相關申請的交叉引用
本專利申請根據(jù)35u.s.c.§119(e)要求于2014年12月22日提交的,名稱為“capturesystemofcellsandmethods”的美國序列號62/095,179,以及于2015年12月21日提交的us14/976,071的權益,所述申請的內容以引用的方式全文并入本文。
本公開內容至少涉及細胞生物學、分子生物學、材料科學、細胞治療和醫(yī)學領域。本公開內容的某些實施例涉及用于捕獲所需細胞,并且任選地處理它們,包括用于體內遞送的系統(tǒng)。
背景技術:
人類的免疫系統(tǒng)可分為兩部分,迅速回應侵入物的主要部分的先天免疫系統(tǒng),以及能夠設計針對病原體侵入的非常特異性回應的適應性免疫系統(tǒng)。樹突狀細胞聯(lián)系這兩個系統(tǒng),并且是啟動針對侵入病原體的強烈應答的關鍵要素。單核細胞是能夠分化成各種細胞的多能細胞,所述各種細胞包括巨噬細胞和樹突狀細胞。一般而言,單核細胞以1000個細胞/μl的濃度存在于全血中。它們代表成人血液中存在的白血細胞的大約5%。
樹突狀細胞活化淋巴結中的t細胞。一旦被樹突狀細胞活化,t細胞就最有效地防御病原體,刺激免疫系統(tǒng)的其他部分,并且能夠大規(guī)模地特異性地殺死被感染的細胞。因此,適應性免疫系統(tǒng)的關鍵部分是t細胞被樹突狀細胞的活化。樹突狀細胞橋接先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng),吞噬侵入物以將其抗原呈遞給t細胞,并且活化它們以殺死被感染的細胞。
因為單核細胞可分化成對先天免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)有用的細胞,所以它們是影響個體免疫系統(tǒng)的強大工具。考慮到其在血液中相對較低的濃度,其以高得率的無害分離及其純度仍然是一個挑戰(zhàn)。因此,仍然存在提供分離單核細胞的更有效方法的持續(xù)需要,而無需求助于傳統(tǒng)的、效率較低的程序。像這樣,需要用于分離這些細胞和其他細胞的改進的生物系統(tǒng)。
技術實現(xiàn)要素:
本公開內容的實施例包括用于從樣品中分離一種或多種所需生物試劑(例如細胞)的系統(tǒng)、方法和組合物。在特定實施例中,本公開內容提供了包括用于從樣品中捕獲某些所需生物試劑的改性表面的系統(tǒng)。本公開內容的實施例包括封閉的無反應性系統(tǒng),其用于從樣品中分離所需細胞,并且任選地還進一步處理細胞,包括至少培養(yǎng)用于細胞治療的細胞(例如免疫細胞)。本公開內容的某些實施例包括用于細胞分離以及任選地其后的生長和/或處理的離體系統(tǒng)。本公開內容的系統(tǒng)允許在一步法或單系統(tǒng)方法中分離細胞,而不損害細胞,使得它們隨后可被利用,至少包括用于體內應用。
在本公開內容的某些方面,系統(tǒng)包括至少一個容器,例如管或袋,其包括被配置用于從樣品中收集至少一種特定類型的生物試劑的表面。在特定方面,考慮到細胞具有各種表面標記物,可通過相同的部分捕獲超過一種細胞類型。在某些方面,超過一種細胞類型可在相同系統(tǒng)中被非相同部分的混合物捕獲。在具體實施例中,系統(tǒng)包括具有膜片的容器,例如其中片被激光焊接在例如蛇形袋中。在一些實施例中,容器包括除管或袋外或者加上管或袋的珠、微結構或器械。可使用本公開內容的實施例分離任何細胞,但在特定實施例中,細胞例如是血細胞或免疫細胞。用于捕獲的示例性免疫細胞包括至少單核細胞,盡管可使用本公開內容的系統(tǒng)和方法獲得其他免疫細胞。
一個實施例包括容器(例如柔性管),其包括包含具有官能化表面的聚合物的內壁。在具體實施例中,容器具有細胞特異性適體(結合特定靶分子的寡核酸或肽分子)的連續(xù)覆蓋。在具體實施例中,適體可由核酸或氨基酸組成。在一些情況下,容器的內壁由小于約0.1mg/cm2、0.09mg/cm2、0.08mg/cm2、0.07mg/cm2、0.06mg/cm2、0.05mg/cm2、0.04mg/cm2、0.03mg/cm2、0.02mg/cm2、0.01mg/cm2、0.009mg/cm2、0.008mg/cm2、0.007mg/cm2、0.006mg/cm2、0.005mg/cm2、0.004mg/cm2、0.003mg/cm2、0.002mg/cm2、0.001mg/cm2或者是不可檢測的在水中的總有機碳(toc)的聚合物組成。在特定實施例中,在水中的toc小于在0.001mg/cm2至0.1mg/cm2、0.001mg/cm2至0.095mg/cm2、0.001mg/cm2至0.075mg/cm2、0.001mg/cm2至0.05mg/cm2、0.001mg/cm2至0.01mg/cm2、0.001mg/cm2至0.005mg/cm2、或0.001mg/cm2至0.025mg/cm2范圍內的量。在特定實施例中,在水中的toc小于在0.01mg/cm2至0.1mg/cm2、0.01mg/cm2至0.075mg/cm2、0.01mg/cm2至0.05mg/cm2、或0.01mg/cm2至0.025mg/cm2范圍內的量。在特定實施例中,在水中的toc小于在0.05mg/cm2至0.1mg/cm2、0.05mg/cm2至0.09mg/cm2、0.05mg/cm2至0.075mg/cm2、或0.05mg/cm2至0.06mg/cm2范圍內的量。在特定實施例中,在水中的toc小于在0.005mg/cm2至0.1mg/cm2、0.005mg/cm2至0.095mg/cm2、0.005mg/cm2至0.075mg/cm2、0.005mg/cm2至0.05mg/cm2、0.005mg/cm2至0.025mg/cm2、或0.005mg/cm2至0.01mg/cm2范圍內的量。
在具體實施例中,氟化乙烯丙烯(fep)的toc為0.00005mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.001mg/g的制品);硅酮材料例如硅酮管的toc為0.021mg/cm2(0.023mg/cm的管)和0.008mg/cm2(0.009mg/cm)的制品的內部潤濕表面;用于歷史上使用的細胞培養(yǎng)袋的toc為0.002mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.032mg/g的制品)。
在包含聚合物的內壁的具體實施例中,聚合物是含氟聚合物(具有多個強碳-氟鍵的氟碳基聚合物),例如氟化乙烯丙烯(fep)。內壁的官能化可通過適合于在系統(tǒng)中使用的系統(tǒng)和/或試劑的預期應用的任何方法。在具體實施例中,內壁的官能化包括例如用羧基、羥基、醛基、羰基、胺基、亞胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫化物、苯酚、胍、硫醚、吲哚、咪唑或重氮表面基團使壁官能化,使得存在特定的起始表面。在具體實施例中,官能化是用羧酸,隨后為經(jīng)由肽鍵將羧酸酯與抗生物素蛋白蛋白質連接。在具體實施例中,固定的抗生物素蛋白蛋白質充當關于生物素化引物或生物素化適體的結合位點。在至少一些情況下,官能團可具有與之直接或間接連接的作為引物的dna序列,以使用rca(滾環(huán)擴增)構建適體。因此,在具體方面,本公開內容包括使用適體“觸角”來捕獲和釋放樣品中的特定細胞而不傷害它們。本公開內容包括在一步法或單系統(tǒng)方法中從樣品中分離特定細胞,而不有害地影響細胞的功能。在具體實施例中,本公開內容的系統(tǒng)是單次使用的。
實施例包括對所需細胞如單核細胞具有高特異性和親和力的適體(例如通過用于核酸適體的細胞selex方法設計的適體)。使用封閉系統(tǒng)(包括至少一個容器,例如袋或管,且至少部分包含含氟聚合物),其內表面例如用長dna序列官能化。這些觸角可通過任何合適的方法生成,盡管在具體實施例中,觸角由核酸組成,并且由針對適體的第一模板的rca生成。在一些情況下,觸角由合成產(chǎn)生或由相應的表達構建體表達的氨基酸適體組成。然后,每個觸角具有對所需細胞高度特異性的至少幾個位點。在某些實施例中,適體的長度為長度至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個或更多個堿基對等等。在具體實施例中,適體的長度不超過長度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個或更多個堿基對。樣品在系統(tǒng)的表面(通過可以是袋、管、珠、板或微結構的至少一個容器)上處理,并且其后僅所需細胞保持附著至觸角。然后,方法用于實現(xiàn)與其他不需要的細胞分離的來自系統(tǒng)的所需細胞釋放。限制性酶消化、加熱和/或互補dna可用于釋放細胞。
在用于分離生物物質的系統(tǒng)(包括所需細胞)的實施例中,存在包括含氟聚合物層的器械。在某些實施例中,該器械可被配置為包括袋或管的容器。在至少一些情況下,袋被進一步限定為管,并且管可由柔韌材料構成,使得它能夠被配置為易于使用或貯存的形狀(例如蛇形配置)。含氟聚合物層可包括至少主表面和包含官能團的反應性部分。反應性部分(rm)可附著至例如共價附著至含氟聚合物的主表面。在至少某些方面,反應性部分可為在表面上幾何契合的化學基團的量。反應性部分可具有每平方微米至少50個反應性部分的表面濃度,即50rm/μm2的主表面。在某些實施例中,反應性部分可具有至少55rm/μm2、60rm/μm2、65rm/μm2、70rm/μm2、75rm/μm2、80rm/μm2、85rm/μm2、90rm/μm2、95rm/μm2、100rm/μm2、200rm/μm2、500rm/μm2、750rm/μm2或1000rm/μm2的表面濃度。
在一個實施例中,用于分離生物物質的系統(tǒng)包括入口和在第一端連接至入口的容器(例如管)。管可包括含氟聚合物層。在某些方面,含氟聚合物層可包含主表面和包含官能團的反應性部分。反應性部分可共價附著至含氟聚合物的主表面。反應性部分可具有至少50個反應性部分/平方微米(50rm/μm2)的表面濃度。在一些實施例中,系統(tǒng)還包括連接至管的第二端的出口。
在該系統(tǒng)的特定實施例中,分離生物物質的方法包括提供生物樣品。該方法還可包括通過管應用生物樣品。在具體實施例中,管可包括含氟聚合物層。在特定情況下,含氟聚合物層包括主表面和反應性部分。反應性部分可附著至例如共價附著至含氟聚合物的表面。共價附著的反應性部分具有表面濃度sc。在特定實施例中,該方法包括將來自生物樣品的單一所需生物試劑固定到表面上。該方法還可包括從管中去除生物樣品,減少所需的生物試劑。在一個實施例中,至少90摩爾%的單一生物試劑基于表面濃度sc和長度l固定在表面上,盡管在一些情況下,至少80摩爾%、81摩爾%、82摩爾%、83摩爾%、84摩爾%、85摩爾%、86摩爾%、87摩爾%、88摩爾%、89摩爾%、90摩爾%、91摩爾%、92摩爾%、93摩爾%、94摩爾%、95摩爾%、96摩爾%、97摩爾%、98摩爾%或99摩爾%的單一生物試劑基于表面濃度sc和長度l固定在表面上。在一些實施例中,該方法還包括從個體獲得生物樣品。獲得可通過任何方式發(fā)生,例如從個體中抽取血液、從個體中收集骨髓、抽脂、手術取樣(使用導管、內窺鏡檢查等等)、其他取樣固體和液體組織的方法等等。
在某些實施例中,系統(tǒng)包含包括入口的袋。在具體實施例中,袋包括出口。在一些情況下,袋還可包括捕獲元件。捕獲元件包括表面和捕獲部分。在具體方面,捕獲部分可包括生物素化合物。捕獲部分可包括抗生物素蛋白蛋白質。捕獲部分可包括生物素化合物或抗生物素蛋白蛋白質,但并非兩者。在該系統(tǒng)的一個方面,袋包括可共價附著至袋的表面的捕獲部分。在具體實施例中,捕獲部分可具有固定任何種類的細胞(具體例子至少包括白血細胞)的特異性。在特定實施例中,抗生物素蛋白是直接或間接連接物以附著dna并且不捕獲細胞本身。
在一個實施例中,系統(tǒng)包括袋,其包含至少10,000,000個關于細胞的捕獲位點/100ml體積,盡管該袋可包含至少15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、50,000,000、75,000,000等等數(shù)目的關于細胞的捕獲位點/100ml體積;在具體情況下,例如,細胞是造血干細胞。每個捕獲位點都可包含捕獲元件。捕獲元件可包括表面和捕獲部分。捕獲部分可附著至例如共價附著至表面。
在一些實施例中,存在從樣品中分離細胞的方法,所述方法包括提供樣品。在某些情況下,存在分離血細胞或免疫細胞(包括至少白血細胞)的方法,所述方法包括提供來自個體的樣品。在具體實施例中,該方法包括提供來自個體的血液或骨髓樣品。該方法可包括從個體中提取血液或骨髓樣品。該方法可包括將樣品(例如血液樣品)轉移到本公開內容的器械包括例如上述容器內。
在某些實施例中,從生物樣品中分離某些細胞的方法包括提供來自哺乳動物例如人、犬、貓、馬、豬、綿羊、黑猩猩、狒狒、大猩猩或山羊的樣品。在一些情況下,從生物樣品中分離單核細胞的方法包括提供來自哺乳動物的血液樣品。該方法可包括將樣品(例如血液)轉移到上述容器之一內。
本公開內容的實施例還包括誘導單核細胞在血管結構的表面上附著的人造血管,然后使用各種細胞因子誘導單核細胞與表面的附著,允許從全血中分離單核細胞并且其后將它們從容器的表面取出。容器的環(huán)境可包含用于刺激單核細胞粘附的一種或多種趨化因子,并且一旦粘附,單核細胞就可基于其自身的肌動蛋白骨架發(fā)展更強的相互作用。因此,本公開內容的具體實施例允許高剪切應力的不存在。
在一個實施例中,存在包括容器的細胞分離系統(tǒng),其中所述容器包括:內表面,其包含具有小于0.1mg/cm2的在水中的總有機碳(toc)的聚合物,以及附著至聚合物的多個官能團。在具體實施例中,氟化乙烯丙烯(fep)的toc為0.0005mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.001mg/g的制品);硅酮材料例如硅酮管的toc為0.021mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.023mg/cm的管)和0.008mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.009mg/cm的管);用于歷史上使用的細胞培養(yǎng)袋的toc為0.002mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.032mg/g的制品)。在具體實施例中,官能團直接或間接附著至生物試劑-捕獲部分。在一些實施例中,官能團通過接頭附著至聚合物,并且接頭可為線型亞烷基(亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基或亞己基)、支鏈亞烷基、環(huán)狀亞烷基、芳烴二基(arenediyl)、低聚乙二醇基如四乙二醇、糖基或其組合。在具體實施例中,官能團具有與之直接附著的結合對的第一成員。在某些方面,生物試劑-捕獲部分包含結合對的第二成員。在某些實施例中,官能團具有與之直接附著的結合對的第一成員,并且生物試劑-捕獲部分包含結合對的第二成員,其中所述結合對的第一成員和第二成員彼此結合。在結合對的第一成員是抗生物素蛋白種類時的情況下,結合對的第二成員是例如生物素。當結合對的第一成員是生物素時,結合對的第二成員是例如抗生物素蛋白種類。抗生物素蛋白種類的例子包括抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。在一些情況下,官能團是羧基、羥基、醛基、羰基、胺基、亞胺基、酰胺基、炔基、烯基、氮丙啶基、環(huán)氧基、異腈基、異氰化物基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、硫醇基、酸酐基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、重氮基或其組合。在一些實施例中,生物試劑-捕獲部分直接結合生物試劑,并且生物試劑-捕獲部分可包含氨基酸序列,例如包括包含一個或多個適體的氨基酸序列。在特定實施例中,生物試劑-捕獲部分間接結合生物試劑或產(chǎn)生直接結合生物試劑的分子。在特定實施例中,生物試劑-捕獲部分或由生物試劑-捕獲部分產(chǎn)生的分子是核酸。在具體實施例中,生物試劑-捕獲部分包含核酸模板,并且它可為環(huán)狀dna模板。核酸模板可包含與直接結合生物試劑的序列互補的序列。在特定實施例中,由生物試劑-捕獲部分產(chǎn)生的分子包含一個或多個適體。在特定方面,聚合物是含氟聚合物例如聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基(pfa)、乙烯四氟乙烯(etfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、乙烯氟化乙烯丙烯(efep)、全氟聚醚(pfpe)、改性聚四氟乙烯(tfm)、聚氟乙烯或其組合。
