本發(fā)明屬于食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定肉類食品中多種植物源性成分的方法。

背景技術(shù)：

隨著居民生活水平的提高，對(duì)肉制品的口感及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的要求也越來越高，因此肉制品的加工工藝也越來越多樣化，其中加入植物蛋白是當(dāng)前肉制品加工最常用的一種方式，這不僅可以改善肉制品的口感，還能夠提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更易于消化吸收。但由于植物蛋白價(jià)格低廉，因此一些不法商販為了謀取不正當(dāng)利益，添加大量的植物蛋白，或以植物蛋白替代肉進(jìn)行加工，這屬于以經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)的摻假(economocally motivated adulteration,EMA)行為，屬于商業(yè)欺詐，擾亂市場(chǎng)秩序，嚴(yán)重侵犯消費(fèi)者的合法權(quán)益。此外，部分敏感人群對(duì)花生、小麥等植物蛋白易產(chǎn)生過敏現(xiàn)象，進(jìn)而危害生命健康。因此建立準(zhǔn)確、高效的植物源性成分的檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

蛋白質(zhì)組學(xué)是以物種成分的特異性多肽作為生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒別的一種方法，其中肽段是蛋白質(zhì)中的一級(jí)結(jié)構(gòu)，化學(xué)鍵更為穩(wěn)定，因此在深加工肉制品檢測(cè)中具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜具有強(qiáng)大的掃描功能，通過采集對(duì)應(yīng)母離子二級(jí)碎裂全掃描譜圖，獲得更確切的定性信息的功能，可以避免復(fù)雜基質(zhì)的干擾，降低假陽性概率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定肉類食品中多種植物源性成分的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定肉類食品中多種植物源性成分的方法，包括以下步驟：

S1、標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的制備；

S2、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)以及標(biāo)準(zhǔn)植物成分特征多肽的篩選；

S3、待測(cè)肉類食品的前處理；

S4、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)肉類食品中的特征多肽，并與標(biāo)準(zhǔn)植物成分的特征多肽進(jìn)行比較，從而判定對(duì)應(yīng)的植物源性成分。

步驟S1具體如下：

S11、提取標(biāo)準(zhǔn)植物樣品總蛋白：稱取1-5g磨碎的標(biāo)準(zhǔn)植物樣品粉末，加入5-25mL提取液，超聲提取30min，然后離心，取上清液；

S12、還原及烷基化：取50-250μL上清液，加入50mmol/L二硫蘇糖醇溶液10-50μL，56℃振蕩反應(yīng)1h，然后降至室溫，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20-100μL，暗處反應(yīng)30min，再加入50mmol/L二硫蘇糖醇溶液15-75μL，暗處反應(yīng)15min；

S13、酶切：向上述反應(yīng)體系中加入25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0緩沖溶液750-2000μL，然后加入20μg胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為8.0，37℃反應(yīng)過夜；向上述酶解液中加入TFA調(diào)pH值小于2終止反應(yīng)，并加入1mL水，所得溶液用于過柱除鹽；

S14、過柱除鹽：，將S13所得溶液用C₁₈固相萃取柱除鹽，收集洗脫液過濾后，準(zhǔn)備上機(jī)；

S11中所述提取液為0.05mol/L Tris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH 8.0。

S11中超聲的條件為：超聲功率200W，超聲頻率40KHz；冰水浴條件下進(jìn)行；離心的條件為：4℃，12000r/min離心20min。

S14中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C₁₈固相萃取柱，將S13所得溶液上樣，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脫，收集的洗脫液經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

步驟S2利用Easy nLC 1000液相色譜系統(tǒng)和Q Exactive HF質(zhì)譜儀檢測(cè)并篩選各種標(biāo)準(zhǔn)植物樣品中的特征多肽，具體如下：

色譜條件：C₁₈色譜柱2.1mm×100mm(直徑×長(zhǎng)度)，填料粒徑1.9μm；流動(dòng)相：A相0.1％FA/H₂O，B相0.1％FA/CAN；色譜梯度為：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；18.5～25min，3％B；進(jìn)樣量為10μL，每個(gè)樣品至少采集三次數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓3500V；鞘氣38Arb；輔氣15Arb；離子傳輸管溫度275℃；離子源霧化溫度380℃；離子源溫度380℃；碰撞氣為1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均為0.7。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析：用Maxquant對(duì)各種標(biāo)準(zhǔn)植物樣品進(jìn)行非標(biāo)記定量分析，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫，設(shè)置peptides不超過4，sequence length于140-600之間，sequence coverage不超過40％，unique peptides不超過4，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)，獲得相對(duì)特異性多肽，即各種標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的特征多肽。

