本申請(qǐng)屬于體外診斷和微流控技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種細(xì)胞分離制片染色一體裝置和循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法。

背景技術(shù)：

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells,ctcs)是指從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散進(jìn)入外周循環(huán)血液系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞，它的出現(xiàn)標(biāo)志著腫瘤細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始從病灶組織向四周擴(kuò)散，從而可能導(dǎo)致更多器官組織產(chǎn)生病變。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞可在腫瘤發(fā)生的早期出現(xiàn)，且研究表明約90％的癌癥死亡案例與ctcs擴(kuò)散有關(guān)，因此，ctcs檢測(cè)在重大疾病的早期預(yù)防、治療效果評(píng)估、藥物敏感性測(cè)試及腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面具有十分重要的意義。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的最大難題在于其數(shù)量極少：通常在臨床上，人們研究的對(duì)象是一個(gè)非齊性總體，其中包含了大量的細(xì)胞信息，而ctcs對(duì)人體正常血細(xì)胞的比例僅約為1:109，或在1ml血液中僅有1～100個(gè)ctcs,因此在檢測(cè)前必須對(duì)其進(jìn)行分選富集，以去除血液中的大部分紅細(xì)胞和白細(xì)胞。

理想的ctcs分選應(yīng)能達(dá)到以下三點(diǎn)要求：首先要能將盡量多的非目標(biāo)細(xì)胞分離出去，其次要在特定的出口收集到盡量多的目標(biāo)細(xì)胞；最后要考慮到ctcs數(shù)量稀少導(dǎo)致需要處理的樣本量較大以及細(xì)胞活性等因素，要求能在短時(shí)間內(nèi)處理大量的樣品。

傳統(tǒng)的細(xì)胞分選多在宏觀(guān)尺度下進(jìn)行，如離心分選、化學(xué)溶解、基于熒光或磁珠技術(shù)的抗體標(biāo)記分選等，這些方法雖然成熟可靠，但系統(tǒng)復(fù)雜、操作繁瑣、需要樣品量大，在細(xì)胞轉(zhuǎn)移、容器更換及樣品化學(xué)處理等環(huán)節(jié)極易造成目標(biāo)細(xì)胞的損失，難以滿(mǎn)足上述三點(diǎn)分選要求。

目前唯一通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的用于血液中ctcs分選、計(jì)數(shù)的商業(yè)化產(chǎn)品，cellsearch采用外面包被了特異性抗體抗epcam(上皮細(xì)胞粘附因子)的免疫納米磁珠，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)，與血液中表達(dá)epcam的ctcs結(jié)合，并進(jìn)一步通過(guò)熒光反應(yīng)識(shí)別ctcs。該計(jì)數(shù)雖然擁有較高的靈敏度，但存在儀器及消耗的試劑昂貴，并且采用抗體捕獲細(xì)胞的局限性大，并不是所有的腫瘤細(xì)胞都表達(dá)epcam，檢測(cè)效率較低。

興起于20世紀(jì)90年代的微流控技術(shù)，通過(guò)微米級(jí)別的流道精確操控微升、毫升級(jí)別的樣品。得益于其特征尺寸與細(xì)胞尺寸正好匹配，微流控技術(shù)在細(xì)胞分選方面優(yōu)勢(shì)巨大。與常規(guī)分選方法相比，微流控器件具有消耗樣品量少，有較高的分辨精度及靈敏度、易于集成及微型化等優(yōu)點(diǎn)，且在微流控器件中可以連續(xù)地實(shí)現(xiàn)樣品注入-細(xì)胞分選-目標(biāo)細(xì)胞識(shí)別的整個(gè)過(guò)程，極大簡(jiǎn)化操作，并減少細(xì)胞損失。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞分離制片染色一體裝置和捕獲方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本申請(qǐng)實(shí)施例公開(kāi)一種細(xì)胞分離制片染色一體裝置，包括基材以及沿第一方向延伸于基材內(nèi)的溝道，所述溝通位于第一方向的兩端分別形成有樣品入口和樣品出口，所述溝道內(nèi)并列設(shè)置有n排微柱陣列，n≥2，每排所述微柱陣列沿第二方向延伸，所述第二方向垂直于所述第一方向，每排所述微柱陣列分別包括間隔設(shè)置的多個(gè)微柱，相鄰所述微柱之間形成有捕捉間隙，并滿(mǎn)足：