在本公開內容的特定實施例中,系統(tǒng)是封閉系統(tǒng)。
在用于細胞分離的容器的實施例中,容器還包含酶,例如聚合酶,包括至少phi29聚合酶。容器可包括袋、管、珠、燒瓶、滾瓶和/或剛性容器。容器可包括兩個或更多個孔。在某些實施例中,該系統(tǒng)包括直列式附著至所述容器的一個或多個另外的容器。在具體實施例中,包含一種或多種細胞生長劑的第二容器。在某些情況下,存在包含一種或多種抗原如腫瘤抗原的第三容器。在一些情況下,存在配置為濃縮生物試劑如細胞的第四容器,所述細胞可為來自樣品的細胞。細胞的例子包括單核細胞、血細胞、免疫細胞或其混合物。
在該系統(tǒng)的某些實施例中,存在包括一個或多個膜的第二容器(參見美國臨時專利申請序列號62/095,197和美國臨時專利申請序列號62/095,116中的至少某些實施例,這兩個專利申請以引用的方式全文并入本文)。膜可為多孔的。在一些情況下,存在包括兩個或更多個孔的第二容器。在特定實施例中,第二容器包括兩個入口和兩個出口。在特定實施例中,存在包括一個或多個膜并且包括兩個、三個或四個孔的第二容器。在具體實施例中,第一膜被配置為將第一入口與容器中的室選擇性地流體分離,并且第二膜被配置為將第一出口與腔選擇性地流體分離。在特定實施例中,第二入口定位在室處,第二出口定位在室處,或兩者。在具體實施例中,第二容器包括內表面,所述內表面包含具有小于0.1mg/cm2的在水中的總有機碳(toc)的聚合物。在具體實施例中,氟化乙烯丙烯(fep)的toc為0.0005mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.001mg/g的制品);硅酮材料例如硅酮管的toc為0.021mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.023mg/cm的管)和0.008mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.009mg/cm的管);用于歷史上使用的細胞培養(yǎng)袋的toc為0.002mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.032mg/g的制品)。
在一個實施例中,存在制備如本文考慮的系統(tǒng)的方法,所述方法包括以下步驟:提供包括內表面的容器,所述內表面包含具有小于0.1mg/cm2的在水中的toc的聚合物;并且將官能團附著至內表面。在具體實施例中,附著步驟是通過氧化、格氏試劑或電暈處理。在一些實施例中,該方法還包括將結合對的第一成員附著至官能團的步驟。在具體實施例中,將結合對的第一成員附著至官能團的步驟包括官能團的活化?;罨砂ㄊ构倌軋F暴露于乙酸鈉與1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)的混合物。在具體實施例中,方法還包括將結合對的第二成員附著至生物試劑-捕獲部分的步驟,所述生物試劑-捕獲部分例如通過結合對的第二成員直接或間接附著至官能團的生物試劑-捕獲部分。生物試劑-捕獲部分可包含氨基酸序列。生物試劑-捕獲部分可為環(huán)狀dna模板和引物,并且該方法還包括向容器提供聚合酶(例如在合適的條件下延伸dna模板的聚合酶)和核苷酸的步驟。聚合酶可為phi29聚合酶。
在某些實施例中,存在用于從來自至少一個個體的樣品中分離特定細胞的方法,所述方法包括以下步驟:提供如本文考慮的系統(tǒng);并且在使混合物中的特定細胞能夠選擇性地結合生物試劑-捕獲部分或選擇性地結合由生物試劑-捕獲部分產(chǎn)生的分子(例如核酸)的條件下,使包含細胞的混合物的樣品經(jīng)受系統(tǒng)。樣品可能是血液或骨髓。在某些實施例中,經(jīng)受步驟還包括向系統(tǒng)提供酶,例如聚合酶。本公開內容的方法還可包括從個體獲得樣品的步驟。個體可能需要細胞治療,例如用于癌癥的細胞治療。在特定實施例中,在從樣品中分離特定細胞后,從系統(tǒng)中收集細胞。可通過從生物試劑-捕獲部分或由生物試劑-捕獲部分生成的分子釋放細胞來收集細胞。在具體實施例中,釋放是通過在合適的條件下的加熱。在特定實施例中,當生物試劑-捕獲部分或由生物試劑-捕獲部分生成的分子是核酸時,通過暴露于一種或多種內切核酸酶和/或暴露于與相應的部分或分子互補的核酸而釋放細胞。在具體實施例中,在從樣品中分離特定細胞后,進一步處理細胞,并且可在系統(tǒng)中的一個或多個另外的容器中進一步處理細胞??赏ㄟ^培養(yǎng)細胞、使細胞暴露于一種或多種抗原、使細胞分化、擴增細胞、濃縮細胞、純化細胞或其組合而進一步處理細胞。在具體實施例中,將治療有效量的所收集的細胞提供給需要細胞治療的個體。
在一些實施例中,存在包括如本文考慮的系統(tǒng)的試劑盒,所述系統(tǒng)容納在合適的容器中。在具體實施例中,系統(tǒng)還包括用于樣品收集或樣品貯存或兩者的器械。該器械可為小瓶、注射器、杯、導管、袋、管或其組合。試劑盒還可包含聚合酶,例如phi29聚合酶。試劑盒還可包含內切核酸酶、緩沖液和/或一種或多種細胞因子、趨化因子或生長因子。
附圖說明
為了更全面地了解本公開內容,現(xiàn)在參考與附圖結合進行的下述描述,其中:
圖1a-1b示出了用于分離和培養(yǎng)用于細胞治療的細胞的封閉系統(tǒng)的示例性實施例;
圖2證實了將包含適體的袋暴露于血液用于捕獲特定免疫細胞的實施例;
圖3證實了作為例子來自
圖4顯示了附著至fep基材用于分離目的細胞的珠;
圖5顯示了經(jīng)處理的氧化的膜、經(jīng)處理的未氧化的膜和未經(jīng)處理的氧化的膜的ftir光譜;
圖6示出了使用加入血液樣品中并且引入包含具有中性抗生物素蛋白的fep涂層的管中的生物素化適體分離所需細胞的例子;
圖7包括根據(jù)實施例用于分離生物物質的系統(tǒng)的圖示;
圖8包括根據(jù)利用核酸適體的實施例,關于改性表面的方法的流程圖的例子;
圖9包括用于從生物樣品中分離生物試劑的方法圖示的例子;
圖10示出了在抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(nav)吸附后,進入未經(jīng)處理的膜的4000-1400cm-1范圍內的ftir光譜。對照樣品與懸浮液和沖洗緩沖液(naoac和去離子h2o)接觸。在1630cm-1處觀察到酰胺存在。對于蛋白質樣品在3400cm-1處的較高峰也顯示至表面的蛋白質的存在;
圖11顯示了在抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(nav)吸附后,進入經(jīng)c處理的膜的4000-1400cm-1范圍內的ftir光譜。對照樣品與懸浮液和沖洗緩沖液(naoac和去離子h2o)接觸。在1630cm-1處觀察到酰胺存在。對于蛋白質樣品在3400cm-1處的較高峰也顯示至表面的蛋白質的存在;
圖12證實了在未經(jīng)處理的(第1列)、經(jīng)c處理的(第2列)和氧化的經(jīng)c處理的fep膜(第4列)上,與羧基結合的亞甲基藍分子在600nm處的吸光度。第3列顯示了在其與亞甲基藍反應之前氧化的經(jīng)c處理的膜的吸光度(空白對照);
圖13顯示了在未經(jīng)處理的(第1列)、經(jīng)c處理的(第2列)和氧化的經(jīng)c處理的fep膜(第4列)上,與羧基結合的亞甲基藍分子的總吸光度和在600nm處的吸光度。第3列顯示了在其與亞甲基藍反應之前氧化的經(jīng)c處理的膜的吸光度(空白對照);
圖14顯示了具有亞甲基藍的fep膜染料進入uv-vis范圍350-1050nm內的典型光譜。氧化的對照是在與亞甲基藍反應之前的氧化的經(jīng)c處理的膜;
圖15a-15d提供了具有吸附的中性抗生物素蛋白的未經(jīng)處理的fep的sem圖像(a至d)。圖像d顯示了生物素涂布的珠與官能化的中性抗生物素蛋白表面(具有吸附的中性抗生物素蛋白的未經(jīng)處理的fep)的附著;
圖16顯示了具有吸附的中性抗生物素蛋白的經(jīng)c處理的fep(左)和具有綴合的中性抗生物素蛋白的氧化的經(jīng)c處理的fep(右)的sem圖像;
圖17提供了在具有吸附的中性抗生物素蛋白的未經(jīng)處理的fep上生物素涂布的微珠;
圖18顯示了用olympusdsx500顯微鏡獲取,在具有吸附的中性抗生物素蛋白的未經(jīng)處理的fep上的生物素微珠(d~0.8-1μm的黑色斑點)的光學圖像。尺度:341-342μm,放大倍率:在20x透鏡上3x;
圖19提供了在不同類型的改性fep膜上的染色蛋白質在660nm處的吸光度,包括未經(jīng)處理的對照。每組列的第一列代表僅暴露于緩沖溶液的對照樣品,每組的第二列代表吸附的抗生物素蛋白,并且每組的第三列代表具有吸附的中性抗生物素蛋白的樣品。在進行蛋白質染色反應后獲得所有測量。
圖20證實了在與蛋白質的染料反應之前和與蛋白質的染料反應之后,在經(jīng)c處理的膜上進入uv-vis范圍350-1050nm內的典型光譜。
圖21顯示了用吸附的中性抗生物素蛋白(nav)先前改性的1%sds洗滌的氧化的經(jīng)c處理的膜的ftir光譜;
圖22提供了在高功率(us-a)和低功率(us-b)下5分鐘的超聲處理步驟后,在具有吸附的中性抗生物素蛋白的未經(jīng)處理的fep上的ftir光譜。未觀察到變化。細實線代表超聲處理前吸附蛋白質的光譜;
圖23顯示了在高功率(us-a)和低功率(us-b)下5分鐘的超聲處理步驟后,在具有吸附的中性抗生物素蛋白的經(jīng)c處理的fep上的ftir光譜。未觀察到變化。細實線代表超聲處理前吸附蛋白質的光譜;
圖24示出了在附著的中性抗生物素蛋白的fep膜上的酶聯(lián)免疫吸附測定的例子;
圖25顯示了在聚丙烯酸官能化的fep膜(paa-fep)的4000-1400cm-1范圍內的ftir光譜,已在mes緩沖液中被edc/nhs化學活化的paa-fep膜的光譜,活化的paa-fep膜表面與抗生物素蛋白蛋白質的進一步綴合反應的光譜,以及作為參考的吸附在表面上的抗生物素蛋白蛋白質的光譜;
圖26提供了加上熒光團標簽的與paa-fep表面化學附著的抗生物素蛋白的熒光圖像,paa-fep表面與不被paa官能化的fep的對照段相鄰;和
圖27顯示了在聚丙烯酸官能化的fep膜(paa-fep)的4000-1400cm-1范圍內的ftir光譜,暴露于無dna的鎂離子偶聯(lián)緩沖液的paa-fep膜的光譜,暴露于edc/nhs試劑的paa-fep膜的光譜;在與胺封端的dna綴合反應后,edc/nhs活化的paa-fep膜的光譜;在dna溶液中浸泡的paa-fep膜的光譜。
具體實施方式
如本文說明書中使用的,“一個”或“一種”可意指一個或多個/一種或多種。如本文權利要求中使用的,當與單詞“包括”結合使用時,單詞“一個”或“一種”可意指一個/種或超過一個/種。如本文使用的,“另一”可表示至少第二或更多。再進一步地,術語“具有”、“包括”、“含有”和“包含”是可互換的,并且本領域技術人員認識到這些術語是開放式術語。本公開內容的一些實施例可由本文的一個或多個元素、方法步驟和/或方法組成,或者基本上由本文的一個或多個元素、方法步驟和/或方法組成。考慮本文描述的任何方法或組合物均可就本文描述的任何其他方法或組合物而言來實施。
本說明書的一個目的是提供以高特異性從生物樣品中分離至少一種生物試劑的系統(tǒng)、方法和組合物。該說明書還包括用于制備這種系統(tǒng)的一種或多種方法。在一個實施例中,例如,生物試劑范圍可從無機種類例如金屬離子和陰離子到小的有機分子,例如維生素、激素或肽。在另一個實施例中,生物試劑可包括大分子種類,例如蛋白質、酶或核苷酸。在再一個實施例中,生物試劑甚至可包括更復雜的系統(tǒng),例如細胞器,即細胞核、核糖體、線粒體、細胞囊泡、粗面內質網(wǎng)和滑面內質網(wǎng)、高爾基體、溶酶體、中心體、細胞碎片或細胞膜。在一個特定實施例中,生物試劑可包括整個細胞。在某些實施例中,生物試劑包括任何類型的血細胞、任何類型的干細胞或任何類型的免疫細胞。來自樣品的細胞可為正常的或可為患病的。在另一個特定實施例中,生物試劑包含血細胞,例如白血細胞。在特定實施例中,生物試劑包含免疫細胞,例如單核細胞或t細胞。在具體實施例中,例如,生物試劑是病毒、細胞群或微生物。相應地,生物樣品可包括來自動物(包括人)的任何器官或組織的樣品。例如,血液可為分離單核細胞的生物樣品。在另一個實施例中,骨髓可為分離造血干細胞(即單核細胞的前體)的生物樣品。在特定實施例中,系統(tǒng)允許以特異性分離大分子化合物、細胞亞單位或細胞,同時維持種類的生物活性,即具有低降解速率。
本公開內容的實施例提供了允許從細胞的混合物(例如來自樣品的細胞混合物)中分離所需細胞的系統(tǒng)。樣品可來自個體,包括哺乳動物,例如人。在特定實施例中,系統(tǒng)包括被配置為分離所需細胞的容器。在一些實施例中,該系統(tǒng)是分成多部分的,具有除用于細胞分離的容器外的另外的容器。在一些情況下,這樣的容器可被配置在用于細胞移動的序貫路徑中;在這種實施例中,細胞經(jīng)受不同的環(huán)境或操作用于進一步處理。在特定實施例中,細胞分離容器是用于細胞的序貫處理的路徑中的第一容器。在其中系統(tǒng)中存在兩個或更多個容器的情況下,容器可被直列式配置,使得被處理的樣品或細胞從一個容器連續(xù)移動到另一個容器。在具體實施例中,多容器系統(tǒng)被線性地配置,并且這樣的線性路徑可為水平的或線性的,或者兩者都不是。
在特定實施例中,樣品在遞送到系統(tǒng)之前不被處理,盡管在遞送到系統(tǒng)之前,樣品可已在足夠的條件下貯存。在具體實施例中,樣品在遞送至系統(tǒng)之前不經(jīng)受分離技術(包括離心),在遞送至系統(tǒng)之前不經(jīng)受一種或多種生物試劑(包括例如抗凝血劑)的加入等等。在具體實施例中,樣品不經(jīng)受與將觸發(fā)免疫細胞應答的表面接觸。樣品可已由與進行系統(tǒng)處理的一方不同的另一方從個人獲得。
在一個實施例中,在其使用之前,該系統(tǒng)可為完整的并且準備用于分離生物試劑。在另一個實施例中,系統(tǒng)可在初級階段提供給用戶,并且用戶例如實驗室技術人員根據(jù)所需生物試劑的特異性修改系統(tǒng)。在一個實施例中,系統(tǒng)可與進一步處理分離。在另一個實施例中,本公開內容的系統(tǒng)可包括在一系列過程中,其中生物試劑的分離是包括本公開內容的系統(tǒng)的多部分系統(tǒng)的一部分??紤]到一些生物試劑的靈敏度,至少本公開內容的系統(tǒng)可為封閉系統(tǒng),其中生物試劑的分離及其進一步處理在單一受控系統(tǒng)中進行。
在系統(tǒng)的某些實施例中,容器包含用于捕獲所需物質例如所需細胞的一種或多種生物試劑-捕獲部分。在本發(fā)明的特定方面,系統(tǒng)的生物試劑-捕獲部分和方法包括適體和/或產(chǎn)生適體,所述適體可為與特定靶分子結合的寡核苷酸或肽或多肽(在這種情況下,要捕獲的所需生物試劑)。適體序列可為用戶或系統(tǒng)的制備者已知或未知的。在特定實施例中,特定的適體對于特定所需細胞的結合是特異性的。適體可由系統(tǒng)的用戶生成或鑒定,或者適體可從另一個獲得,包括商業(yè)獲得。例如,可通過從大型隨機合成生成的序列庫中選擇寡核苷酸適體來生成寡核苷酸適體,盡管適體可存在于自然界中。本公開內容的系統(tǒng)的用戶或制備者可能不是鑒定對于特定生物試劑特異性的適體的序列的一方。對于核酸實施例,適體可包含dna或rna并且可包含寡核苷酸的多聚體,或者它們可包含肽或肽的多聚體。在具體實施例中,dna適體觸角的長度范圍為在觸角內至少10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個或更多個適體。在具體實施例中,肽適體觸角的長度范圍為在觸角內至少為10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個或更多個適體。在特定實施例中,適體觸角的長度范圍不超過觸角內的10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個或更多個適體。
在本公開內容的特定實施例中,容器是封閉系統(tǒng)的部分,所述封閉系統(tǒng)包括由含氟聚合物組成的至少一個袋或管,或在含氟聚合物中涂布的至少一個袋或管,使得其內表面用核酸(例如dna,包括dna的長序列)或肽或多肽官能化,并且核酸、肽或多肽可間接附著至內表面。在具體實施例中,含氟聚合物具有與之附著的dna長序列的觸角,所述觸角可通過與適體相適應的第一模板生成(例如通過rca或pcr)。因此,dna的每個觸角具有對目的生物試劑高度特異性的至少兩個或更多個位點。在某些實施例中,含氟聚合物具有與之附著的氨基酸長序列的觸角,所述觸角可以多種方式生成,包括化學合成或由核酸表達構建體表達。