步驟S3具體如下：

S31、提取待測(cè)肉類食品樣品總蛋白：將待測(cè)樣品剪碎或分割成小塊，向1-5g樣品中加入5-25mL提取液，超聲提取30min，然后離心，取上清液；

S32、還原及烷基化：取50-250μL上清液，加入50mmol/L二硫蘇糖醇溶液10-50μL，56℃振蕩反應(yīng)1h，然后降至室溫，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20-100μL，暗處反應(yīng)30min，再加入50mmol/L二硫蘇糖醇溶液15-75μL，暗處反應(yīng)15min；

S33、酶切：向上述反應(yīng)體系中加入25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0緩沖溶液750-2000μL，然后加入20μg胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為8.0，37℃反應(yīng)過夜；向上述酶解液中加入TFA調(diào)pH值小于2終止反應(yīng)，并加入1mL水，所得溶液用于過柱除鹽；

S34、過柱除鹽：，將S33所得溶液用C₁₈固相萃取柱除鹽，收集洗脫液過濾后，準(zhǔn)備上機(jī)；

S31中所述提取液為0.05mol/L Tris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH 8.0。

S31中超聲的條件為：超聲功率200W，超聲頻率40KHz；冰水浴條件下進(jìn)行；離心的條件為：4℃，12000r/min離心20min。

S34中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C₁₈固相萃取柱，將S13所得溶液上樣，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL60％乙腈+0.5％乙酸洗脫，收集的洗脫液經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

步驟S4采用液質(zhì)聯(lián)用三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，具體如下：

色譜條件：C₁₈色譜柱2.1mm×100mm(直徑×長(zhǎng)度)，填料粒徑1.9μm；流動(dòng)相：A相0.1％FA/H₂O，B相0.1％FA/CAN；色譜梯度為：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；18.5～25min，3％B；進(jìn)樣量為10μL，每個(gè)樣品至少采集三次數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓3500V；鞘氣38Arb；輔氣15Arb；離子傳輸管溫度275℃；離子源霧化溫度380℃；離子源溫度380℃；碰撞氣為1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均為0.7。

通過對(duì)待測(cè)樣品的特征多肽進(jìn)行母離子掃描以及MRM掃描，根據(jù)保留時(shí)間，多個(gè)定性離子匹配以及豐度信息，與標(biāo)準(zhǔn)植物成分的特征多肽進(jìn)行比較，從而判定待測(cè)樣品中含有的植物源性成分。

本發(fā)明所述植物包括大豆、豌豆、小麥、玉米、花生等。

本發(fā)明還提供按上述方法獲得的不同植物源性成分的特征多肽，其中大豆、花生的多肽信息見表1。

表1大豆、花生的特征多肽

本發(fā)明基于高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了一種特征性多肽篩選方法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肉類食品中多種植物源性成分的鑒別，優(yōu)點(diǎn)在于：

(一)通過選定目標(biāo)蛋白的Sequence coverage,Sequence length,peptides等信息，集中有效目標(biāo)蛋白的數(shù)量，大大提高了特異性多肽的篩選速度和效率，為多物種特異性多肽的篩選奠定了基礎(chǔ)。

(二)建立了同時(shí)測(cè)定多種植物蛋白成分的鑒別方法。

(三)采用從市場(chǎng)購買大批的肉制品對(duì)本方法進(jìn)行驗(yàn)證，證明即使在復(fù)雜的肉制品中，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種植物源性成分的準(zhǔn)確鑒別，該技術(shù)為肉類食品中植物源性成分檢出提供了一種靈敏、穩(wěn)定、特異以及高通量的分析方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中大豆在不同參數(shù)設(shè)置時(shí)所篩選的多肽數(shù)量。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中大豆的總離子流圖和提取離子流圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中花生的總離子流圖和提取離子流圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中肉類食品中檢測(cè)出的花生及大豆的色譜圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1標(biāo)準(zhǔn)植物成分特征多肽的獲得

1、標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的制備

1.1提取標(biāo)準(zhǔn)植物樣品總蛋白：分別稱取大豆、花生及二者混合樣品各1g，磨碎后得到標(biāo)準(zhǔn)植物樣品粉末，向每個(gè)樣品中加入5mL提取液，超聲(超聲功率200W，超聲頻率40KHz；冰水浴條件下進(jìn)行)提取30min，然后離心(4℃，12000r/min離心20min)，取上清液。

