一種基于石蠟襯底膜的細(xì)胞捕獲與釋放芯片的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微流控芯片的制備方法，具體的說(shuō)是一種基于石蠟襯底膜的細(xì)胞捕獲與釋放芯片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，微流控芯片已經(jīng)成為細(xì)胞分離研究的熱點(diǎn)，微流控芯片的快速發(fā)展及推廣應(yīng)用，給分析領(lǐng)域提供了很大的便利。人體血液中CTCs(Circulating Tumor Cells血循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的含量非常低，這對(duì)現(xiàn)有的分離分析方法來(lái)說(shuō)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。目前還沒(méi)有其它好的方法能夠把血液中原本數(shù)量就極少的CTCs很好的分離出來(lái)，S卩便能夠分離出來(lái)也不能夠進(jìn)行高靈敏的檢測(cè)計(jì)數(shù)及進(jìn)行后續(xù)一系列的生化分析。這時(shí)候CTCs(捕獲芯片的出現(xiàn)能夠極大的解決這個(gè)問(wèn)題，細(xì)胞捕獲芯片的出現(xiàn)對(duì)于CTCs的快速發(fā)現(xiàn)及早期診斷與治療具有極大的意義。
[0003]但是，目前報(bào)到的關(guān)于CTCs芯片的最新研究成果，其對(duì)CTCs的捕獲效率雖然較高，但是捕獲到的CTCs難以進(jìn)行釋放，不方便后續(xù)的再陪養(yǎng)等生化分析。如專利申請(qǐng)公布號(hào)為CN 103235124 A和專利申請(qǐng)公布號(hào)為CN 104324768A所述他們雖然都能進(jìn)行細(xì)胞的捕獲且捕獲效率較高，但是其捕獲到的細(xì)胞不能夠進(jìn)行有效的釋放，不方便后續(xù)的擴(kuò)大培養(yǎng)及再分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于石蠟襯底膜的細(xì)胞捕獲與釋放芯片的制備方法，低成本，加工簡(jiǎn)單。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種采用石蠟襯底膜芯片捕獲與釋放細(xì)胞的方法，捕獲與釋放效率高。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:
一種基于石蠟襯底膜的細(xì)胞捕獲與釋放芯片的制備方法，具體步驟如下:
(1)基底的選擇及清洗:選取玻璃、石英或硅作為基底，將選擇好的兩片基底進(jìn)行清洗，去除基底表面的油污等雜質(zhì)；
(2 )刻蝕掩膜處理:對(duì)清洗好的基底在50°C~100°C的烘箱中進(jìn)行烘干處理，烘干處理之后在兩片基底的上下表面粘附耐化學(xué)腐蝕性的掩膜，通過(guò)激光切割，把即將要刻蝕的區(qū)域部分切出來(lái)，除去切割出來(lái)的防腐蝕掩膜，得到要刻蝕的區(qū)域；
掩膜處理的目的在于裸露出需要進(jìn)行刻蝕的基片的一部分，把不需要進(jìn)行刻蝕的基片的其他部分保護(hù)起來(lái)。
[0007](3)濕法刻蝕:將處理好的基底中的上片，通過(guò)夾具按照0.0lml/min-lmm/min的速率垂直緩慢的放入到刻蝕液中進(jìn)行刻蝕，上片刻蝕出的凹槽底面為斜坡面，處理好的基底下片直接浸泡在刻蝕液中進(jìn)行刻蝕，下片刻蝕出的凹槽底面水平；
(4)打孔:去除掉上片和下片表面的刻蝕掩膜，使整個(gè)基底完整的裸露出來(lái)，對(duì)基底進(jìn)行清洗處理之后，對(duì)上片進(jìn)行打孔，在上片的至少兩個(gè)不同等高面的區(qū)域打孔，兩個(gè)孔分別為入口孔和出口孔。
[0008](5)石蠟?zāi)さ闹苽?切取少量石蠟置于下片的凹槽中，將下片置于熱臺(tái)上加熱至55°C，此時(shí)石蠟完全融化，將油脂均勻的涂抹在一片干凈的未經(jīng)過(guò)刻蝕的基片上并進(jìn)行加熱，將涂有油脂的基片緩慢的蓋在融化有石蠟的下片上，緩慢的從熱臺(tái)上移出，讓組合在一起的芯片緩慢降溫直至下片上的石蠟完全凝固，然后將組合在一起的芯片拆開(kāi)，去除掉下片凹槽外圍多余的石蠟，這樣便完成了下片石蠟?zāi)さ闹苽洹?br>[0009]所述的石蠟?zāi)さ暮穸葹?.1-1.5mm，即下片刻蝕后其刻蝕區(qū)域的高度為0.1-1.5mm ο