在一個具體實施例中,從個體獲得樣品(例如血液),并且提供至包含特定聚合物的容器,該聚合物被改性用于捕獲樣品中的所需生物試劑(例如所需細胞)。在具體實施例中,聚合物被改性為具有與之附著的能夠結合細胞的核酸或肽或多肽適體觸角。在所需細胞與觸角結合后,具有結合的細胞的觸角可從聚合物中釋放出來用于收集。釋放可通過任何合適的方式,但在具體實施例中,它通過使用加熱,或者在核酸適體的情況下,例如通過核酸內切酶(例如限制性酶)和/或互補dna。當采用一種或多種限制性酶時,限制性酶的選擇可針對dna觸角的特定序列定制。所需細胞的收集可例如通過管進入袋內。
在本公開內容的特定實施例中,存在用于產(chǎn)生用于分離細胞的系統(tǒng)的多步法。本領域技術人員認識到,存在用于固定適體的各種化學方法,包括附著至金,共價附著至功能改性的表面,包括用于接頭設計的有用參數(shù),作為一個例子(balamurugan等人,2008)。然而,在具體實施例中,本文考慮了多步法。在一個實施例中,一個步驟是選擇特定的起始fep表面用于隨后固定蛋白質,例如抗生物素蛋白或其衍生物之一。在具體實施例中,生物捕獲試劑直接與表面連接??煽紤]表面能和表面化學的改性。另一個步驟可為將抗生物素蛋白或其衍生物之一附著至所選擇的fep表面,并且在具體實施例中,這樣的步驟可包括物理吸附或化學綴合。根據(jù)選擇的哪種方法,fep表面的起始官能化可不同。另一個步驟涉及將具有細胞表面標記物(例如單核細胞表面標記物)的特異性dna序列的生物素化適體偶聯(lián)到抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。最后,從樣品中分離所需細胞(如從全血中分離單核細胞)。在該步驟中,細胞將通過其特定細胞表面標記物結合適體,并且將在封閉系統(tǒng)中與其他細胞分離。
在特定實施例中,系統(tǒng)被封閉并且包括至少一個表面。表面可為整個系統(tǒng)連續(xù)的,也可不是整個系統(tǒng)連續(xù)的,例如在系統(tǒng)中的多個容器中是連續(xù)的。在具體實施例中,系統(tǒng)的不同容器中的表面基本相同,盡管在其他實施例中,系統(tǒng)的不同容器中的表面是不同的。系統(tǒng)的容器的內表面可具有在系統(tǒng)的至少部分中的一個或多個層,盡管在一些情況下,表面具有在整個系統(tǒng)中的一個或多個層。系統(tǒng)中的不同表面可具有不同的改性。
在一個實施例中,系統(tǒng)中的表面的第一層可視為基層,例如容器包括的內表面。這樣的層可由具有低浸出性、低提取性、對生物試劑如細胞非反應性等等的材料組成。第一層可為系統(tǒng)的容器的結構的內表面,或者第一層可為系統(tǒng)的容器的結構的內表面上的涂層。
在一個實施例中,系統(tǒng)中的表面的第二層可包含附著至第一層的官能團。官能團可被化學配置用于將第一層與包含生物試劑-捕獲部分的層或與生物試劑-捕獲部分相關聯(lián)的層連接。這些官能團可為任何種類的,這取決于系統(tǒng)的一個或多個層的性質。在某些情況下,官能團包含酸用于進一步改性。在具體實施例中,官能團為羧基、羥基、醛基、羰基、胺基、亞胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔基、烯基、氮丙啶基、環(huán)氧基、異腈基、異氰化物基、四嗪基、重氮表面基團、炔基、烯基、氮丙啶基、環(huán)氧基、異腈基、異氰化物基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、重氮基或其組合。第二層還可包含附著至結合對的第一成員的官能團,所述結合對的第一成員例如抗生物素蛋白種類(包括抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白)或生物素分子。
在一個實施例中,系統(tǒng)中的表面的第三層可包含生物試劑-捕獲部分。生物試劑-捕獲部分可為任何種類的,但在具體實施例中,生物試劑-捕獲部分是直接或間接的細胞結合部分。在具體實施例中,生物試劑-捕獲部分允許直接或間接的細胞選擇性。在具體實施例中,生物試劑-捕獲部分可包含核酸或可產(chǎn)生核酸。在一些情況下,生物試劑-捕獲部分包含氨基酸,例如具有肽或多肽(包括例如具有肽適體的多個重復的氨基酸分子)。生物試劑-捕獲部分可包含例如單一適體、適體觸角或抗體。在具體實施例中,生物試劑-捕獲部分包含抗生物素蛋白蛋白質(包括抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白)或生物素分子,或者與抗生物素蛋白或生物素分子間接相關聯(lián)。在其中第二層包含抗生物素蛋白種類或生物素之一的情況下,第三層包含相應的配對生物素或抗生物素蛋白種類。
參考圖7,用于分離生物試劑的系統(tǒng)100包括分離單元100a和轉移單元100b。分離單元100a可包括蛇形袋102,其具有入口端口104且具有入口106(入口可包括限制裝置,例如閥或夾具)和具有出口110的出口端口108(出口可包括限制裝置,例如閥或夾具)。在一些實施例中,袋102可被配置為管。如圖1所示,例如,分離單元可以蛇形方式排列,以節(jié)省空間和/或促進分離單元的溫度維持。在其他實施例中,例如,分離單元可為直管或螺旋管。
仍然參考圖7,分離單元可包含外部材料112,盡管在其他實施例中,該單元缺少外部材料(例如,當該單元包含100%含氟聚合物時)。在某些方面,外部材料可由熱塑性聚合物、熱塑性彈性體、硅酮、橡膠或其任何組合組成。外部材料可具有至少0.0005英寸、0.0010英寸、0.0050英寸、0.0075英寸、0.01英寸、0.02英寸、0.03英寸、0.04英寸、0.05英寸、至少0.06英寸、至少0.07英寸、至少0.08英寸、至少0.09英寸、至少0.1英寸、或至少0.11英寸的厚度。在另一個實施例中,外部材料可具有不大于0.2英寸、不大于0.18英寸、不大于0.16英寸、不大于0.14英寸、或不大于0.12英寸的厚度。在一個實施例中,外部材料112的厚度范圍可為0.06英寸至0.13英寸,例如在某些實施例中0.09至0.126英寸。外部材料112具有內表面1122。
如圖12所示,作為例子,外部材料112的內表面1122可被含氟聚合物材料114覆蓋。含氟聚合物可為任何種類的,但在具體情況下,含氟聚合物可選自聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基(pfa)、乙烯四氟乙烯(etfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、乙烯氟化乙烯丙烯(efep)、全氟聚醚(pfpe)、改性聚四氟乙烯(tfm)、聚氟乙烯(pvf)或其任何組合。在特定實施例中,含氟聚合物材料114包含fep。fep是一種方便的材料,因為它維持了用于細胞分離包括至少白血細胞分離的良好可加工性。例如,fep不觸發(fā)生物樣品的先天性免疫應答。相應地,在一個實施例中,含氟聚合物材料114由fep組成或基本上由fep組成。在其中聚合物是ptfe的實施例中,存在用于改變其表面的已知反應,其采用射頻輝光放電氨等離子體以在含氟聚合物表面上引入氨基,隨后為與戊二酸酐和順-烏頭酸酐的進一步反應,以提供羧酸官能團(gauvreau等人,2004)。適用于ptfe的表面官能化方法可擴展到其他含氟聚合物表面如本文所討論的那些。
在某些情況下,不存在管的外表面,并且壁是完全含氟聚合物。在任何情況下,在某些實施例中,含氟聚合物材料114可具有至少0.0003英寸、至少0.0004英寸、至少0.0005英寸、至少0.0006英寸、至少0.001英寸、至少0.10英寸等等的厚度。在另一個實施例中,含氟聚合物材料包含不大于0.100英寸、不大于0.08英寸、不大于0.070英寸、不大于0.050英寸、不大于0.030英寸、不大于0.018英寸、不大于0.016英寸、不大于0.014英寸或不大于0.012英寸的厚度。在一個實施例中,含氟聚合物材料114的厚度范圍可為0.001英寸至0.015英寸,例如0.002至0.01英寸。在具體實施例中,壁厚度可直到0.100英寸并包括0.100英寸。含氟聚合物材料114可上覆內表面1122,如圖7所示。在特定實施例中,含氟聚合物材料114上覆至少內表面1122的大部分。在一個實施例中,含氟聚合物材料與外部材料112直接接觸。該含氟聚合物可具有主表面1142。
主表面1142可為管102的暴露內腔。可使含氟聚合物材料114的主表面1142改性。在具體實施例中,可將含氟聚合物材料114改性為包括至少反應性部分。反應性部分可包括可被化學改性以形成生物試劑-捕獲部分的結合位點的官能團。在另一個實施例中,反應性部分可為綴合物部分。綴合物部分包含蛋白質和/或核苷酸(例如)的大分子復合物,包括關于生物試劑的至少一個結合位點。對于包含超過一個結合位點的反應性部分,反應性部分可形成捕獲部分。
進一步參考圖7,轉移單元100b允許在通過分離單元100a之后生物樣品的控制處理。轉移單元100b可包括連接至出口閥110的管120。管120可由例如熱塑性聚合物、熱塑性彈性體或硅酮制成。在一個實施例中,管120可內襯有含氟聚合物。在特定實施例中,含氟聚合物可與分離單元100a中的相同,但具有未經(jīng)改性的主表面,即管120中的含氟聚合物不包括反應性部分。例如,含氟聚合物可選自聚四氟乙烯(ptfe)、全氟烷氧基(pfa)、乙烯四氟乙烯(etfe)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚三氟氯乙烯(pctfe)、乙烯三氟氯乙烯(ectfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、乙烯氟化乙烯丙烯(efep)、全氟聚醚(pfpe)、改性聚四氟乙烯(tfm)、聚氟乙烯(pvf)或其任何組合。在特定實施例中,含氟聚合物材料包含fep。
在至少一些情況下,轉移單元還可包括分離器122,用于在通過單元100a之后將生物樣品從系統(tǒng)轉向通過管124。相反,管126允許通過連接器128將分離單元100a連接到另一個系統(tǒng)。在特定實施例中,對另一個系統(tǒng)作出的連接是無菌連接,其可包括管的無菌焊接或使用無菌連接器。
參考圖8,該圖示描述了當適體是核酸適體(作為例子)時,將具有官能團的生物試劑-捕獲部分制備到含氟聚合物202上的示例性方法200。在初始步驟a中,在含氟聚合物202的主表面上制備包含接頭204和官能團206的反應性部分。如圖8所示,官能團206可為羧基??商娲?,官能團可為羥基(-oh)、醛基(-cho)、羰基(c(o)r,r是c1-c4烷基)、羧基(-cooh)、胺基(-nh2)、亞胺基(=nh)、酰胺基(-c(o)nhr,r是h、烷基、肽或蛋白)、酯基(-coor,r是烷基、肽或蛋白質)、硫醇基、酸酐基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、重氮基、炔基、烯基、氮丙啶基、環(huán)氧基、異腈基、異氰化物基、四嗪基、重氮表面基團、烷基或其組合。
在至少一些情況下,反應性部分還可包括接頭204。在一個實施例中,接頭可為共價鍵,將羧基(或其他官能團)直接連接至含氟聚合物。在另一個實施例中,接頭基團可為有機基團。例如,接頭基團可為例如包括亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基或其任何組合的線型亞烷基。在某些實施例中,官能團(如cooh)表面包含穩(wěn)定的涂層而不是共價結合的基團。
含氟聚合物的表面改性提供了在本發(fā)明的某些實施例中有用的改性含氟聚合物。一般地,極性官能團附著至含氟聚合物表面或在含氟聚合物表面中產(chǎn)生,使其更易于潤濕并提供用于化學鍵合的機會。存在使含氟聚合物表面官能化的幾種方法,包括例如化學蝕刻、物理-機械蝕刻、等離子體蝕刻、在不同壓力下的等離子體活化、電暈活化、化學處理、電暈處理、化學氣相沉積或其任何組合。在一個實施例中,化學蝕刻包括氨鈉或萘鈉。示例性的物理-機械蝕刻可包括用二氧化硅的噴砂和空氣磨蝕。在另一個實施例中,等離子體蝕刻包括反應性等離子體,例如氫、氧、乙炔、甲烷及其與氮、氬和氦的混合物。lachmann等人(2011)描述了使用氦和合適的反應性種類或成膜劑的氣體混合物的表面改性方法。等離子體活化可包括通過用氣體處理在表面中形成反應性種類,所述氣體包括但不限于氬、氫、氮、二氧化碳和組合。等離子體活化可在低壓例如0.1托至0.6托下達到或接近大氣壓例如700托至760托下實現(xiàn)。可實現(xiàn)在氣體下的表面的電暈活化,所述氣體包括但不限于氬、氮和氫或其組合,以在表面中產(chǎn)生可進一步用于化學處理中的活性位點?;瘜W處理包括通過化學反應對活性或現(xiàn)有表面的序貫化學改性,所述化學反應包括接枝聚合、偶聯(lián)、點擊化學、縮合和加成反應。作為例子,可通過經(jīng)由自由基聚合使乙烯基單體聚合來實現(xiàn)在溶液中的接枝聚合。乙烯基單體包括但不限于丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烷基酯、苯乙烯、二烯、α-烯烴、鹵代烯烴、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、n-乙烯基咔唑和n-乙烯基吡咯烷酮和馬來酸酐。電暈處理可包括反應性烴蒸氣如酮(例如丙酮)、醇、對氯苯乙烯、丙烯腈、丙烯二胺、無水氨、苯乙烯磺酸、四氯化碳、四亞乙基五胺、環(huán)己胺、四異丙基鈦酸酯、癸胺、四氫呋喃、二亞乙基三胺、叔丁胺、乙二胺、甲苯-2,4-二異氰酸酯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、三亞乙基四胺、己烷、三乙胺、甲醇、乙酸乙烯酯、甲基異丙胺、乙烯基丁基醚、甲基丙烯酸甲酯、2-乙烯基吡咯烷酮、甲基乙烯基酮、二甲苯或其混合物。
一些技術使用包括這些方法之一的步驟的組合。例如,表面活化可通過在激發(fā)氣體種類的存在下的等離子體或電暈來實現(xiàn)。例如,表面活化可通過在溶劑氣體如丙酮的存在下的電暈處理來實現(xiàn)。另一個例子包括經(jīng)由在低壓或大氣壓下的等離子體活化或在氣體例如氬氣中的電暈活化的表面活化,所述氣體進一步使用化學處理進行改性?;瘜W處理可為乙烯基單體的接枝聚合反應,所述乙烯基單體包括但不限于丙烯酸、丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烷基酯、苯乙烯、二烯、α-烯烴、鹵代烯烴、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、n-乙烯基咔唑和n-乙烯基吡咯烷酮、以及馬來酸酐。
不受理論限制,已發(fā)現(xiàn)該方法提供在改性含氟聚合物和非含氟聚合物界面(或第二改性含氟聚合物)之間的強層間粘附。在一種方法中,含氟聚合物和非含氟聚合物形狀各自分別形成。隨后,含氟聚合物形狀通過美國專利3030290、3255099、3274089、3274090、3274091、3275540、3284331、3291712、3296011、3391314、3397132、3485734、3507763、3676181、4549921和6,726,979中描述的處理方法進行表面處理,所述專利的教導為了所有目的全文并入本文。然后,將所得到的改性含氟聚合物和非含氟聚合物形狀例如通過熱層壓接觸在一起,以形成多層膜。最后,多層膜可提交給波長在uva;uvb和/或uvc范圍內的uv輻射。
在一個方面,用電暈放電處理含氟聚合物基材的表面,其中電極區(qū)域充滿丙酮、四氫呋喃、甲基乙基酮、乙酸乙酯、乙酸異丙酯或乙酸丙酯蒸氣。
通過氣體介質的電容交換產(chǎn)生電暈放電,所述氣體介質存在于兩個間隔開的電極之間,所述電極中的至少一個通過介電阻擋層與氣體介質絕緣。電暈放電由于其電容性質而在起源中略微受限于交流電。這是一種高電壓、低電流現(xiàn)象,其中電壓通常以千伏特測量到,并且電流通常以毫安測量到。電暈放電可維持在寬范圍的壓力和頻率上。0.2至10個大氣壓的壓力一般限定了電暈放電操作的極限,并且大氣壓一般是優(yōu)選的??煞奖愕厥褂梅秶鸀?0hz到100mhz的頻率:特別地,范圍從500hz,尤其是3000hz到10mhz。
當介電阻擋層用于將兩個間隔開的電極各自與氣體介質絕緣時,電暈放電現(xiàn)象常被稱為無電極放電,而當單個介電阻擋層用于將電極中的僅一個與氣體介質絕緣,所得到的電暈放電常被稱為半電暈放電。術語“電暈放電”在本說明書中自始至終用于指示兩個類型的電暈放電,即無電極放電和半電暈放電。
