或25℃活化30～60min或37℃活化4～5h，該期間保持磁顆粒的懸浮狀態(tài)；離心管置于磁分離架上磁分離，移除上清，加入500ulmest，將磁顆粒移到新的離心管中，并使用500ulmest洗滌3次，磁分離后移除上清；

b)加入40ul(1mg/ml)的單克隆抗體到裝有磁顆粒的離心管中，并加入460ulpbst溶液，混勻磁顆粒和單克隆抗體；4℃偶聯(lián)8h或25℃偶聯(lián)4～5h或37℃偶聯(lián)3h，該期間保持磁顆粒的懸浮狀態(tài)；偶聯(lián)結(jié)束后，將離心管置于磁分離架上分離，移除上清；

c)加入500ulpbst(ph7.4，含1％bsa)重懸偶聯(lián)物；4℃封閉12～15h或25℃封閉1～2h或37℃封閉30min，該期間保持磁顆粒的懸浮狀態(tài)；封閉結(jié)束后，將離心管置于磁分離架上分離，移除上清；

d)使用500ulpbst洗滌3次，磁分離后移除上清；加入250ulpbst(ph7.4，含0.02％nan3，0.5％bsa)重懸，保存于4℃。

步驟二：上述步驟一最終重懸偶聯(lián)物中添加1mg超順磁納米顆粒，充分混勻后取100μl添加于富集芯片中，將帶接頭的富集芯片放置于磁片上，將富集系統(tǒng)與三通閥通過硅膠管路連接，將廢液池與三通閥通過硅膠管路連接。

步驟三：硝酸纖維素膜(nc膜)的包被，使用pbst緩沖液將il-6的多克隆抗體以及羊抗小鼠igg稀釋到0.5-2mg/ml濃度，使用定量噴液裝置分別將二者以0.4-0.8cm的間隔噴印于硝酸纖維素膜上，包被有il-6多克隆抗體處為檢測線t，包被有羊抗小鼠igg抗體處為質(zhì)控線c，晾干后于干燥處(濕度20％～40％)封存?zhèn)溆?，保存溫度?℃～25℃，避免陽光直射。

步驟四：取上述包被好抗體的硝酸纖維素膜放置于檢測芯片中，將帶有接頭的檢測芯片放置于檢測系統(tǒng)區(qū)域，將檢測芯片帶接頭進(jìn)口與三通閥通過硅膠管路連接，將檢測芯片帶接頭出口與廢液池通過硅膠管路連接。

步驟五：il-6的富集，系統(tǒng)處于富集狀態(tài)，通過控制系統(tǒng)實施如下過程，電磁閥不給予供電，三通閥給予供電，電磁片緊貼富集芯片，芯片內(nèi)部超順磁納米顆粒-抗體偶聯(lián)物固定。液體流經(jīng)富集芯片再到三通閥再到廢液池，整個液體流路不經(jīng)過檢測芯片，當(dāng)液體流經(jīng)富集芯片時，芯片內(nèi)部超順磁納米顆粒-抗體偶聯(lián)物將對液體中il-6進(jìn)行抓取，完成目標(biāo)細(xì)胞因子的富集。

步驟六：il-6的檢測，系統(tǒng)處于檢測狀態(tài)，通過控制系統(tǒng)實施如下，電磁閥給予供電，三通閥斷電，電磁片遠(yuǎn)離富集芯片，芯片內(nèi)部超順磁納米顆粒-抗體偶聯(lián)物不固定。液體流經(jīng)富集芯片再到三通閥到檢測芯片最后到廢液池，當(dāng)液體流經(jīng)富集芯片時將已抓取富集目標(biāo)il-6的超順磁納米顆粒-抗體偶聯(lián)物帶走并到達(dá)后續(xù)的檢測芯片，完成目標(biāo)il-6的檢測。

又例如，對細(xì)胞培養(yǎng)液中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(mcp-1)的富集與檢測。

除去步驟一中偶聯(lián)抗體為mcp-1小鼠單克隆抗體，步驟三中檢測線t包被的是mcp-1多克隆抗體，其余步驟同實施例1。

實施例4

本發(fā)明的富集-檢測系統(tǒng)運(yùn)行過程可以通過控制單元自動控制，優(yōu)選地，本發(fā)明的系統(tǒng)還包括控制單元，控制單元控制富集單元的電磁閥和液路單元的三通閥的通斷，從而控制檢測液的富集或檢測的進(jìn)程。

控制單元完成以下工作步驟：

步驟一微處理器控制電磁閥斷電，三通閥供電，檢測液在富集單元進(jìn)行蛋白質(zhì)小分子富集；

步驟二微處理器定時器完成富集預(yù)設(shè)時間(例如72h)后，微處理器控制電磁閥通電，三通閥斷電，超順磁納米顆粒與單克隆抗體偶聯(lián)物到底檢測芯片，微處理器定時器開始進(jìn)行檢測計時，在檢測期間，每間隔一定預(yù)設(shè)時間(例如5min)，微處理器控制可見光傳感器進(jìn)行圖像拍攝、傳輸，拍攝固定次數(shù)(例如5次)；

步驟三微處理器定時器完成檢測預(yù)設(shè)時間(例如30min)后，檢測液流至廢液池。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。