[0010](6)上片與下片的組合:選取PDMS(聚二甲基硅氧烷)薄片對(duì)下片和上片進(jìn)行鍵合，便得到了基于石蠟襯底膜的細(xì)胞捕獲與釋放芯片。
[0011 ] 一種采用基于石蠟襯底膜的芯片進(jìn)行細(xì)胞捕獲與釋放方法，其步驟如下:
(1)將制備的帶有石錯(cuò)襯底膜的芯片置于夾具中，通過(guò)注射栗以0.0lul/min-lul/min的速率將培養(yǎng)好的細(xì)胞從入口孔注入到鍵合完全的芯片中，持續(xù)通入一定的時(shí)間后，細(xì)胞卡在刻蝕空間內(nèi)，生物組織緩沖溶液從出口孔中流出。
[0012](2)對(duì)芯片的石蠟?zāi)び眉す膺M(jìn)行照射或者置于熱臺(tái)上加熱，這時(shí)候部分石蠟開(kāi)始融化，與此同時(shí)注射栗開(kāi)始工作向芯片里注射PBS緩沖液(磷酸緩沖鹽溶液)，融化了的石蠟?zāi)ど厦娴募?xì)胞便被沖了出來(lái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞的釋放。
[0013]有益效果:本發(fā)明改變了以往制作出的微流芯片不能夠?qū)Σ东@到的細(xì)胞進(jìn)行釋放的問(wèn)題。本發(fā)明的制備方法，加工工藝簡(jiǎn)單，制備出來(lái)的芯片能夠?qū)Σ东@到的細(xì)胞進(jìn)行釋放，具有廣闊的市場(chǎng)前景和市場(chǎng)價(jià)值，能夠廣泛的用于分析領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為芯片的示意圖。其中1(a)為上片示意圖，梯形四周區(qū)域?yàn)楦材^(qū)域，1(b)為下片示意圖，小梯形四周為覆膜區(qū)域。
[0015]圖2為不同注射速率下的細(xì)胞捕獲效率。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明在細(xì)胞捕獲及釋放中做出進(jìn)一步的說(shuō)明?？涛g液為典型的緩沖氧化娃蝕刻液，其中含氟化錢，(BOE: Buffer Oxide Etcher)與去離子水按1:10的質(zhì)量比例勾兌而成。
[0017]實(shí)施例1
一種采用基于石蠟襯底膜的芯片進(jìn)行細(xì)胞的捕獲與釋放方法，具體步驟如下:
1.基底選擇為玻璃，其中玻璃基底的長(zhǎng)度為75mm、寬度為25mm、厚度為2mm，將選擇好的兩片基底在流動(dòng)的去離子水下進(jìn)行清洗，去除基底表面的油污等雜質(zhì)，對(duì)清洗好的基底在50-100°C烘箱里進(jìn)行烘干處理。
[0018]2、在基底的上下表面黏貼耐化學(xué)腐蝕性的保護(hù)膠紙，在上片的保護(hù)膠紙上用激光雕刻機(jī)切出如圖1中1(a)所述的梯形區(qū)域，梯形的上底為9_，下底為18_，整個(gè)梯形區(qū)域的高度為60mm，在下片上用激光雕刻機(jī)切出如圖1中1(b)所述的小梯形區(qū)域梯形的上底為14mm，下底為18mm，整個(gè)梯形區(qū)域的高度為20mm，撕下上片和下片切割區(qū)域的保護(hù)膠紙，得到要刻蝕的區(qū)域。
[0019]3、將處理好的基片中的上片，通過(guò)夾具按照l(shuí)mm/min的速率垂直緩慢的放入到刻蝕液中進(jìn)行刻蝕75min，下片直接浸泡在刻蝕液中進(jìn)行刻蝕，30min下片刻蝕后其刻蝕區(qū)域的高度為1.5mm。
[0020]4、去除掉上片和下片表面的刻蝕掩膜，使整個(gè)基底完整的裸露出來(lái)，對(duì)基底進(jìn)行清洗處理之后，對(duì)上片進(jìn)行打孔，在上片的至少兩個(gè)不同等高面的區(qū)域打孔，兩個(gè)孔分別為入口孔和出口孔，加工出孔的直徑為0.5-lmm。
[0021]5、切取少量石蠟置于下片的凹槽中，置于55°C熱臺(tái)上加熱，直至石蠟完全融化在下片的凹槽中；與此同時(shí)將食用芝麻油均勻的涂抹在干凈的未經(jīng)過(guò)刻蝕的一片基片上并置于熱臺(tái)上進(jìn)行加熱。
[0022]6、將涂有食用芝麻油的基片緩慢的蓋在融化有石蠟的下片上面，緩慢的從熱臺(tái)上移出，讓組合在一起的基片緩慢降溫直至融有石蠟的下片上的石蠟完全凝固，然后迅速將組合在一起的基片拆開(kāi)，去除掉帶有下片的凹槽外圍多余的石蠟，同時(shí)將涂有食用芝麻油的基片進(jìn)行清洗干凈，這樣便完成了帶有石蠟?zāi)さ幕闹苽洹?br>[0023]7、選取PDMS(聚二甲基硅氧烷)對(duì)經(jīng)過(guò)上述處理的上片和下片進(jìn)行鍵合，便得到了本發(fā)明需要制備的基于石蠟襯底膜的快速細(xì)胞的捕獲與釋放芯片。