關于電暈放電處理程序的所有細節(jié)在轉讓給美國e.i.dupontdenemoursandcompany的一系列美國專利中提供,在過期的美國專利號3,676,181和saint-gobainperformanceplasticscorporation美國專利號6,726,979中描述,所述專利的教導為了所有目的全文并入本文。所提出的技術的一個例子可在美國專利號3,676,181(kowalski)中找到。封閉處理設備的大氣為氮中的20%丙酮(按體積計),并且是連續(xù)的。例如,恒定進料的多層膜或顆粒填充膜的外層經(jīng)受0.15至2.5瓦特小時/每平方英尺的膜/片表面。含氟聚合物可在膜/形狀的兩側上進行處理,以增加粘附。然后可將該材料放置在非硅化的剝離襯里上用于貯存。經(jīng)過c處理的材料持續(xù)超過1年,而無表面潤濕性、粘結性和粘附力的明顯損失。
在另一個方面,用等離子體處理含氟聚合物基材的表面。術語“等離子體增強化學氣相沉積”(pecvd)是本領域已知的,并且指在基材上將薄膜從氣狀(蒸氣)沉積到固態(tài)的過程。在該過程中涉及一些化學反應,其在反應氣體的等離子體產(chǎn)生之后發(fā)生。等離子體一般由兩個電極之間的rf(ac)頻率或dc放電產(chǎn)生,基材放置在所述兩個電極之間并且空間填充有反應氣體。等離子體是其中相當大百分比的原子或分子被離子化的任何氣體,導致反應性離子、電子、自由基和uv輻射。
在具體實施例中,可利用導致表面上的自由基/過氧化物的fep的等離子體表面活化的兩步法。然后使活化的fep表面暴露于濕化學方法,以允許表面充當自由基聚合引發(fā)劑。例如,可使用產(chǎn)生cooh基團的致密表面的丙烯酸單體,盡管可使用其他自由基單體。
進一步參考圖8,在步驟b中,官能團與大分子種類208如蛋白質連接。在一個實施例中,這種蛋白質可包括抗生物素蛋白蛋白質。在步驟c中,生物素化的種類可與抗生物素蛋白連接。雖然生物素化的種類可包括針對所需生物試劑的特異性配體如抗體,但生物素化的種類也可僅包括生物素化的核苷酸引物,如圖7所示,元件2104。在其他實施例中,生物素化的種類是肽或多肽。在一個實施例中,核苷酸模板可包括聚合酶2102或與聚合酶2102一起利用。為了形成配體,可應用聚合酶技術(例如)以在該方法的步驟d中形成配體特異性dna序列2106。在至少一些情況下,配體特異性dna包括適體。
繼續(xù)參考圖8,解決適體制備的前述描述在步驟d中舉例說明,其中使用聚合酶2102生成dna觸角2106。提供了包含至少一種適體的反義序列和充當適體序列之間的間隔物的非結合dna主鏈的反義序列的dna,并且在一些情況下,dna是環(huán)狀的。在具體實施例中,環(huán)狀dna是單鏈的,并且提供引物例如生物素化引物。在另一個實施例中,間隔的dna序列可包括一些另外功能。例如,間隔物可包括熒光部分,用于確定結合到反應部分212上的生物試劑的量的目的。
圖9描繪了在具有固定的反應性部分212的管中采用分離單元100a的捕獲方法。管的例子包括配備有所需細胞特異性部分(例如適體)的上述反應部分。在步驟l中,使樣品(例如全血)302通過管100a。在通過期間,所需細胞304在單元212上特異性結合,而樣品的剩余部分離開管。在步驟m中,樣品已通過管,并且管已用無細胞緩沖液沖洗,以從管中去除非特異性材料,并洗滌固定的所需細胞。在步驟n中,細胞然后從單元212中移出。在一個實施例中,n1,可通過加熱單元306加熱管,直到克服細胞和綴合部分即dna觸角之間的結合能。小心不要將細胞加熱到有害水平。在加熱期間,培養(yǎng)基可通過管以接受細胞并將其運送到容器308。
在另一個實施例中,n2,可用限制性酶或dna酶310處理管的內容物,所述酶破壞單元212的dna序列,由此釋放所需細胞304。在消化期間,使培養(yǎng)基通過管以接受所需細胞并將它們和酶輸送到容器308。酶310可通過簡單的過濾去除。在另一個實施例中,通過添加與附著至細胞的區(qū)段互補的dna區(qū)段,將細胞從其附著物置換到dna上。
注意,不一定需要在上文一般描述或例子中描述的所有活動,可能不需要特定活動的一部分,并且除描述的那些之外還可進行一個或多個進一步的活動。再進一步地,活動列出的順序不一定是活動進行的順序。
i.用于分離的細胞及其處理
在本公開內容的實施例中,任何細胞均可通過本文所述的系統(tǒng)分離。用于分離的細胞包括細胞如免疫細胞、血細胞或干細胞(包括胚胎干細胞、成體干細胞或誘導的多能干細胞)。可用本文描述的系統(tǒng)分離的血細胞包括紅血細胞、白血細胞或血小板。白血細胞的例子包括粒細胞(例如嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞或嗜酸性粒細胞)或無粒白細胞(例如淋巴細胞、單核細胞或巨噬細胞)??煞蛛x的免疫細胞的例子包括吞噬細胞(巨噬細胞和嗜中性粒細胞);b細胞;t細胞(包括輔助t細胞和細胞毒性t細胞);單核細胞;樹突狀細胞;自然殺傷細胞;調節(jié)性t細胞;等等。
在特定實施例中,在本公開內容的系統(tǒng)中分離單核細胞。單核細胞是多能細胞,這意味著它們可分化成各種細胞。單核細胞可分化成的細胞的主要類型是巨噬細胞和樹突狀細胞。樹突狀細胞在設計針對病原體的免疫系統(tǒng)的具體回應中具有關鍵作用。事實上,通過樹突狀細胞的抗原呈遞是刺激t細胞的重要步驟。
ii.總有機碳
總有機碳(toc)是有機化合物中結合的碳量,并且經(jīng)常用作藥物制造設備的非特異性指示劑等等。toc被用作生物技術工業(yè)中的工藝控制屬性,以監(jiān)測采用純化和分配體系的單元操作的性能。
在具體實施例中,toc可根據(jù)uspharmacopeia(usp)643以及設備進行測量,所述設備利用uv促進化學氧化的高溫濕氧化反應(ultra-cleantechnologyhandbook:第1卷:ultra-purewater,ohmi,tadahiro;crcpress,1993,第497-517頁)。純化水在70℃下置于與聚合物接觸24小時,例如以3cm2的制品表面積與1ml水的比率。水被去除與聚合物的接觸,并且在toc分析儀中進行測試。合適件的設備是tekmardohrmann型號phoenix8000toc分析儀。
在特定實施例中,對于本公開內容的系統(tǒng)中采用的容器可測量toc,包括例如通過從容器的內表面積提取(其中反映為mg/cm2的結果是對于toc/內部面積的平方厘米)。在具體實施例中,并且僅作為例子,容器可在純化水70±2℃中提取24±2小時??赏ㄟ^例如用過硫酸鈉的酸化和化學濕氧化將toc轉換成二氧化碳來分析提取物的toc。從容器釋放的二氧化碳可使用紅外檢測器進行測量。fep容器的提取比率的例子為3cm2/ml(典型的提取比率為1ml水/3cm2容器的內部潤濕表面積)。對于一些容器(如fep袋),不需要稀釋,因為toc水平低于校準曲線的上限,而對于其他實施例(如硅酮配管),因為在提取物中檢測到toc的水平,需要稀釋。
fep容器的toc的例子為0.145mg/l(0.00005mg/cm2或0.001mg/g)。對于采用硅酮配管的實施例,提取比率可為14.6cm2/ml(例如對于biosil),或者可為15.9cm2/ml(例如對于sr139),并且硅酮biosil管的toc的例子是302mg/l(0.021mg/cm2或0.023mg/cm),并且硅酮sr139配管的toc的例子為120mg/l(0.008mg/cm2或0.0009mg/cm)。在至少某些硅酮配管實施例中,樣品可被稀釋,因為提取的體積和濃度導致該值在機器的最大檢測值以上。稀釋度和不同提取比率需要相反在重量/面積值基礎上作出的這些樣品與袋樣品的比較。
本領域技術人員認識到toc值可以重量/體積表征。然而,本領域技術人員知道用于容器(特別是fep袋材料)的比率相對于用于硅酮配管的比率是可區(qū)分的;硅酮配管值只能在mg/cm2起始基礎上加以考慮,因為該值不依賴于提取比率/稀釋度。本領域技術人員可使用重量/面積結果作為基礎并假定標準3cm2/ml提取比率(作為例子)來計算“標準化的”重量/體積比,以便在重量/體積上比較該值。
在具體實施例中,熱塑性彈性體(tpe)的toc為0.002mg/cm2(0.032mg/g或5.88mg/ml)。在某些實施例中,fep的toc為0.00005mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.001mg/g或0.145mg/ml的制品)。在具體實施例中,制品的內部潤濕表面的硅酮的toc為0.021mg/cm2或63mg/ml的制品的內部潤濕表面。
在一些情況下,容器的內壁由小于約0.1mg/cm2、0.09mg/cm2、0.08mg/cm2、0.07mg/cm2、0.06mg/cm2、0.05mg/cm2、0.04mg/cm2、0.03mg/cm2、0.02mg/cm2、0.01mg/cm2、0.009mg/cm2、0.008mg/cm2、0.007mg/cm2、0.006mg/cm2、0.005mg/cm2、0.004mg/cm2、0.003mg/cm2、0.002mg/cm2、0.001mg/cm2或是不可檢測的在水中的總有機碳(toc)的聚合物組成。在特定實施例中,在水中的toc小于在0.001mg/cm2至0.1mg/cm2、0.001mg/cm2至0.095mg/cm2、0.001mg/cm2至0.075mg/cm2、0.001mg/cm2至0.05mg/cm2、0.001mg/cm2至0.01mg/cm2、0.001mg/cm2至0.005mg/cm2、或0.001mg/cm2至0.025mg/cm2范圍內的量。在特定實施例中,在水中的toc小于在0.01mg/cm2至0.1mg/cm2、0.01mg/cm2至0.075mg/cm2、0.01mg/cm2至0.05mg/cm2、或0.01mg/cm2至0.025mg/cm2范圍內的量。在特定實施例中,在水中的toc小于在0.05mg/cm2至0.1mg/cm2、0.05mg/cm2至0.09mg/cm2、0.05mg/cm2至0.075mg/cm2、或0.05mg/cm2至0.06mg/cm2范圍內的量。在特定實施例中,在水中的toc小于在0.005mg/cm2至0.1mg/cm2、0.005mg/cm2至0.095mg/cm2、0.005mg/cm2至0.075mg/cm2、0.005mg/cm2至0.05mg/cm2、0.005mg/cm2至0.025mg/cm2、或0.005mg/cm2至0.01mg/cm2范圍內的量。
在具體實施例中,氟化乙烯丙烯(fep)的toc為0.00005mg/cm2(0.001mg/g);硅酮材料如硅酮配管的toc為0.021mg/cm2(0.023mg/cm)和0.008mg/cm2(0.009mg/cm)的制品的內部潤濕表面;歷史上使用的細胞培養(yǎng)袋的toc為0.002mg/cm2的制品的內部潤濕表面(0.032mg/g的制品)。
本領域技術人員認識到,如果采用mg/cm2單位,則可跨越不同提取比/稀釋度比較toc值。如果單位是mg/l,則必須知道提取比。轉換可如下發(fā)生:機器輸出以mg/l為單位的值,將稀釋度考慮在內,然后使用要提取的表面積和總體積將該數(shù)目轉換為mg/cm2。提供了關于硅酮biosil的例子:
硅酮biosil樣品:302mg/l*1l/1000ml*23.7ml/347cm2=.021mg/cm2。
在特定實施例中,以mg/cm2單位比較toc,因為不需要提取比或任何稀釋度。
下文是關于硅酮管biosil樣品和硅酮管sr139樣品的toc計算的例子。
測試制品提取
toc分析結果
下文是關于fep袋和baxter袋(主要由sebs(苯乙烯嵌段共聚物)組成并且還可包含eva和pp的單層袋)的toc計算的例子:
測試制品提取
toc分析結果
在具體實施例中,pmp膜的toc為0.07ppm(0.00002mg/cm2)。
在具體實施例中,容器包含內表面,其包含具有小于1mg/cm2、0.1mg/cm2、0.09mg/cm2、0.08mg/cm2、0.07mg/cm2、0.06mg/cm2、0.05mg/cm2、0.04mg/cm2、0.03mg/cm2、0.02mg/cm2、0.01mg/cm2、0.009mg/cm2、0.008mg/cm2、0.007mg/cm2、0.006mg/cm2、0.005mg/cm2、0.004mg/cm2、0.003mg/cm2、0.002mg/cm2、0.001mg/cm2等等的在水中的總有機碳(toc)的聚合物。
iii.適體和適體觸角的產(chǎn)生
本公開內容的實施例允許從包含數(shù)百種不同種類的細胞的血液樣品中分離一種細胞。這樣的過程需要非常特異性的工具,所述工具對所需細胞(如單核細胞)是特異性的,并且不識別任何其他細胞(包括其他血細胞)??删哂羞@種特異性的抗體具有許多缺點,包括復雜的程序,需要在體內合成,并且它們可對細胞生成剪切應力和空間效應,潛在地改變其功能性;此外,抗體僅對細胞提供一個附著點。
適體是結合特異性靶分子的寡核酸或肽分子。它們可為單鏈dna或rna寡核苷酸,其可以高特異性和親和力和低毒性結合幾乎所有類別的小分子或大分子。核酸適體通常通過從大型隨機序列庫中進行選擇來產(chǎn)生,例如通過稱為selex的過程:其代表指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)。它們對其目標具有無與倫比的特異性,因為它們的小尺寸和3d構象使得它們比抗體對目標更特異性。例如,適體甚至可區(qū)分對映體和蛋白質同種型。產(chǎn)生適體的細胞類型特異性selex方法可為任何種類的,特別是基于活細胞的selex(參見例如ye等人(2012);ozer等人(2014);sun等人(2014);以及zhou和rossi(2014)。
在特定實施例中,用于分離所需細胞類型的特定適體序列適用于從相同生物物種或屬或族的任何個體中分離相同的細胞類型。在其他實施例中,用于分離所需細胞類型的特定適體序列僅針對特定個體是特異性的。
在特定實施例中,鑒定了可用于分離所需細胞類型的超過一種適體序列,并且多個適體序列用于本公開內容的系統(tǒng)中。
在一些情況下,適體具有與之附著的部分,其中所述部分可為可檢測的和/或可能能夠結合另一部分。該部分可為結合對的一個成員,例如生物素或抗生物素蛋白種類。將生物素或抗生物素蛋白附著至dna的方法是本領域已知的。
a.核酸適體的產(chǎn)生
在本公開內容的實施例中,設計適體以便從樣品中分離所需細胞,包括例如來自全血樣品的單核細胞。雖然適體可以各種方式設計,但在具體實施例中,利用selex方法。
selex是可靶向任何小分子、生物聚合物或細胞的體外方法。一旦已知適體的順序,就可例如在體外合成它。適體可大量快速生產(chǎn),并且非常穩(wěn)定:其貯存期限是無限的。此外,可對其添加使其更容易與表面結合的主鏈。適體已經(jīng)在生物制藥行業(yè)中使用,并且仍未顯示免疫原性的證據(jù)。
在具體實施例中,cell-selex方法用于生成用于本公開內容的系統(tǒng)的適體。適體基本上是dna的一部分,并且它可為多聚的。它是核苷酸序列,由四個不同單元的獨特組合制成的聚合物:a、t、c、g。一旦已知對目標特異性的適體的代碼,它就很容易合成。cellselex方法由selex方法修改,以生成對一種細胞高度特異性的適體。在該方法中,將單鏈dna(ssdna)文庫與靶細胞一起溫育。洗去非結合序列,并且例如通過在95℃下加熱細胞-dna復合物,隨后離心,從細胞中回收結合的序列。將回收的庫與對照細胞系一起溫育,以過濾掉與目標和對照兩者上的共同分子結合的序列,導致針對目標的特異性結合物的富集。例如通過聚合酶鏈反應(作為pcr眾所周知)擴增結合序列。這隨后為反義鏈的去除,以生成用于后續(xù)輪選擇的ssdna庫??赏ㄟ^流式細胞術結合測定來監(jiān)測所選擇的庫的富集,與未經(jīng)選擇的dna文庫相比,所選擇的庫具有增加的熒光。
一旦鑒定了一種或多種適體,就可用其使表面官能化,以分離所需細胞,例如袋或管??墒褂靡蕾囉谶m體來分離細胞的替代技術,例如親和層析,用適體官能化的磁珠、塑料珠或玻璃珠,或者含有適體的水凝膠,或者含有適體的板,只要這些技術用于例如封閉系統(tǒng)中。在特定實施例中,結構可包含含氟聚合物層或以其他方式具有含氟聚合物層。
b.肽適體的產(chǎn)生
肽適體可選自組合肽文庫,例如通過噬菌體展示和其他表面展示技術(包括mrna展示、核糖體展示、細菌展示或酵母展示)構建的文庫。肽適體是具有在兩端上與蛋白質栓系的單個可變環(huán)區(qū)的小而簡單的肽。在至少一些情況下,肽適體由長度為8至20個氨基酸的可變肽區(qū)組成,并且可變區(qū)由支架蛋白(例如硫氧還蛋白)展示。文庫系統(tǒng)及其設計是本領域已知的(borghouts等人,2008和reverdatto等人,2013,其以引用的方式全文并入本文)。