(a)、自樣品入口至樣品出口方向，第x排微柱陣列的捕捉間隙＞第x+1排微柱陣列的捕捉間隙，1≤x＜n；

(b)、第n排微柱陣列的捕捉間隙小于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的外徑。

優(yōu)選的，在上述的細(xì)胞分離制片染色一體裝置中，所述基材包括上下疊加設(shè)置的聚二甲基硅氧烷和標(biāo)準(zhǔn)載玻片，所述溝通形成于聚二甲基硅氧烷和標(biāo)準(zhǔn)載玻片之間。

相應(yīng)的，本申請(qǐng)還公開(kāi)了一種細(xì)胞分離制片染色一體裝置的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法，包括步驟：

(1)、采用紅細(xì)胞裂解液裂解腫瘤病人血樣中的紅細(xì)胞，離心吸取上清液，用細(xì)胞緩沖液重懸剩余細(xì)胞；

(2)、將獲得的細(xì)胞懸液從樣品入口通入微流控芯片中，將細(xì)胞固定液通入微流控芯片中，完成循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，步驟(1)中，所述的細(xì)胞裂解液為紅細(xì)胞裂解液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，細(xì)胞緩沖液為牛血清白蛋白和tewwn20的磷酸緩沖液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，細(xì)胞固定液為4％多聚甲醛水溶液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，還包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞熒光染色步驟：

(3)、將細(xì)胞透膜液通入微流控芯片中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透膜；將細(xì)胞清洗液通入微流控芯片，對(duì)透膜后的細(xì)胞進(jìn)行清洗；將免疫熒光染料通入微流控芯片中，避光孵育，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色；將細(xì)胞核染料通入微流控芯片中，靜置，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色；將細(xì)胞清洗液通入微流控芯片，對(duì)染色后的細(xì)胞進(jìn)行清洗。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，所述細(xì)胞透膜液為表面活性劑tritonx100水溶液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，所述細(xì)胞清洗液為磷酸緩沖液。

優(yōu)選的，在上述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲方法中，所述的免疫熒光染料為抗細(xì)胞角蛋白熒光染料；所述的細(xì)胞核染料為hoechst染料。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明采用微流控芯片技術(shù)，與傳統(tǒng)的方法相比具有消耗樣品量少、有較高的分辨精度及靈敏度、易于集成及微型化等優(yōu)點(diǎn)。另外基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞外形尺寸不同的特性進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲，并不依賴(lài)于epcam抗體的表達(dá)，可以識(shí)別所有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，避免假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本申請(qǐng)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本申請(qǐng)中記載的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中細(xì)胞分離制片染色一體裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2所示為圖1中a的放大示意圖；

圖3所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞抗細(xì)胞角蛋白染料表達(dá)陽(yáng)性的染色圖；

圖4所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核染料表達(dá)陽(yáng)性染色圖。

圖5所示為本發(fā)明具體實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞白細(xì)胞共同抗原染料表達(dá)陰性染色圖。

具體實(shí)施方式

循環(huán)腫瘤細(xì)胞：從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散進(jìn)入外周循環(huán)血液系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞。

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

結(jié)合圖1和圖2所示，細(xì)胞分離制片染色一體裝置，包括基材1以及沿第一方向延伸于基材內(nèi)的溝道2，溝通2位于第一方向的兩端分別形成有樣品入口3和樣品出口4，溝道2內(nèi)并列設(shè)置有n排微柱陣列5，n≥2，每排微柱陣列5沿第二方向延伸，第二方向垂直于第一方向，每排微柱陣列5分別包括間隔設(shè)置的多個(gè)微柱6，相鄰微柱6之間形成有捕捉間隙7，并滿(mǎn)足：

(a)、自樣品入口至樣品出口方向，第x排微柱陣列的捕捉間隙＞第x+1排微柱陣列的捕捉間隙，1≤x＜n；

(b)、第n排微柱陣列的捕捉間隙小于循環(huán)腫瘤細(xì)胞的外徑。

進(jìn)一步地，基材1包括上下疊加設(shè)置的聚二甲基硅氧烷(pdms)和標(biāo)準(zhǔn)載玻片，溝通形成于聚二甲基硅氧烷和標(biāo)準(zhǔn)載玻片之間。