[0024]8、將制備好的芯片置于夾具中，將培養(yǎng)好的乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌變細(xì)胞通過(guò)注射栗以lul/min的速率從入口孔注射1小時(shí)到鍵合完全的芯片中，乳腺癌細(xì)胞卡在刻蝕空間內(nèi)，生物組織緩沖溶液從出口孔中流出，完成對(duì)細(xì)胞的捕獲。
[0025]9、對(duì)芯片的石蠟?zāi)げ糠钟眉す膺M(jìn)行照射，這時(shí)候部分石蠟開(kāi)始融化，與此同時(shí)注射栗開(kāi)始工作向芯片里注射PBS緩沖液，被激光照射部分的石蠟?zāi)ど厦娴募?xì)胞便被沖了出來(lái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞的釋放。
[0026]實(shí)施例2
一種采用基于石蠟襯底膜的芯片進(jìn)行細(xì)胞的捕獲與釋放方法，具體步驟如下:
1.基底選擇為玻璃，其中玻璃基底的長(zhǎng)度為75mm、寬度為25mm、厚度為2mm，將選擇好的兩片基底在流動(dòng)的去離子水下進(jìn)行清洗，去除基底表面的油污等雜質(zhì)，對(duì)清洗好的基底在50-100°C烘箱里進(jìn)行烘干處理。
[0027]2、在基底的上下表面黏貼耐化學(xué)腐蝕性的保護(hù)膠紙，在上片的保護(hù)膠紙上用激光雕刻機(jī)切出如圖1中1 (a)所述的梯形區(qū)域梯形的上底為9mm，下底為18mm，整個(gè)梯形區(qū)域的高度為45mm，在下片上用激光雕刻機(jī)切出如圖1中1(b)所述的小梯形區(qū)域梯形的上底為9mm，下底為18mm，整個(gè)梯形區(qū)域的高度為18mm，
撕下上片和下片切割區(qū)域的保護(hù)膠紙，得到要刻蝕的區(qū)域。
[0028]3、將處理好的基片中的上片，通過(guò)夾具按照0.5mm/min的速率垂直緩慢的放入到刻蝕液中進(jìn)行刻蝕70min，下片處理好的基片直接浸泡在刻蝕液中進(jìn)行刻蝕，刻蝕25min下片刻蝕后其刻蝕區(qū)域的高度為1.25 mm。
[0029]4、去除掉上片和下片表面的刻蝕掩膜，使整個(gè)基底完整的裸露出來(lái)，對(duì)基底進(jìn)行清洗處理之后，對(duì)上片進(jìn)行打孔，在上片的至少兩個(gè)不同等高面的區(qū)域打孔，兩個(gè)孔分別為入口孔和出口孔，加工出孔的直徑為0.5-lmm。
[0030]5、切取少量石蠟置于下片的凹槽中，置于55°C熱臺(tái)上加熱，直至石蠟完全融化在下片的凹槽中；與此同時(shí)將食用芝麻油均勻的涂抹在干凈的未經(jīng)過(guò)刻蝕的一片基片上并置于熱臺(tái)上進(jìn)行加熱。
[0031]6、將涂有食用芝麻油的基片緩慢的蓋在融化有石蠟的下片上面，緩慢的從熱臺(tái)上移出，讓組合在一起的基片緩慢降溫直至融有石蠟的下片上的石蠟完全凝固，然后迅速將組合在一起的基片拆開(kāi)，去除掉帶有下片的凹槽外圍多余的石蠟，同時(shí)將涂有食用芝麻油的基片進(jìn)行清洗干凈，這樣便完成了帶有石蠟?zāi)さ幕闹苽洹?br>[0032]7、選取PDMS(聚二甲基硅氧烷)對(duì)經(jīng)過(guò)上述處理的上片和下片進(jìn)行鍵合，便得到了本發(fā)明需要制備的基于石蠟襯底膜的快速細(xì)胞的捕獲與釋放芯片。
[0033]8、將制備好的芯片置于夾具中，將培養(yǎng)好的乳腺癌細(xì)胞和前列腺癌變細(xì)胞通過(guò)注射栗以0.75ul/min的速率從入口孔注射1小時(shí)到鍵合完全的芯片中，前列腺癌變細(xì)胞卡在刻蝕空間內(nèi)，生物組織緩沖溶液從出口孔中流出，完成對(duì)細(xì)胞的捕獲
9、將芯片整個(gè)置于熱臺(tái)上，與此同時(shí)注射栗開(kāi)始工作向芯片里注射PBS緩沖液，將捕獲到的細(xì)胞進(jìn)行全部釋放，這樣便實(shí)現(xiàn)了對(duì)捕獲到的細(xì)胞進(jìn)行全部釋放的目的。
[0034]實(shí)施例3
一種采用基于石蠟襯底膜的芯片進(jìn)行細(xì)胞的捕獲與釋放方法，具體步驟如下:
1.基底選擇為石英，其中石英基底的長(zhǎng)度為75mm、寬度為25mm、厚度為2mm，將選擇好的兩片基底在流動(dòng)的去離子水下進(jìn)行清洗，去除基底表面的油污等雜質(zhì)，對(duì)清洗好的基底在50-100°C烘箱里進(jìn)行烘干處理。