c.適體觸角的產(chǎn)生
在特定實施例中,系統(tǒng)中的超過一個適體/分子用于最大化所需細胞與系統(tǒng)的容器的結合(盡管在替代的情況下,在觸角中僅采用一個適體)。在特定實施例中,在單個觸角分子中重復利用相同類型的兩個或更多個適體。在這種情況下,并非一個適體與表面結合,而是具有至少幾倍適體序列的長鏈dna(或氨基酸)與表面結合。適體觸角類似于章魚觸角,具有對所需細胞非常特異性的多個“吸盤”。
在具體實施例中,肽適體觸角通過化學合成產(chǎn)生。在一些情況下,通過從包含表達構建體的相應核酸載體的表達產(chǎn)生肽適體觸角,所述表達構建體指導作為多肽的肽適體觸角的表達。
這些觸角與細胞特異性適體的利用對于輕輕捕獲所需細胞是有用的。事實上,通過這些觸角的捕獲是無害的,因為幾個觸角能夠捕獲一個細胞,導致低剪切應力而高捕獲效率。
為了從觸角釋放細胞,可采取一個或多個步驟。釋放細胞的方法的例子包括使用限制性酶來切割dna,使用核酸(dna或rna)來置換細胞,和/或加熱。在使用加熱時的某些實施例中,加熱可為例如在45-50℃的溫度范圍下約10秒至約5分鐘的持續(xù)時間。
觸角的策略具有許多優(yōu)點:與樣品的一步分離;單次使用;低剪切應力,所以細胞無傷害或最低限度的傷害;高特異性;以及與抗體或單一適體相比,改進的捕獲速率。
iv.用于系統(tǒng)的示例性材料和系統(tǒng)的制備
a.一般方面
用于系統(tǒng)的表面中的材料包括具有小于0.1mg/cm2的在水中的總有機碳(toc)的聚合物。含氟聚合物在系統(tǒng)的實施例中是有用的,因為它們是惰性的,含有低可提取物,具有低浸出性,具有足夠的o2和co2氣體可滲透性,具有低透水性,是柔性的并且很強。
在本公開內容的特定實施例中,系統(tǒng)的不同步驟在分開的容器中發(fā)生。在具體實施例中,除了一個或多個入口/出口之外,容器是封閉的實體。在具體方面,除了一個或多個入口/出口之外,系統(tǒng)整體是封閉的實體。容器可為任何類型的,但在具體實施例中,容器是袋、管、珠(例如包封在封閉容器中的珠)、燒瓶、滾瓶或剛性容器。在特定實施例中,系統(tǒng)中的一個或多個容器被修改為從樣品中捕獲所需細胞。
在某些實施例中,系統(tǒng)的每個步驟都在分開的容器中發(fā)生,盡管在替代實施例中,一個或多個步驟在相同容器中發(fā)生。在示例性情況下,第一容器用于細胞分離,第二容器用于細胞生長(在一些實施例中,例如單核細胞的擴增以產(chǎn)生初始細胞),第三容器用于細胞轉化(其可視為細胞的活化,包括例如用抗原的單核細胞活化),并且第四容器用于細胞濃縮(并且至少在一些情況下,活化細胞的純化)(圖1a-1b)。
在具體實施例中,第一容器允許從樣品中分離所需細胞。雖然來自樣品的細胞可為來自任何種類的樣品的任何種類的細胞,但在具體實施例中,細胞是來自血液樣品包括未經(jīng)處理的血液樣品的所需細胞(例如單核細胞)。
本公開內容的實施例包括用適體觸角的容器(例如袋)的官能化,以從樣品(例如血液)中選擇細胞(例如,免疫細胞)。適體與細胞表面的特定結構物理相互作用并且捕獲細胞(圖2或8)。在一些情況下,與適體相互作用的細胞表面的具體結構是系統(tǒng)的用戶已知的,而在其他情況下,結構是未知的。該過程可在例如圖2所示的物理袋中實現(xiàn)。
在特定的例子中,容器中允許充分暴露于血液樣品所需的面積為對于94ml血液380cm2。
圖9示出了細胞被含有適體的容器捕獲后的細胞釋放。細胞可通過任何適當?shù)姆椒ㄡ尫?,但在具體實施例中,容器被足夠加熱,使得適體從結合的細胞分離(其可稱為熔體)。然后可收獲細胞或進一步處理細胞。用于釋放細胞的其他方法是用酶例如限制性酶消化核酸適體(并且所得到的釋放細胞和酶的混合物可進一步處理或可不進一步處理,以去除酶蛋白質)。用于釋放被捕獲的細胞的另外方法包括用與適體(適體序列的部分或全部)互補的dna從適體置換細胞。
關于分離單核細胞的本公開內容的具體方法的例子集中于下述:
1)從個體收獲單核細胞;
2)離體培養(yǎng)細胞并且使其分化成初始樹突狀細胞;
3)通過使初始樹突狀細胞暴露于特定抗原來使初始樹突狀細胞成熟;和
4)將治療有效量的活化的成熟樹突狀細胞注射回個體,并且允許細胞治療活化免疫系統(tǒng)并對抗靶抗原(例如表達抗原的癌細胞)。因此,樹突狀細胞被放回到個體的體內,以使其自己對抗醫(yī)療狀況。
因此,在一些情況下,用本公開內容的系統(tǒng)捕獲單核細胞。單核細胞是非常敏感的細胞,其可在與幾乎任何表面接觸時被活化。含氟聚合物表面不活化單核細胞,并且因此使用含氟聚合物材料的系統(tǒng)可避免這種活化。另外,需要在封閉系統(tǒng)中擴增細胞,需要o2的連續(xù)輸入和co2的輸出,同時保持不透水性。這些都是fep的特征,fep是具有良好的氧和二氧化碳滲透性以及對水的低滲透性的含氟聚合物。另外,為了能夠運輸和保存細胞,需要具有承受非常低的溫度(即低溫貯存)的能力的系統(tǒng)。fep是在低溫下繼續(xù)非常良好地發(fā)揮功能的材料。所有這一切使fep成為系統(tǒng)材料的有用選擇的良好例子。
圖8示出了用于生產(chǎn)系統(tǒng)的步驟的示例性實施例,包括將適體鏈接枝到容器的表面。在示例性情況下,步驟1包括用羧酸使基材(例如含氟聚合物,包括氟化乙烯丙烯(fep))膜的表面官能化。下一步包括經(jīng)由肽鍵共價連接蛋白質與羧酸;在具體實施例中,蛋白質具有與其結合的配體,使得進一步的處理將允許另一實體與蛋白質的結合。在具體情況下,蛋白質是抗生物素蛋白,使得與另一個實體結合的生物素可間接地結合到官能化表面。圖8允許蛋白質與配體的偶聯(lián),例如抗生物素蛋白與用于適體的生物素化的環(huán)狀模板的偶聯(lián)。最后一步包括模板的滾環(huán)擴增以產(chǎn)生適體觸角。圖3證實了官能化基材的例子的產(chǎn)生,其中將
在替代實施例中,將生物素化的珠附著至fep基材用于分離目的細胞(圖4)??赏ㄟ^滾環(huán)擴增在珠的表面上生成適體。在特定實施例中,生物素化的珠與具有與之附著的抗生物素蛋白的適體一起利用。在具體實施例中,用抗生物素蛋白涂布的珠可捕獲生物素化的適體/抗體。在特定實施例中,珠可附著至fep或不附著至fep。在某些實施例中,珠由fep組成,并且提供從樣品中分離出所需細胞的替代方法。例如,抗生物素蛋白涂布的fep珠(或另一種材料)可暴露于生物素化的適體,以導致fep珠被適體涂布,然后這些暴露于樣品例如血液樣品。例如,單核細胞將附著至這樣的珠,然后可使它們流過特定的過濾器/膜,該過濾器/膜保持具有與之附著的目的細胞的珠與血液的剩余部分分離。然后,可使用解離方法(如加熱、酶等)以從珠中去除細胞。
在具體實施例中,將生物素加入適體的末端。生物素是維生素,其常用于將生物蛋白質連接至表面。生物素與中性抗生物素蛋白具有強親和力,所以中性抗生物素蛋白可連接至基材的表面,然后生物素化的適體的模板由此與表面間接連接。在特定方面,中性抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)在表面上以足夠高的密度連接,并且在具體實施例中,fep表面用cooh官能化。
在具體實施例中,系統(tǒng)的環(huán)境有助于維持由本公開內容的系統(tǒng)分離的任何細胞的完整性。該系統(tǒng)被配置為允許細胞充分暴露于氧、水、細胞因子和/或葡萄糖。該系統(tǒng)還被配置為防止細胞暴露于有害水平的有害物質,例如二氧化碳、碳酸和/或乳酸。
b.基材
至少一些系統(tǒng)實施例包括多個層。在特定實施例中,第一層由具有低浸出性、低提取性并且不與細胞有害反應的材料組成。第一層可視為薄膜或膜。在某些實施例中,該層包含聚合物。在具體實施例中,構成容器的潤濕表面的聚合物具有小于0.1mg/cm2的在水中的總有機碳(toc),并且可在構成容器的潤濕表面的表面上測量。在一些實施例中,聚合物由硅酮、聚(氯乙烯)(pvc)或
在特定實施例中,第一層包含特定的厚度。在某些方面,該層的最小厚度為0.0003英寸。在至少一些情況下,該層的最大厚度為0.010英寸。
c.基材的官能化
本公開內容的實施例允許合適基材的官能化,使得其可用于直接或間接附著適體。在具體實施例中,因為適體直接附著至表面,所以表面不需要官能化。例如,可不利用系統(tǒng)的抗生物素蛋白/生物素實施例,并且在某些實施例中,存在生物部分與含氟聚合物的cooh(作為例子)表面的直接附著。在其中適體直接附著至表面的情況下,可將dna適體例如直接綴合到改性表面,使用在其中適體用nh2端官能化的情況下的含nh2蛋白質的類似途徑(例如通過戊二醛接頭或馬來酰亞胺接頭;參見例如ponche等人,2012)。在這樣的實施例中,可避免使用抗生物素蛋白層,并且將適體直接附著至改性表面。在具體實施例中,例如經(jīng)由特定端基(例如氨基、醛基或環(huán)氧基)將dna適體固定至表面(參見oh等人,2006)。例如,當用醛官能化的表面開始時,可使用席夫堿反應來固定dna適體(mcgettrick等人,2009)。其他功能性dna端基可包括氨基、生物素、疊氮化物、硫醇、二硫酚、地高辛、nhs酯、辛二炔基(octadiynyl)、羧基、羥基、醛基、羰基、胺基、亞胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔基、烯基、氮丙啶基、環(huán)氧基、異腈基、異氰化物基、四嗪基、重氮表面基團、炔基、烯基、氮丙啶基、環(huán)氧基、異腈基、異氰化物基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基和/或重氮基。
在其中表面需要被官能化的實施例中,存在可采用的至少四種一般的固定技術:1)物理吸附;2)電化學活化;3)電化學接枝;和4)抗生物素蛋白-生物素親和力(在ocana和delvalle,2013年在石墨復合電極的背景下綜述)。在其中基材需要被官能化的特定實施例中,存在給予特定起始表面的各種眾所周知的反應途徑。起始表面的例子包括羧基、羥基、醛基、羰基、胺基、亞胺基、酰胺基、酯基、酸酐基、硫醇基、二硫化物基、苯酚基、胍基、硫醚基、吲哚基、咪唑基、氨基乙基酰胺基、炔基、烯基、氮丙啶基、環(huán)氧基、異腈基、異氰化物基、四嗪基、重氮表面基團、炔基、烯基、氮丙啶基、環(huán)氧基、異腈基、異氰化物基、四嗪基、烷基、氨基乙基酰胺基、酯基、重氮基或其組合。所選擇的官能化將決定需要不同試劑和不同固定化學的反應(例如,希夫堿附著至醛相對于edc/nhs附著至羧酸)。在具體實施例中,采用其中與蛋白質上的nh2基團形成鍵的反應。作為例子,含氟聚合物可以各種方式實現(xiàn)這種不同的官能性:等離子體處理、化學改性、接枝等等。
在具體實施例中,可受益于使用fep作為基材的優(yōu)點,所述fep具有與單核細胞無反應的表面,用于用適體捕獲細胞。因此,在特定實施例中,存在用生物分子的fep表面的官能化。圖8顯示了在fep基材(例如膜)的表面上產(chǎn)生觸角的示例性步驟。四個示例性步驟描述了可如何使容器官能化。第四步可使用稱為phi29dna聚合酶的酶發(fā)生。滾環(huán)擴增(rca)發(fā)展了數(shù)百到數(shù)千個模板鏈的拷貝,并且是生物工業(yè)中眾所周知的過程。模板是由兩部分組成的圓:一個是反適體的編碼,并且另一個不編碼。當酶發(fā)展觸角時,它將收集與模板編碼互補的核堿基,并且制備它的拷貝。因此,觸角將包含適體和非編碼部分(也稱為間隔物)的序列;在具體方面,它是交替共聚物(a-b-a-b-a-b...)。觸角的最終長度可由反應時間來控制。在特定實施例中,適體觸角的長度在納米和微米之間,包括數(shù)百納米至數(shù)百微米。特定觸角中適體重復的長度或數(shù)目可與系統(tǒng)中的另一觸角有關而變。在某些情況下,適體重復數(shù)目為2或更多、10或更多、數(shù)十個重復或更多、數(shù)百個重復或更多、數(shù)千個重復或更多、數(shù)萬個重復或更多等等。
在特定實施例中,羧酸在基材例如fep基材的表面上生成。在具體實施例中,可采用可在基材的表面上提供cooh基團的任何化學反應(參見,例如,tong和shoichet,1998)。在具體實施例中,所用的處理是等離子體,包括例如用于含氟聚合物的改性等離子體處理:c處理。c處理增加了fep袋的表面上極性基團的存在,最終允許細胞粘附。
在采用經(jīng)c處理的膜的實施例中,并且為了使用經(jīng)c處理的膜作為開始開發(fā)cooh官能化的fep表面的基礎,表征了表面。在x射線光電子能譜(xps分析)、傅里葉變換紅外光譜法、掃描電子顯微鏡檢查、飛行時間二次離子質譜法(tof-sims)的組合中,確定在經(jīng)c處理的fep基材的表面上存在的羰基是已在表面上均勻接枝的小有機鏈中的醛或酮。因此,在用cooh使表面官能化的具體方面,用氧化進一步使表面反應。
在其中存在更多酮的實施例中,合成策略是在羰基的α中引入氧原子,將酮轉變成酯。為了處理該反應,可使用過酸,如mcpba(間氯過氧苯甲酸)。在第二步中,可處理皂化來切割酯并得到羧酸。
在其中存在更多醛的實施例中,可強烈地氧化表面,將醛轉變?yōu)轸人帷T谔囟ǚ矫?,通過使用高錳酸鉀(kmno4)與硫酸(h2so4)濃溶液強烈地氧化表面。通過ftir分析反應結果。如圖10中已知的,結果顯示-oh峰的明確的強烈增加,考慮到反應,這只能來自醛轉化為羧酸。在具體實施例中存在羰基峰的略微增加,其來自醇氧化成羰基。在圖5的光譜上,存在反應的經(jīng)c處理的膜光譜、未反應的經(jīng)c處理的膜光譜和反應的未經(jīng)處理的膜光譜。未經(jīng)處理的膜光譜用作陰性對照,因為未經(jīng)處理的fep不應與kmno4反應。該膜不具有-oh或c-o的增加,這是預期的結果??稍谳^高的溫度和時間下運行反應,以便觀察這些變量中的任一個是否是潛在限速的。
因此,存在表示3%表面的c=o量。根據(jù)結果,醛是這些基團的主要部分。它們轉變成羧酸,因此在具體實施例中,至少1%的表面用cooh官能化。1%的表面代表1個羧基/2nm2。然而,中性抗生物素蛋白覆蓋約25nm2,因此當表面被均勻地覆蓋時,對于一種蛋白質將存在至少10個羧基,這足以設計一個共價鍵。然而,對于cooh的量計算的百分比基于xps的結果,其給出了10納米深度上的o百分比。因此,實際上,可預期具有超過0.5個cooh/nm2。
在氧化不設計足夠的羧酸的情況下,可采用替代反應。在具體實施例中,利用格氏試劑。實際上,在無水環(huán)境中,可在碳和鹵素之間引入鎂原子。以這種方式設計的r-mg-x是非常反應性的,并且允許添加具有特定功能的碳鏈(例如羧酸)的選項。在設計格氏試劑的某些情況下,如果反應對氯或溴不是太困難,則它對于氟可能更復雜,盡管仍可用溶劑的正確選擇和催化劑進行處理。一個例子在以引用的方式全文并入本文的“preparationofalkylmagnesiumfluorides”,(yu,1971)中描述。其中,在大氣壓回流的條件下,使用碘作為催化劑,1,2-二甲氧基乙烷作為溶劑,在4小時內以92%的產(chǎn)率產(chǎn)生正己基氟化鎂。
然而,存在用于將cooh基團賦予表面的各種選項。在具體實施例中,在基材的表面上生成羧酸包括例如丙烯酸的接枝(參見例如racine等人,2010)。在fep的表面上獲得cooh的另外的反應包括下述:1)通過使未經(jīng)處理的fep暴露于萘鈉處理的表面還原,隨后為通過使經(jīng)處理的fep暴露于硫酸中的kclo3的表面氧化;和2)使未經(jīng)處理的fep暴露于氨等離子體,其中將樣品保持在無氧區(qū)室中,以便限制在經(jīng)處理的表面上的氧攝取,隨后為使經(jīng)處理的表面暴露于在丙酮中的戊二酸酐溶液。
在某些實施例中,除羧酸外的部分在基材的表面上產(chǎn)生,并且這種改性可通過本領域的任何合適的方法發(fā)生。例如,可通過用在基材的表面上的醛開始的?;磻?,將聚合物與蛋白質綴合(srivastava等人,2014)。另外,可采用具有戊二醛(或例如環(huán)狀半縮醛或聚合半縮醛)的氨基官能化的乙酸纖維素,以獲得用于共價生物分子優(yōu)化的活化表面(heikkinen等人,2011)。
用于產(chǎn)生官能團(例如cooh基團)的方法包括使用氣體例如氬、氫、氮、二氧化碳及其組合的處理的等離子體活化。在具體實施例中,等離子體活化在低壓例如0.1托至0.6托,或接近大氣壓,例如700托至760托下實現(xiàn)。在氣體(例如氬、氮和氫或其組合)下的表面的電暈活化可用于在表面中產(chǎn)生可進一步用于化學處理中的活性位點。化學處理可包含通過化學反應對活性或現(xiàn)有表面的序貫化學改性,所述化學反應包括接枝聚合、偶聯(lián)、點擊化學、縮合和加成反應。例如,可通過經(jīng)由自由基聚合使乙烯基單體(丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸烷基酯、苯乙烯、二烯、α-烯烴、鹵代烯烴、(甲基)丙烯腈、丙烯酰胺、n-乙烯基咔唑、馬來酸酐和n-乙烯基吡咯烷酮)聚合來實現(xiàn)在溶液中的接枝聚合。