該技術(shù)方案中，微流控芯片采用多段微住陣列結(jié)構(gòu)串聯(lián)而成，注入芯片中的細(xì)胞依據(jù)其自身尺寸的不同會(huì)在微柱陣列處被捕獲。同時(shí)提供的檢測(cè)試劑盒包括：紅細(xì)胞裂解液、細(xì)胞緩沖液、細(xì)胞固定液、細(xì)胞透膜液、細(xì)胞清洗液、免疫熒光染料、細(xì)胞核染料。檢測(cè)試劑盒主要用于血樣的前處理以及在微流控芯片中捕獲到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別。本案主要用于腫瘤的早期診斷、預(yù)后評(píng)估、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移檢測(cè)、快速判斷化療效果以及指導(dǎo)個(gè)體化醫(yī)療。

基于細(xì)胞分離制片染色一體裝置的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲和檢測(cè)方法，包括步驟：

1)、血樣的前處理：

a:腫瘤病人血樣為2ml人體外周血，采用紅細(xì)胞裂解液裂解腫瘤病人血樣中的紅細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液優(yōu)選為利用細(xì)胞內(nèi)外存在鹽離子濃度差而導(dǎo)致細(xì)胞膜脹破的原理來(lái)裂解無(wú)核紅細(xì)胞。

b：紅細(xì)胞裂解后離心吸取上清液。

c:紅細(xì)胞裂解不完全時(shí)重復(fù)上述步驟1-2次。

d:上清液去除后，試管底部剩余白細(xì)胞和癌細(xì)胞，用細(xì)胞緩沖液重懸剩余細(xì)胞，細(xì)胞緩沖液優(yōu)選為牛血清白蛋白(bsa)和tewwn20(非離子型去污劑)的磷酸緩沖液。

2)、微流控芯片捕獲癌細(xì)胞。

a:將上述獲得的細(xì)胞懸液按一定流速通入芯片中。

b:將細(xì)胞固定液通入芯片中，完成循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲，細(xì)胞固定液優(yōu)選為4％多聚甲醛水溶液。

3)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞熒光染色。

a:將細(xì)胞透膜液通入芯片中，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透膜，細(xì)胞透膜液優(yōu)選為表面活性劑tritonx100(非離子型表面活性劑)水溶液。

b:將細(xì)胞清洗液通入芯片，對(duì)透膜后的細(xì)胞進(jìn)行清洗，細(xì)胞清洗液優(yōu)選為磷酸緩沖液。

c:將免疫熒光染料通入芯片中，避光孵育，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，免疫熒光染料優(yōu)選為抗細(xì)胞角蛋白熒光染料。

d:將細(xì)胞核染料通入芯片中，靜置，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，細(xì)胞核染料優(yōu)選為hoechst染料。

f:將細(xì)胞清洗液通入芯片，對(duì)染色后的細(xì)胞進(jìn)行清洗。

g:在熒光顯微鏡下觀(guān)察。

圖3所示為本實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞抗細(xì)胞角蛋白染料表達(dá)陽(yáng)性的染色圖。

圖4所示為本實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核染料表達(dá)陽(yáng)性染色圖。

圖5所示為本實(shí)施例中被捕獲后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞白細(xì)胞共同抗原染料表達(dá)陰性染色圖。

只有當(dāng)抗細(xì)胞角蛋白染料和hoechst染料同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性，白細(xì)胞共同抗原染料表達(dá)陰性時(shí)，才能判定該細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

綜上所述，本案基于人體外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞間外形尺寸的差異，采用多段微住陣列結(jié)構(gòu)串聯(lián)而成的微流控芯片進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲。并采用免疫組化的方法對(duì)捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。

在此，還需要說(shuō)明的是，為了避免因不必要的細(xì)節(jié)而模糊了本發(fā)明，在附圖中僅僅示出了與根據(jù)本發(fā)明的方案密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)和/或處理步驟，而省略了與本發(fā)明關(guān)系不大的其他細(xì)節(jié)。

最后，還需要說(shuō)明的是，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒(méi)有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。