d.抗生物素蛋白種類與表面的連接
在特定實施例中,包含羧酸的表面具有與之附著的蛋白質種類,例如抗生物素蛋白種類。蛋白質種類可通過任何合適的方法附著至羧酸基團,包括例如吸附或綴合。抗生物素蛋白種類在各種種類上的吸附是本領域已知的(albers等人,2012;orelma等人,2012;vermette等人,2003;vesel和elersic,2012;vesel等人,2012)并且在具體實施例中,技術人員考慮到,如果緩沖液的ph處于蛋白質獲得與界面相反的電荷的點,則蛋白質在親水界面上吸附更多。另外,抗生物素蛋白種類在各種種類上的綴合也是本領域已知的。這些方法包括用edc和nhs的活化(orelma等人,2012;fabre等人,2012;vermette等人,2003;vesel等人,2012;xia等人,2012)。
在具體實施例中,基材的表面是經(jīng)c處理的氧化的fep(用羧酸官能化)。在初步研究中,可利用小表面,例如1cm2。考慮到具有約1個cooh/nm2,在1cm2上存在106個cooh。以摩爾計,這對應于約1.7*10-18摩爾。另一個限制因素是表面的大?。阂粋€蛋白質覆蓋約20nm2,所以不能將超過50000個蛋白質連接至表面??墒褂么罅窟^量的蛋白質,如5,000,000個蛋白質,這對應于8.3*10-18摩爾??股锼氐鞍字亓考s66kda;它對應于6.6*104g.mol-1。然后,溶解的蛋白質的質量為5.5*10-13g。這個數(shù)字表明對于每個初步研究可利用最小量的蛋白質。起始量的一個例子是可能的最小體積中的0.1mg/ml蛋白質。
示例性方案提議:
i.第一步是用含有nhs(0.4mol.l-1)和edc(0.1mol.l-1)的乙酸鈉緩沖溶液(10mmol.l-1)活化表面。
ii.第二步是通過使用含有中性抗生物素蛋白(100ug.ml-1)的相同緩沖溶液(10mm)的中性抗生物素蛋白結合。
iii.然后,通過用以ph8.5的0.1m乙醇胺洗滌系統(tǒng)可去除過量的nhs酯。然而,在過程中,這個步驟不是必需的,因為未預期過量的nhs酯。
iv.最后一步是去除非特異性結合的中性抗生物素蛋白:為此,用100mm甘氨酸-hcl溶液(用hcl和naoh將ph調節(jié)至2.5)洗滌系統(tǒng)。
為了確定蛋白質是否是連接的,可采用afm、ftir、ζ電位、拉曼、蛋白質660nm測定、bradford測試、elisa測試、熒光顯微鏡方法或tof-sims來檢測肽鍵。
e.適體附著至fep表面
為了證實dna與fep表面的附著,可將生物素化的物體附著至與fep結合的中性抗生物素蛋白。在具體實施例中,可使用生物素化的熒光素,其在uv燈下可允許檢測固定的蛋白質。在其他情況下,可使用生物素化的聚合物珠;偶聯(lián)到eds檢測器的sem將檢測聚合物珠。在特定實施例中,可使用生物素化的長的隨機dna鏈:與eds檢測器偶聯(lián)的sem將檢測dna中存在的磷的量,如果它是固定的話。
v.細胞分離的替代實施例
在利用適體觸角分離所需細胞的替代實施例中,可注入對樣品中的所需細胞特異性的生物素化適體,隨后將混合物提供至在中性抗生物素蛋白中涂布的容器以選擇性捕獲生物素,然后在去除樣品后保留所需細胞。
為了分離所需細胞,可用適體選擇性地靶向它們,并且可通過細胞selex方法來改造適體。一旦對所需細胞特異性的適體的序列是已知的,就可以更高數(shù)量合成它們。在其中所需細胞是單核細胞的情況下,在單核細胞上存在的至少一種表面標記物的確存在,cd14。用化學合成的這些適體用生物素進行官能化。也可制備具有涂布有中性抗生物素蛋白或另一種生物素-結合蛋白(抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白)的內表面的fep容器。為了實現(xiàn)這點,可首先用羧基使fep表面官能化,然后用肽鍵將蛋白質連接至表面(通過nhs和edc催化的反應)。
在圖11中示出了示例性過程。該過程的第一步是將適體與樣品如100ml血液樣品混合。單核細胞在端部用生物素化的適體標記。然后,在第二步中,可用血液樣品填充管,允許生物素通過中性抗生物素蛋白特異性地連接至表面(生物素-中性抗生物素蛋白復合物的kd為1015)。在第三步中,可通過用培養(yǎng)基(例如將用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基)填充管來去除樣品。第四步是使細胞從管壁脫離。可使用酶來切割適體或使用酶來消化細胞的表面上存在的蛋白質?;蛘撸部杉訜峁?例如,48度2分鐘);加熱將使適體變形并釋放細胞。在最后一步中,將細胞收集在另一容器,例如由fep組成的容器中。
vi.來自系統(tǒng)的經(jīng)分離的細胞的示例性應用
用本公開內容的特定方法分離的細胞可在細胞從適體釋放后用于一種或多種應用,或者可在進一步的處理步驟后利用細胞。在具體實施例中,由本公開內容的系統(tǒng)分離的細胞可用于貯存,隨后為未來使用,包括用于一個或多個個體的治療的未來臨床用途。在特定實施例中,通過本公開內容的系統(tǒng)分離的細胞被遞送至有此需要的個體,在某些實施例中包括直接遞送至有此需要的個體。可進一步處理細胞,例如進一步濃縮細胞,加入藥物載體,添加生物試劑(例如細胞因子(包括一種或多種白細胞介素)、趨化因子、生長因子或活化抗原呈遞樹突狀細胞的任何因子),細胞的重組操作,例如改造細胞以表達一種或多種特定t細胞受體、嵌合抗原受體等等。然而,在某些實施例中,細胞通過本公開內容的系統(tǒng)充分制備,使得它們可用于直接遞送至需要細胞治療的個體。個體可以是或也可以不是由其獲得包含細胞的原始樣品的個人。因此,在用系統(tǒng)分離后遞送到個體的細胞可為與個體自體的(屬于同一個體)或與個體同種異體的(屬于除由其獲取樣品的個體外的個體)。進行系統(tǒng)步驟的個人可以是或可以不是從個體獲得樣品的人或將樣品遞送至有此需要的個體的人。
本公開內容的特定實施例利用通過系統(tǒng)分離的細胞用于哺乳動物的細胞治療。在具體實施例中,細胞被用作具有醫(yī)療狀況的個體的個性化藥物。在具體實施例中,醫(yī)療狀況是癌癥、關節(jié)修復(包括脊椎盤)、神經(jīng)系統(tǒng)修復或自身免疫病癥。在特定方面,細胞被用作例如免疫原性組合物,包括疫苗。在其中個體患有癌癥的實施例中,從系統(tǒng)中分離的細胞可能對個體的癌癥的腫瘤抗原是特異性的。
在特定實施例中使用本公開內容中概述的方法將特定細胞類型捕獲到表面上可用于除細胞類型與細胞混合物分離之外的應用。例如,在具體實施例中,在一些共培養(yǎng)應用中,將一種細胞類型錨定至表面,同時仍與懸浮中的細胞相互作用可能是有用的,以便能夠區(qū)分兩個群體。此外,對于優(yōu)先作為貼壁培養(yǎng)物生長的細胞,在一些實施例中,利用所概述的方法來允許細胞在培養(yǎng)期間可逆地對接到表面可能是有用的;無論表面是平坦表面還是球形表面如在微載體上的發(fā)現(xiàn)的那種表面。
vii.本公開內容的試劑盒
本文所述的系統(tǒng)或方法的任何組分均可包含在試劑盒中。在非限制性例子中,用于捕獲生物試劑的器械可包括在試劑盒中的合適容器手段中。該器械可為任何種類的,只要它被配置為允許在其上放置聚合物。該器械可為袋,并且在一些情況下是可視為管的細長袋。試劑盒可包含用于該器械中的一種或多種含氟聚合物(包括用于該系統(tǒng)的器械),器械包含含氟聚合物、一種或多種反應性部分、用于與反應性部分一起使用的一種或多種接頭、合適的試劑和/或用于從個體提取樣品的一種或多種裝置和/或試劑。本公開內容的試劑盒還可包含下述中的一種或多種:抗原;用于樣品收集或貯存的器械(例如小瓶、注射器、杯子、手術刀或其組合);聚合酶(例如phi29聚合酶);內切核酸酶;以及緩沖液。
試劑盒可包括適當?shù)确值囊后w,用于方法中或用于制備用于方法中的器械。試劑盒的某些組分可在水性介質中或以凍干形式包裝。試劑盒的容器手段一般可包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他容器手段,組分可置于其內,并且優(yōu)選適當?shù)氐确?。如果試劑盒中存在超過一種組分,則試劑盒一般還包含另外的組分可分開置于其內的第二容器、第三容器或其他另外的容器。本發(fā)明的試劑盒通常還包括用于將所述試劑盒的任何組分包含在密閉約束中商業(yè)銷售的手段。這樣的容器可包括例如所需組分保留在其內的注射或吹塑塑料容器。
當試劑盒的某些試劑在一種或多種液體溶液中提供時,液體溶液可為水性溶液,例如包括無菌水性溶液。在這種情況下,容器手段本身可為注射器、移液管和/或其他這樣的類似器械。然而,在一些情況下,試劑盒的組分可作為干粉提供。當試劑和/或組分作為干粉提供時,可通過加入合適的溶劑來重構粉末。設想溶劑也可在另一個容器手段中提供。
本公開內容的試劑盒還可包含下述中的一種或多種:抗原;用于樣品收集或貯存的器械(例如小瓶、注射器、杯子、手術刀或其組合);聚合酶(例如phi29聚合酶);內切核酸酶;以及緩沖液。
實例
包括下述實例以證明本發(fā)明的優(yōu)選實施例。本領域技術人員應了解,下述實例中公開的技術代表由發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實踐中運作良好的技術,并且因此可視為構成用于其實踐的優(yōu)選模式。然而,根據(jù)本公開內容,本領域技術人員應當理解,可在所公開的具體實施例中作出許多改變,并且仍然獲得相同或相似的結果,而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實例1
經(jīng)分離的單核細胞數(shù)目的評估
本實例提供了在本公開內容的實施例中分離的單核細胞數(shù)目的評估。
考慮到管:r=0.5cm,l=1.2m=>v=94ml,s=3.8*10-2m2
一個單核細胞具有約7μm的半徑。那么,如果它是固定的,則它將覆蓋的平均表面是1.5*10-10m2。在管表面上可捕獲的單核細胞的最大數(shù)目為2.5*108個。在示例性的94ml血液中,存在7.5*107個單核細胞(假定在平均血液樣品中8*108個單核細胞/l的濃度)。假設25%的細胞捕獲效率、80%的釋放和80%的最終存活率,則分離出約1.2*107個活單核細胞。在某些方面,需要106至107個單核細胞來處理樹突狀細胞疫苗。
實例2
表面制備
該實例涉及在氟化乙烯丙烯(fep)上的表面官能化和蛋白質固定,所述氟化乙烯丙烯作為容器由其組成或具有由其制備的壁的材料的例子。在一些實施例中,蛋白質的固定可通過兩種不同的方法進行:物理吸附和化學綴合。在該實例中描述的所有研究都用在三種不同的fep膜表面(未經(jīng)處理的、經(jīng)c處理的和經(jīng)c處理的氧化的)上的兩類蛋白質(抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白)之一進行。在下文中提供了證實吸附和化學綴合以及膜氧化的方案的例子。
吸附
吸附實施例涉及蛋白質通過吸引力(例如靜電相互作用、疏水相互作用和親水相互作用或范德華力)在表面上的物理吸附。這種方法是直接的,并且吸附是自發(fā)的,只需要幾秒來啟動??煽紤]可能影響吸附過程并且最終影響蛋白質在表面上的行為的幾種內部和外部參數(shù)。外部參數(shù)如溫度、ph和離子強度可改變吸附的平衡狀態(tài)和動力學。例如,增加溫度將允許熵增益并且?guī)椭鷱谋砻驷尫盼降姆肿雍望}離子,并且?guī)椭鞍踪|的結構重排,這將使得更多的蛋白質能夠吸附至表面。緩沖液ph將影響蛋白質的靜電狀態(tài),并且將產(chǎn)生負電荷或正電荷,這將根據(jù)蛋白質的特定等電點(iep)改變與表面的吸引或排斥相互作用。最后,溶液中的高離子強度將增加蛋白質聚集的趨勢(表1;rabe2011)
為了完成該方法,表面僅與蛋白質溶液接觸短時間段(例如,幾秒或幾分鐘)。在此步驟之后,將表面輕輕洗滌并且準備用于下一步。這種方法的簡單性和速度使其成為獲得表面上的蛋白質層的主要候選物??煽紤]可影響反應可逆性(解吸)和吸附后的蛋白質穩(wěn)定性的各種參數(shù)。
表1:蛋白質的一般吸附趨勢(rabe,2011)
綴合
在另一個實施例中,存在蛋白質與表面的化學綴合。通過這種方法,蛋白質通過特定的化學反應共價偶聯(lián)至基材。為了完成這種方法,通過在fep的表面上加入羧酸基來使表面改性??墒褂脙刹椒▽崿F(xiàn)這一官能化。第一種方法稱為c-treatment,商購可得(saint-gobain)的表面,并且第二種方法是氧化反應。
當羧基存在于表面上時,羧基至胺的綴合可用于使蛋白質與表面結合。在具體實施例中,通過使用通常稱為edc(drumheller和hubbell2003)的水溶性碳二亞胺交聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽來活化羧基。
在用edc/nhs活化表面后,蛋白質與nhs酯試劑接觸并與表面結合。可優(yōu)化溫育時間,以便提高該方法的可擴展性。在綴合反應后,用甘氨酸-氯化氫(甘氨酸-hcl)溶液洗滌表面,以去除所有靜電結合的蛋白質。(orelma等人2012)
在特定實施例中,該附著方法誘導更穩(wěn)定的蛋白質層到表面。
膜選擇的例子
在具體實施例中,系統(tǒng)的容器包含氟乙烯丙烯(fep),并且在某些方面,fep可為未經(jīng)處理的fep、經(jīng)c處理的fep或氧化的經(jīng)c處理的fep。未經(jīng)處理的fep是相當疏水的(水接觸角:99°),并且具有相對低的表面能(19mj/m2)。蛋白質吸附可在該表面上發(fā)生,盡管在特定實施例中,表面是改性的。在其中進行綴合方法的實施例中,使fep表面改性以便獲得起始羧酸官能團。
經(jīng)c處理的fep(saintgobain)提供了必要的極性表面官能團,用于向表面添加-cooh基團的化學反應。c處理的效應是其提高膜的表面能(水接觸角:66°,并且表面能:38mj/m2),同時與其未經(jīng)處理的配對物相比也產(chǎn)生更親水的表面。表面能已知影響蛋白質對膜的吸附,使得在特定實施例中,經(jīng)c處理的fep膜成為吸附方法的替代候選物。
對于氧化的經(jīng)c處理的fep,進行氧化反應以向表面添加羧酸基團,以將蛋白質共價附著至fep。存在于膜上的-cooh基團允許edc/nhs反應并產(chǎn)生酰胺鍵以結合抗生物素蛋白。該反應可用兩種產(chǎn)物進行:0.8mm高錳酸鉀(kmno4)和0.12m硫酸(h2so4)。在特定實施例中,在表面上加入羧酸是能夠使蛋白質與表面共價結合的先決條件。在具體實施例中,該氧化反應使得經(jīng)c處理的fep膜更親水并且進一步增加了表面能。除了綴合之外,在具體實施例中,該氧化表面也是吸附過程的起始材料,因為它改變了表面能和潤濕性。
表2:三種不同類型的fep膜之間的比較
表面化學
方法用于評估膜表面上存在的元素和化學基團。對于表面表征,考慮了氧原子和/或醛、酮和羧酸基團的存在。在具體實施例中,在未經(jīng)處理的fep上僅可見c和f,在經(jīng)c處理的fep上存在n、o和醛/酮基團,并且在氧化的經(jīng)c處理的上存在cooh基團。對于具有蛋白質的樣品,集中于c、n和o的高度存在以及少量s。蛋白質上存在的主要化學基團是羧酸基(cooh)、酰胺鍵(cno)和伯胺(nh2)。
x射線光電子能譜(xps)
xps用于確定表面上的定量原子組成和化學。單能x射線轟擊樣品并引起電子射出。元素的鑒定由射出電子的動能進行。在
下文顯示了在未經(jīng)處理的fep上如預期的僅存在c和f原子。在經(jīng)c處理的膜上也檢測到n(2.6%)和o(3%)的存在。這些元素通過c-treatment添加到表面。表面上的氧原子可為醛和酮存在的指示劑。在下表3中,通過碳化學狀態(tài)分析,c=o鍵(3%c)的存在證實了羰基(c=o)基團存在于表面上。觀察到在氧化的經(jīng)c處理的上o的少量增加(3.4%),但這與預期結果不符。預期氧的量的重復是因為推斷向醛基添加另一個o的氧化反應。此外,雙鍵o(=o)看起來在氧化后降低。這可指示反應是從表面去除醛基或酮基,而不是在羧基中使它們改性。
表3:來自xps測量的碳化學狀態(tài)(以c的原子%表示)
xps方法用于驗證表面上蛋白質的存在。
表4顯示了不同類型的fep膜的xps測量。
數(shù)據(jù)以原子%顯示
表5顯示了未經(jīng)處理的膜和具有吸附的中性抗生物素蛋白的未經(jīng)處理的膜之間的區(qū)別。第二膜顯示了n和o的存在。在具有綴合的中性抗生物素蛋白的氧化的經(jīng)c處理的上可檢測到相同類型的信息。與氧化的經(jīng)c處理的樣品相比,n和o的高度存在指示在膜的表面上存在蛋白質。
表5顯示了不同類型的fep膜的xps測量。
蛋白
該方法提供了關于蛋白質的存在和不存在的信息,而其他方法可用于確定蛋白質的量和蛋白質層的均勻性。
傅里葉變換紅外光譜法(ftir)
ftir是提供關于固體或薄膜上的元素的化學鍵合的信息的非破壞性方法。ftir-atr方法用于在表面上聚焦,并且獲得分子振動光譜。光譜是背景和大氣校正的。數(shù)據(jù)被修改以獲得在4000-1400cm-1的光譜面積之間的吸光度選項中的信息。在該區(qū)域上進行了聚焦,以避免fep的cf鍵(1100-1300cm-1)的高信號。ftir光譜上的特定化學基團與其基團頻率之間的相關性是本領域已知的(coates2000)。
為了驗證樣品上蛋白質的存在,應該考慮在~1640cm-1處的酰胺基團面積的氧雙鍵(c=o)。與其中表面僅與naoac緩沖液接觸的對照膜相比,可明確看到吸附的蛋白質樣品上的該區(qū)域中的峰。該峰存在于具有吸附蛋白質的所有膜上,并且指示抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白兩者均可吸附在fep表面上。在未經(jīng)處理的和經(jīng)c處理的膜上,在抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白之間的峰強度中存在輕微差異。在具體實施例中,該差異來自吸附的蛋白質的量,并且這可通過其他定量方法來驗證。圖10-11顯示了具有固定化蛋白質的樣品光譜。
亞甲基藍染料(mb)
開發(fā)該方法以鑒定和測量在氧化和/或官能化后在膜上羧基的存在。亞甲基藍用于鑒定表面上的羧酸(-cooh)和非聚陽離子結合的羧酸根基團(-coo-)。該帶正電的染料被吸附在官能化表面上,并且通過可見光譜法在600nm的波長處測量。在特定實施例中,該程序利用浸漬步驟,其中官能化的膜與亞甲基藍溶液接觸10分鐘。其后,在測量之前將膜洗滌并干燥。通過對染色前和染色后的樣品進行測量,可觀察到在600nm波長處的吸收的存在。這顯示亞甲基藍的存在,因為它與膜的表面上可用的羧基和羧酸根基團結合。這種吸收中的變化在亞甲基藍溶液中染色后的氧化的經(jīng)c處理的樣品上在圖12、13和14中顯現(xiàn)。對照是有用的,因為背景可適時改變。實現(xiàn)比較的一種方法包括從最終吸光度測量中減去對照(空白)。
形貌和光學分析
方法涉及對表面形貌的評估,并且存在可見化學改性和蛋白質固定如何改變fep表面的視覺數(shù)據(jù)。
掃描電子顯微鏡檢查(sem)
一種分析方法包括掃描電子顯微鏡檢查(sem)。該方法提供了樣品表面的高分辨率和長景深圖像。sem用于察看表面的蛋白質層。在fep表面上觀察到不同層的圖案。由于未經(jīng)處理的膜的高疏水相互作用,在未經(jīng)處理的fep上觀察到的網(wǎng)狀層(圖15)可通過可能的蛋白質聚集來解釋。在這種情況下,優(yōu)先促進蛋白質與蛋白質的相互作用以獲得平衡狀態(tài)。在其他類型的fep膜上并未觀察到這種層(圖16)。
圖15d顯示了附著至表面的一些生物素涂布的聚苯乙烯微珠。預期這些珠的完整層以測試吸附的中性抗生物素蛋白的生物素結合位點(生物活性)的反應性。在未經(jīng)處理的膜上僅觀察到分散珠,并且其中幾個在經(jīng)c處理的和氧化的經(jīng)c處理的膜上。在具體實施例中,這種差異通過珠(d=1μm)和蛋白質(~20nm)之間的大尺寸差異來解釋。圖17更詳細地顯示了珠附著。在珠下觀察到蛋白質層的不同圖案。在左側角上也觀察到具有相同層圖案的另一個斑點。在具體實施例中,這通過蛋白質因為呈遞給珠的生物素的吸引力而改變其原始吸附構象來解釋。在樣品制備期間的吸引生物素力和沖洗步驟的組合可導致表面的生物素珠的損失,允許在表面上的中性抗生物素蛋白構象修飾的不同圖案痕跡。
光學顯微鏡檢查
借助于可見光和透鏡,光學顯微鏡檢查可用于獲得小樣品的放大圖像。圖18圖像顯示了附著至未經(jīng)處理的膜上的蛋白質層的生物素微珠的存在。這種技術可借助于標記如微珠或生色染料來幫助觀察蛋白質層的均勻性。
表面能
具有surpass的ζ電位
surpass是測量固體表面的流動電位/流動電流的儀器。固體表面的ζ電位可由平面樣品如fep膜的流動電流計算。使用固定的自動滴定系統(tǒng),可測量根據(jù)ph的ζ電位或根據(jù)表面活性劑濃度的的ζ電位。(antonpaar2013)。這種方法是敏感的,并且給出關于樣品在不同ph和表面的iep點下的表面能的信息。在具體實施例中,該裝置有助于表征在c處理、氧化反應和蛋白質吸附后的表面改性。在某些實施例中,在c處理和氧化后可見iep的增加,作為在相同離子和ph條件下獲得的ζ電位值的增加。來自surpass研究的數(shù)據(jù)可指示處理后fep膜的親水特性的增加??蛇M行關于氧化的經(jīng)c處理的fep的研究。
蛋白質測定
下文立即描述的方法用于直接測試蛋白質。證實了直接顯現(xiàn)蛋白質并驗證其穩(wěn)定性的方法。
660nm蛋白質測定
該方法使用與蛋白質中的主要堿性氨基酸殘基例如組氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸結合的染料-金屬絡合物(antharavally等人,2009)。在酸性條件下,試劑為紅棕色,但當染料-金屬絡合物與蛋白質結合時,試劑變?yōu)榫G色。使用uv-vis分光光度計在660nm處測量染料的最大吸收。該技術主要用于測量溶液中的蛋白質濃度,但在本文中被修改為鑒定在表面上的蛋白質。在具體實施例中,具有蛋白質的官能化表面與試劑接觸至少5分鐘。其后,在通過uv-vis光譜法測量吸收之前,將膜洗滌并干燥。
通過在染色蛋白質之前和染色蛋白質之后獲得樣品的測量,可在660nm波長處進行觀察。增加的吸收顯示在膜的表面上的蛋白質存在。當與其中僅具有緩沖液殘留物的膜與試劑反應的標記為“對照”的柱相比,察看代表在膜上的染色蛋白質的標記為“抗生物素蛋白”和“中性抗生物素蛋白”的第二列和第三列時,該效應可在圖19中顯現(xiàn)。當使用綴合和吸附方法時,可見蛋白質在具有兩種蛋白質的所有類型的膜上的蛋白質存在:抗生物素蛋白和中性抗生蛋白。未經(jīng)處理的fep上的抗生物素蛋白看起來顯示比所有其他方法更少的表面附著。可考慮用于制備蛋白質溶液的緩沖液選擇,因為一些緩沖液可與“蛋白質測定試劑”相互作用并且給出假陽性結果。圖20顯示了經(jīng)c處理的中性抗生物素蛋白譜660nm蛋白質測定。
洗滌實驗
在具體實施例中,可在膜上的蛋白質官能化之后使用兩次洗滌步驟來表征蛋白質穩(wěn)定性。第一種方法包括使用苛刻的離子型洗滌劑,例如十二烷基硫酸鈉(sds),其通常用于沖洗表面以去除蛋白質。該洗滌劑通過破壞非共價鍵和使蛋白質變性來影響蛋白質的分子3d構象。圖21顯示了在sds洗滌之前和sds洗滌之后具有吸附的中性抗生物素蛋白的氧化的經(jīng)c處理的膜。如預期的,sds幾乎完全去除蛋白質層和其他緩沖液殘留物。sds曲線(黃色)上的酰胺鍵峰在對照值(紅色)以下。通過該實驗,可確定可在蛋白質官能化表面上進行的沖洗步驟的極限。
第二種方法涉及使用超聲波發(fā)生器。該機器一般用于洗滌表面并通過沖擊去除鹽和灰塵殘留物。圖22和23顯示了對具有吸附的中性抗生物素蛋白的未經(jīng)處理和經(jīng)c處理的fep的超聲處理結果。在超聲處理步驟后,仍存在酰胺峰(1630cm-1),并且給出了在膜上的蛋白質穩(wěn)定性的指示。
表征蛋白質穩(wěn)定性、層均勻性和生物素結合活性的方法的實例
熒光標記
通過使用熒光顯微鏡檢查,與生物素綴合的熒光團用于觀察吸附至表面的蛋白質(sromqvist等人,2011)。當與抗生物素蛋白結合時,生物素-4-熒光素淬滅,并且在一些研究用于滴定抗生物素蛋白的生物素結合位點。(關于蛋白質的熒光素標記通常使熒光素的量子產(chǎn)率降低60%,但僅使其消光系數(shù)降低10%(thermoscientific2011))。在具體實施例中,該分子以相同的方式用于膜上,以便驗證固定的抗生物素蛋白的生物活性。
為了避免當熒光團附著至蛋白質時的淬滅效應,可使用較長的臂間隔物。在具體實施例中,該間隔物可由聚乙二醇(peg)分子制成。在具體實施例中,可采用當分子結合抗生物素蛋白時保持熒光信號的生物素-熒光團。
酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)
elisa是設計用于檢測和定量不同分子例如肽、抗體和蛋白質的測定。該方法可用于確定樣品上的蛋白質的量并且驗證附著的蛋白質是否是活性的。(vermette等人,2003)。圖24顯示了如何對fep樣品進行elisa的實施例。首先,將抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白附著至表面。在該步驟后,用牛血清白蛋白(bsa)的溶液洗滌fep表面,以封閉表面并避免非特異性酶結合。第二,將生物素化的酶溶液加入官能化表面,并且與生物素結合位點結合。小牛腸堿性磷酸酶(cip)和辣根過氧化物酶(hrp)可與生物素分子綴合,并且用于fep膜上的該測定。在溫育后,再次沖洗表面以去除未結合的酶。第三,將反應性基材加入表面上,并且根據(jù)基材溫育一定量的時間?;牡倪x擇取決于測定靈敏度和可用的儀器(例如分光光度計或酶標儀)。發(fā)光和熒光基材更敏感,并且可用于檢測極少量的蛋白質(皮米范圍)。
在特定實施例中,elisa方法給出了附著的蛋白質的生物活性的良好構想。如果中性抗生物素蛋白在其附著后保持活性,則生物素化酶將能夠結合到抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白的特異位點。這些結合的酶將與基材反應并且生成顯色產(chǎn)物或熒光產(chǎn)物。這些產(chǎn)物通過測量溶液的吸光度進行記錄。當顯色產(chǎn)物或熒光產(chǎn)物濃度在溶液中增加時,吸光度將增加,因此在基材產(chǎn)物濃度與膜結合蛋白的量之間存在直接的相關性。
原子力顯微鏡檢查(afm)
原子力顯微鏡檢查用于表征聚合物的形態(tài)。它測量樣品表面和固定在懸臂梁上的非常鋒利的探針尖端之間的力。該方法允許觀察固定的蛋白質到表面的存在。在具體實施例中,該方法是可視化的,并且可在幾μm上對附著的蛋白質作圖。敲擊模式也可用于驗證蛋白質的穩(wěn)定性和生物活性。通過使用在懸臂上的生物素尖端,可敲擊在表面上的蛋白質,并且分析去除在表面上吸附的蛋白質所需的能量。如果該能量類似于抗生物素蛋白和生物素之間的連接能,可了解抗生物素蛋白對表面的吸附比生物素-抗生物素蛋白相互作用更強。
實驗方案的實例
下文提供了本實例中提及的實驗方案的例子。
用亞甲基藍的fep表面染色(鑒定在表面上的-cooh和羧酸根基團):
1.在ph7.0下制備10-3m亞甲基藍溶液。
a.在1升dh2o中混合0.32g亞甲基藍
b.用hcl或naoh調節(jié)ph以達到ph7.0
2.將膜浸入亞甲基藍溶液中10分鐘。
3.通過在dh2o(ph=7.0)中浸泡表面1分鐘沖洗膜并且噴射表面
4.用溫和的氣流干燥或在通風罩中溫育。
分析:通過uv/vis光譜法確定亞甲基藍吸收。測量在膜上在600nm處的吸光度。
染色在膜上附著的蛋白質(允許鑒定在聚合物膜上附著的蛋白質的存在)
1.將2”x1.5”膜放置在表面皿(watchglass)上,并且用10ml試劑回收官能化表面(可調整試劑體積以完全回收樣品)
2.蓋上并且在室溫下溫育5分鐘。
3.從溶液中取出樣品,并且用大量的dh2o洗滌(浸漬5x,并且使用瓶在表面上噴射dh2o)
4.用溫和的氣流使樣品干燥,或在罩下使干燥
分析:通過uv/vis光譜法確定蛋白質試劑吸附,并且測量在膜上在660nm處的吸光度。
在表面官能化之前/表面官能化之后溶液中的蛋白質濃度
1.在測定的工作范圍(25-2000μg/ml)內制備標準曲線。將10μl1000μg/ml標準與390μl0.9%鹽水和0.05%疊氮化鈉混合,以獲得25μg/ml標準溶液?;蛘?,用在10mmnaoac緩沖液中的100μg/ml中性抗生物素蛋白溶液制備標準曲線。
2.將0.1ml標準的每個重復、樣品空白樣品加入試管內。(如果使用較小的樣品體積,則保持1:15的比率)
3.向每個管中加入1.5ml蛋白質分析試劑,并且渦旋以充分混合。
4.蓋上并且在室溫下溫育5分鐘。
分析:通過uv/vis光譜法確定蛋白質試劑吸收。測量液體在660nm處的吸光度。制備測試樣品前的標準曲線(吸光度相對于蛋白質濃度),并且通過減去空白溶液(10mmnaoac緩沖液或0.9%鹽水和0.05%疊氮化鈉)的吸光度來校正吸光度。
在表面上的中性抗生物素蛋白穩(wěn)定性:sds洗滌
1.制備sds1%洗滌溶液(也可使用2%)(sds濃度測試范圍:0.1mm(0.0288g/l)sds,對于人血清白蛋白至>10mm;(2.88g/l)sds對于sod和鏈霉抗生物素蛋白)
a.將1gsds在100mldh2o中混合
2.通過將膜在sds洗滌溶液中潛水5分鐘來洗滌膜表面。
3.用dh2o沖洗表面并使膜干燥
分析:在洗滌步驟之前和洗滌步驟之后對膜進行ftir測量。
洗滌溶液中的蛋白質濃度可用piece660nm蛋白質測定進行分析。離子型洗滌劑相容試劑(idcr#22663)需要sds>0.0125%的濃度。
在表面上的中性抗生物素蛋白穩(wěn)定性:超聲處理
1.將樣品放入50ml錐形管中,并且用適當?shù)木彌_液填充管。確保管完全關閉并密封。
2.將錐形管放入充滿dh2o的超聲波發(fā)生器中
3.使樣品在超聲波發(fā)生器中在30khz至200khz之間運行5分鐘。
4.從管中取出樣品,并且用dh2o洗滌(浸漬5x)
5.在室溫下在罩下干燥。
分析:
1.在超聲處理之前和超聲處理之后對膜進行ftir測量。
2.緩沖液中的蛋白質濃度可用piece660nm蛋白質測定進行分析。
具有附著的抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白的生物素珠與膜的綴合
1.將官能化表面加入100ml1xpbs緩沖液中
a.1xpbs緩沖液:50ml在450mldh2o中的10xpbs。
2.加入0.2ml生物素-聚苯乙烯珠溶液。在使用前使珠溶液渦旋
3.在室溫下在罩下溫育1小時。
4.用pbs(1x)和大量的dh2o(5x)洗滌。
5.使表面在罩中干燥。
分析:使用ftir和/或sem
抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白在fep膜上的吸附
1.制備10mmnaoac緩沖溶液
a.在容量瓶中,將1.7ml3mnaoac加入498.3mldh2o中
2.制備0.1mg/ml蛋白質溶液??衫?0ml蛋白質溶液/1.5”x2”膜樣品
a.在50ml圓柱形一次性使用的管中,加入在40ml10mmnaoac中的0.004g蛋白質(抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)
3.將膜樣品放入表面皿中,并且用10ml0.1mg/ml蛋白質溶液覆蓋膜。
4.在室溫下溫育1分鐘
5.用10mmnaoac洗滌樣品(浸漬5x)
6.用dh2o洗滌樣品(浸漬5x)
7.在室溫下在培養(yǎng)皿中干燥
8.在-80℃下的冷凍器中貯存
抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白在fep膜上的化學綴合
**使用氧化的經(jīng)c處理的fep膜樣品用于本實驗
1.制備10mmnaoac緩沖溶液
a.在容量瓶中,將1.7ml3mnaoac加入498.3mldh2o中
2.制備0.14mg/mlnhs和0.20mg/mledc溶液
a.在容量瓶中,加入在500ml10mmnaoac中的0.07gnhs
b.在溶液中加入0.1gedc
3.制備0.1mg/ml蛋白質溶液。可利用10ml蛋白質溶液/1.5”x2”膜樣品
a.在50ml圓柱形一次性使用的管中,加入在40ml10mmnaoac中的0.004g蛋白質(抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)
4.將膜加入nhs/edc溶液中,并且在室溫下溫育10分鐘
5.通過將膜在10mmnaoac溶液中浸漬5次來洗滌膜。
6.將膜樣品放入表面皿中,并且用10ml0.1mg/ml蛋白質溶液覆蓋膜。
7.在室溫下溫育1小時
8.制備100mm甘氨酸-hcl溶液
a.在容量瓶中,加入在250mldh2o中的2.79g甘氨酸-hcl
9.用甘氨酸-hcl溶液洗滌樣品(浸漬5x)
10.用ddh2o(5x)洗滌樣品
11.用10mmnaoac洗滌樣品(浸漬5x)
12.用dh2o洗滌樣品(浸漬5x)
13.在室溫下在培養(yǎng)皿中干燥
14.在-80℃下的冷凍器中貯存
經(jīng)c處理的fep膜的氧化
1.在容量瓶中制備氧化溶液
a.1gkmno4
b.5mlh2so4,98%
c.加入1000mldh2o
2.在燒杯中,將樣品浸漬在氧化溶液(100ml/樣品,不要在同一燒杯中放置超過2個膜)中
3.在室溫下溫育2小時。
4.用大量的dh2o沖洗(浸漬5x和噴射)
5.在真空烘箱中在65℃和hg中的-20下使樣品干燥過夜。
6.在室溫下貯存。避光
實例3
示例性實驗程序
實驗
在fep膜上的接枝聚合經(jīng)由等離子體活化,隨后為在溶液中的自由基聚合來實現(xiàn)。接枝聚合的方法在下述步驟中描述:(i)清潔膜,(ii)在低壓等離子系統(tǒng)中處理膜,(iii)在溶液中聚合,(iv)膜的清潔和(v)表征。
膜的清潔
將膜切割,然后在丙酮中洗滌,用di水沖洗,在空氣中干燥并且貯存在鋁箔膜內。稍后的清潔過程包括先用肥皂洗滌膜,用水沖洗,然后用丙酮沖洗。在結束時的丙酮幫助從表面干燥過量的水。
等離子體處理
如果膜考慮在兩側中都被活化,則將膜放置在瓶中并且用雙面膠帶粘附。4”x5”的膜契合瓶的側面,并且在過程中不使用膠帶。儀器使用的條件是:
a.氣體:氬mcf1
b.氣體流量:如文獻中推薦的20sccm(cm3/分鐘)
c.時間:10分鐘
d.功率:30%(最大100w)
聚合反應:
在活化表面之前30分鐘制備溶液,以使用內部氮吹掃在溶液中溶解的氧。條件是:
e.溶劑:di水
f.單體:丙烯酸
g.大氣:n2
h.溫度:60-70℃
i.時間:加熱2-4小時,然后允許在氮下放置過夜。
最終膜的清潔:
將膜從反應器中取出,然后在di水中沖洗,在水中超聲浴5分鐘,在丙酮中沖洗并且用空氣干燥。樣品用鋁箔覆蓋以避免污染。
fep膜現(xiàn)在用來自聚丙烯酸接枝聚合反應的許多羧酸基團進行官能化。
實例4
在paa-fep表面上的蛋白質固定
在本實例中使用兩種示例性的蛋白質固定方法,蛋白質綴合和蛋白質吸收。為了使蛋白質化學綴合,利用兩步edc/nhs化學來活化paa-fep表面上的羧酸基團。簡言之,新鮮制備45mmedc和15mmnhs,并且在0.1m2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)緩沖溶液中混合。接下來,將10ml這種溶液置于100ml表面皿上,并且將fep膜樣品(3.5×3.5cm2)的paa處理側置于液體上,且充分處理15分鐘。然后在膜表面上生成胺反應性nhs-酯中間體。然后通過將膜浸入10mldi水中的抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白(nav)溶液(0.1mg/ml)中2小時來實現(xiàn)偶聯(lián)反應。
通過用10ml在di水溶液中的0.1mg/ml蛋白質處理經(jīng)paa處理的表面2小時,而不預先通過edc/nhs活化,來制備蛋白質吸收膜樣品。制備僅通過edc/nhs活化的膜樣品作為陰性對照樣品,其僅用di水處理2小時而不使用任何蛋白質。并且僅通過用mes緩沖液處理膜樣品15分鐘來制備僅緩沖液樣品。
所有的膜樣品隨后通過10mm乙酸鈉溶液、100mm甘氨酸-hcl溶液和去離子水沖洗,干燥過夜,并且在進一步分析之前貯存在-20℃冷凍器中。
傅里葉變換紅外表征
為了驗證paa-fep膜表面上蛋白質的存在,使用衰減全反射傅里葉變換紅外(atr-ftir)表征。測試了膜樣品(與蛋白質綴合的paa-fep、具有蛋白質吸收的paa-fep、僅通過edc/nhs處理的paa-fep和未經(jīng)處理的paa-fep)。atr-ftir表征設置參數(shù)是:分辨率=4,掃描次數(shù)=512,以及波數(shù)范圍:4000-1400cm-1(圖25)。
用生物胞素熒光團表征抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白
因為生物素分子可以高親和力和選擇性結合抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白蛋白質,所以與生物素綴合的熒光團能夠檢測蛋白質的存在。這里使用生物胞素四甲基羅丹明(b-tmr,激發(fā)波長=554nm,發(fā)射波長=581nm)來染色穩(wěn)定固定的蛋白質。首先,將每個膜樣品(1×1cm2)放置在24孔板的孔上,其中經(jīng)處理的一側朝上,并且加入2mg/ml牛血清白蛋白溶液,以使在膜上的所有非特異性結合位點封閉15分鐘。通過該步驟去除未通過edc/nhs反應與paa-fep表面連接的任何抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。在通過1mlpbs洗滌5次后,樣品通過溶解于pbs中的1μmb-tmr溶液避光染色30分鐘。然后去除熒光團溶液,并且通過去離子水洗滌樣品且干燥過夜。然后用立體顯微鏡熒光適體(emsciences,hatfield,pa)與青色藍色濾光片(激發(fā):490-515nm,發(fā)射:550nm,長通)來觀察樣品。
加上熒光團標簽的與paa-fep表面化學附著的抗生物素蛋白的圖像,paa-fep表面與充當內部對照的不被paa官能化的fep段相鄰。(圖26)
實例5
在paa-fep表面上的dna固定
適體dna溶液的制備
凍干的適體dna寡核苷酸(3'末端胺改性的,5'-適體-胺-3')及其fitc熒光團綴合形式購自basepairbiotechnologies(47-g06,oligo#603,pearland,tx,usa)。所有凍干的適體在使用前都避光在-20℃下貯存。為了將適體重懸浮于溶液中,將適體團塊在微型離心機中離心5分鐘,以確保所有團塊都在管的底部上。然后將團塊溶解在無核酸酶的水中以獲得100μm濃度,隨后為30分鐘溫育。接下來,獲取50μl該適體溶液的等分試樣用于進一步稀釋,而將溶液的剩余部分貯存在-20℃下用于長期貯存。將等分試樣在折疊緩沖液(在1x磷酸鹽緩沖鹽水,無核酸酶,ph7.4中的1mmmgcl2)中以50nm稀釋至其工作濃度。以工作濃度的適體通過在85-95℃下的水浴折疊5分鐘,隨后為在室溫下的冷卻。一旦適體折疊,就不需要更多的折疊步驟。
將以工作濃度的溶液折疊的適體分成10個等分試樣,并且貯存在-20℃下用于長期貯存。為了避免重復的凍融循環(huán),適體溶液一旦解凍就保持在4℃下。在4℃下溶解于無核酸酶的水中時,寡核苷酸被建議在4周內用完(www.atbio.com/content/52/storage-of-oligonucleotides)。
用于dna寡核苷酸的傅里葉紅外變換(ftir)表征
為了驗證ftir光譜中dna寡核苷酸的特征峰,將1ml500pmdna溶液浸漬到ir聚乙烯(pe)標準膜上,然后在空氣中干燥過夜。通過atr模式(掃描次數(shù)512,分辨率4cm-1)測試ftir光譜。首先收集未經(jīng)處理的pe標準作為光譜背景,然后表征固定有dna的pe膜。光譜是自動基線校正和常規(guī)尺度調整的。
dna在聚(丙烯酸)氟化聚乙烯丙烯(paa-fep)上的共價固定
胺改性的適體dna寡核苷酸通過edc/nhs化學與paa-fep化學綴合。程序與蛋白質綴合實驗相似,期望使用偶聯(lián)緩沖液。首先,將以其工作濃度的折疊適體緩沖液在偶聯(lián)緩沖液(100mm磷酸鈉,150mm氯化鈉,無核酸酶,ph7.2)中稀釋。paa-fep的表面羧酸基團通過在0.1m無核酸酶的mes緩沖液中的2mmedc(在100ml中0.038g)和5mmnhs(在100ml中0.06g)活化15分鐘。在去除edc/nhs試劑后,將活化的膜表面與稀釋的dna適體溶液反應2小時。對于dna吸收樣品,將paa-fep膜樣品浸入dna溶液中2小時。加上fitc熒光團標簽的dna(5'-fitc-適體-胺-3')寡核苷酸通過相同的方法固定,并且在整個程序中避光。并且陰性對照樣品包括在通過edc/nhs活化后僅用偶聯(lián)緩沖液處理的paa-fep膜(即僅緩沖液處理的膜),以及僅通過edc/nhs試劑處理的膜(表6)。在反應結束時,隨后通過折疊緩沖液和無核酸酶的水沖洗膜樣品三次,并且將具有固定dna的樣品浸入折疊緩沖溶液中,并且在進一步分析之前貯存在4℃下。
表6用于制備不同膜樣品的化學品和緩沖液
paa-fep上的固定dna的傅里葉紅外變換(ftir)表征
還使用atr-ftir表征方法來驗證膜樣品上dna的存在。環(huán)境空氣首先被校正為背景。如前所述,將每個干燥樣品(dna綴合膜、dna吸收膜、僅經(jīng)edc/nhs處理的膜和僅經(jīng)緩沖液處理的膜)放置在atr晶體上,并且通過3.2節(jié)的相同條件進行測試。光譜是自動基線校正和常規(guī)尺度調整的。(圖27)。
實例6
表面改性實例
包括抗生物素蛋白蛋白質和適體dna寡核苷酸的生物物質可共價固定在聚(丙烯酸)接枝的氟化聚乙烯丙烯(paa-fep)上。主要改性方法是edc/nhs化學,隨后為各種表征方法。這些表面改性程序可用于產(chǎn)生固定適體dna的fep袋。
1.使用兩步edc/nhs化學的抗生物素蛋白固定
材料:1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc或edac,貯存在-20℃下)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs,貯存在4℃下)、buphmes緩沖鹽水包(貯存在室溫中)、抗生物素蛋白蛋白質(貯存在4℃下)、甘氨酸-hcl、10mm乙酸鈉緩沖液和paa-fep
步驟:
1.將一包mes緩沖鹽水包溶解于500mldi水內,以得到0.1mmes緩沖液
2.稱重0.43gedc和0.085nhs,并且將它們一起溶解在50mlmes緩沖液中,以得到45mmedc和15mmnhs溶液。避免含有羧酸酯和胺的任何組分
3.切下一片paa-fep膜樣品。為了區(qū)分paa接枝側,在未經(jīng)處理的fep側附上一小片標記膠帶,或簡單地將一個角折起
4.吸取edc/nhs溶液,以完全覆蓋一片干凈的玻璃表面皿。通常,3ml液體可完全覆蓋50ml表面皿(對于3*3cm2膜樣品),并且10ml液體可覆蓋100ml表面皿(對于5*5cm2膜樣品)
5.將膜樣品放置在edc/nhs溶液上。確保paa接枝側可與溶液完全接觸
6.將反應進行15分鐘
7.用di水快速洗滌經(jīng)處理的膜表面(任選的)
8.將抗生物素蛋白蛋白質溶解于di水中,以獲得0.1mg/ml的蛋白質濃度,并且吸取該溶液以完全覆蓋另一塊干凈的玻璃表面皿
9.將反應進行2小時
10.其他樣品組如下制備:
a.抗生物素蛋白吸收樣品:僅用抗生物素蛋白溶液處理paa-fep膜2小時
b.僅edc/nhs樣品:用edc/nhs溶液處理樣品15分鐘,然后用不含抗生物素蛋白的di水處理樣品
c.僅緩沖液樣品:僅用0.1mmes緩沖液處理樣品
11.將2.79g甘氨酸-hcl溶解于100mldi水中,以得到100mm甘氨酸-hcl溶液
12.隨后通過將所有的膜樣品浸漬在燒杯中的洗滌溶液中,用10mm乙酸鈉溶液、100mm甘氨酸-hcl和di水洗滌所有的膜樣品。使膜樣品干燥過夜用于進一步研究。
2.使用生物胞素熒光團的抗生物素蛋白蛋白質表征
材料:5-(和-6)-四甲基羅丹明生物胞素(b-tmr,貯存在-20℃下)、10x磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)、2mg/ml牛血清白蛋白(bsa)、青色藍色熒光濾光片組、24孔板
步驟:
1.將10xpbs緩沖液稀釋10倍
2.將1.7mgb-tmr熒光團團塊溶解于2mlpbs中,以得到10mm溶液,然后將該溶液稀釋1000倍,以得到10μmb-tmr溶液
3.從每個膜樣品切下1*1cm2的片,并且將這些小樣品放置在24孔板上的分開孔中,其中經(jīng)處理的側朝上
4.用1ml2mg/mlbsa溶液處理膜樣品15分鐘,以封閉非特異性結合位點。為了確保膜不翻轉,在加入和去除液體時,使用小玻璃棒固定一角
5.棄去bsa溶液,并且用pbs緩沖液將膜樣品洗滌5次
6.通過pbs緩沖液將10μmb-tmr溶液稀釋至以1μm的工作濃度
7.用1μmb-tmr溶液染色樣品30分鐘
8.通過將樣品浸漬在di水中洗滌樣品并且將其干燥過夜
9.在立體顯微鏡熒光燈附件下查看樣品時,根據(jù)供應商的手冊組裝濾光片組,并且通過黑色塑料袋覆蓋整個顯微鏡,以免眼睛直接看到光線,并且阻擋環(huán)境背景光
10.將樣品放置在干凈的黑色背景(即小樣品容器)上。輕輕傾斜樣品以最小化來自激發(fā)光的反射,然后調整對焦。
3.適體dna工作溶液的制備
材料:無核酸酶的水、適體dna團塊(胺改性的,用或不用fitc)、氯化鎂溶液(mgcl2,1m)、無核酸酶的pbs緩沖液、微型離心機、微型離心管、500ml無菌罐
步驟:
1.通過將冷凍干燥的適體dna團塊離心5分鐘,使其向下旋轉至管的底部
2.通過將適體dna團塊溶解在無核酸酶的水中來使其重懸浮,以達到100μm(所需溶劑的體積在來自供應商的產(chǎn)品信息中列出)。將該溶液溫育30分鐘
3.通過將0.1ml1mmgcl2溶液與100ml1x無核酸酶的pbs緩沖液混合來制備折疊緩沖液,然后將緩沖液貯存在500ml無菌罐中
4.將燒杯中的約50ml水加熱至95℃
5.為了折疊適體dna,獲取100μm適體溶液的等分試樣,并且在50ml無菌管中將其稀釋至工作濃度(即2μm)。接下來,將適體dna溶液在加熱的水中水浴5分鐘,然后使溶液在室溫下冷卻約15分鐘
6.通過在無核酸酶的管中等分來分開適體溶液。將未使用的溶液貯存在-20℃下用于長期貯存。一旦溶液解凍,就將其貯存在4℃下,以避免反復凍融循環(huán)。fitc-適體溶液應避光制備
4.使用兩步edc/nhs化學的適體dna固定
材料:氯化鈉和磷酸鈉、edc/nhs試劑
步驟:
1.制備偶聯(lián)緩沖液:在無核酸酶的水中溶解0.87g氯化鈉和1.64g磷酸鈉,然后將緩沖液貯存在500ml無菌罐中
2.稱重0.019gedc和0.03gnhs,并且將它們一起溶解在50mlmes緩沖液中,以得到2mmedc和5mmnhs溶液。避免含有羧酸酯和胺的任何組分
3.切下一片paa-fep膜樣品。為了區(qū)分paa接枝側,在未經(jīng)處理的fep側附上一小片標記膠帶,或簡單地將一個角折起
4.吸取edc/nhs溶液,以完全覆蓋一片干凈的玻璃表面皿。通常,3ml液體可完全覆蓋50ml表面皿(對于3*3cm2膜樣品),并且10ml液體可覆蓋100ml表面皿(對于5*5cm2膜樣品)
5.將膜樣品放置在edc/nhs溶液上。確保paa接枝側可與溶液完全接觸
6.將反應進行15分鐘
7.用di水快速洗滌經(jīng)處理的膜表面(任選的)
8.通過偶聯(lián)緩沖液將適體dna溶液稀釋至所需濃度用于固定,并且吸取適體溶液以完全覆蓋一片干凈的表面皿,然后將經(jīng)處理的膜表面置于適體溶液上
9.將反應進行2小時
10.其他樣品組如下制備:
a.適體dna吸收樣品:僅用dna溶液處理paa-fep膜2小時
b.僅edc/nhs樣品:用edc/nhs溶液處理樣品15分鐘,然后用無核酸酶的水處理樣品
c.僅緩沖液樣品:在進行edc/nhs反應后,用相同量的適體溶液中的折疊緩沖液和偶聯(lián)緩沖液處理樣品(即,如果適體溶液是折疊緩沖液的50%體積比和偶聯(lián)緩沖液的50%體積比,則這里使用的緩沖液是相同的成分)
11.用無核酸酶的水洗滌所有樣品,并且將含dna樣品浸入折疊緩沖液中,并且貯存于4℃下。
參考文獻
在本說明書中提到的所有出版物都指示本發(fā)明所屬領域的技術人員的水平。本文的所有出版物都以引用的方式并入,如同每個個別出版物被具體和個別地指示以引用的方式全文并入一樣。
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盡管已詳細描述了本發(fā)明及其優(yōu)點,但應當理解,在本文中可作出各種變化、取代和改變,而不背離如由所附權利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍。此外,本專利申請的范圍不預期限制于說明書中描述的過程、機器、制造、物質組成、手段、方法和步驟的特定實施例。如本領域普通技術人員從本發(fā)明的公開內容容易地理解的,可根據(jù)本發(fā)明利用執(zhí)行與本文描述的相應實施例基本上相同的功能或實現(xiàn)與本文描述的相應實施例基本上相同的結果的目前存在的或稍后要開發(fā)的過程、機器、制造、物質組成、手段、方法或步驟。相應地,所附權利要求預期在其范圍內包括這樣的過程、機器、制造、物質組成、手段、方法或步驟。