1.2還原及烷基化：取100μL上清液，加入50mmol/L二硫蘇糖醇溶液10μL，56℃振蕩反應(yīng)1h，然后降至室溫，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20μL，暗處反應(yīng)30min，再加入50mmol/L二硫蘇糖醇溶液15μL，暗處反應(yīng)15min。

1.3酶切：向上述反應(yīng)體系中加入25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0緩沖溶液750μL，然后加入20μg胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為8.0，37℃反應(yīng)過夜；向上述酶解液中加入TFA調(diào)pH值小于2終止反應(yīng)，并加入1mL水，所得溶液用于過柱除鹽。

1.4過柱除鹽：，將1.3所得溶液用C₁₈固相萃取柱除鹽，收集洗脫液過濾后，準(zhǔn)備上機(jī)。

步驟1.1中所述提取液為0.05mol/L Tris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH 8.0。

步驟1.4中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C₁₈固相萃取柱，將1.3所得溶液上樣，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL 60％乙腈+0.5％乙酸洗脫，收集的洗脫液經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

2、對(duì)各種標(biāo)準(zhǔn)植物樣品進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析利用Easy nLC1000液相色譜系統(tǒng)和Q Exactive HF質(zhì)譜儀檢測(cè)并篩選各種標(biāo)準(zhǔn)植物樣品中的特征多肽，具體如下：

色譜條件：C₁₈色譜柱2.1mm×100mm(直徑×長(zhǎng)度)，填料粒徑1.9μm；流動(dòng)相：A相0.1％FA/H₂O，B相0.1％FA/CAN；色譜梯度為：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；18.5～25min，3％B；進(jìn)樣量為10μL，每個(gè)樣品至少采集三次數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓3500V；鞘氣38Arb；輔氣15Arb；離子傳輸管溫度275℃；離子源霧化溫度380℃；離子源溫度380℃；碰撞氣為1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均為0.7。

3、篩選植物源性成分的相對(duì)專屬性多肽鏈

采用Maxquant軟件，對(duì)NCBI進(jìn)行全庫搜索，其中設(shè)置peptides不超過4，sequence length于140-600之間，sequence coverage不超過40％，unique peptides不超過4，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)，獲得相對(duì)特異性多肽，即各種標(biāo)準(zhǔn)植物樣品的特征多肽。以大豆為例，若不進(jìn)行特定參數(shù)設(shè)置，搜索到的蛋白數(shù)量達(dá)700多個(gè)，再篩選高豐度的特征性多肽鏈時(shí)，工作過于繁瑣，耗時(shí)更長(zhǎng)；經(jīng)過上述特定參數(shù)設(shè)置后，搜索到的蛋白數(shù)量降至37個(gè)，為后續(xù)多肽的篩選減輕了工作量；此外在這兩種篩選方式下，最終確定用于實(shí)際樣品檢測(cè)的特征多肽的種類是一致的，因此特定參數(shù)設(shè)置有助于提高工作效率。圖1列舉了大豆在不同參數(shù)設(shè)置時(shí)所篩選的多肽數(shù)量。

4、篩選各植物成分的特征離子對(duì)信息將篩選的多肽信息通過Skyline軟件導(dǎo)出MRM信息，并應(yīng)用至液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)中，并進(jìn)一步篩選各植物成分的特征離子對(duì)信息，具體條件如下：

色譜條件：C₁₈色譜柱2.1mm×100mm，填料粒徑1.9μm；流動(dòng)相：A相0.1％FA/H₂O，B相0.1％FA/CAN；色譜梯度為：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；18.5～25min，3％B；進(jìn)樣量為10μL，每個(gè)樣品至少采集三次數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓3500V；鞘氣38Arb；輔氣15Arb；離子傳輸管溫度275℃；離子源霧化溫度380℃；離子源溫度380℃；碰撞氣為1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均為0.7。

通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的特征多肽進(jìn)行MRM掃描，根據(jù)保留時(shí)間，多個(gè)定性離子匹配以及豐度信息，從而確定各植物成分的特征離子信息。

實(shí)施例2基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定肉類食品中含有的多種植物源性成分

1、待測(cè)肉類食品的前處理

1.1提取待測(cè)肉類食品樣品總蛋白：將待測(cè)樣品剪碎或分割成小塊，向1g樣品中加入5mL提取液，超聲(超聲功率200W，超聲頻率40KHz；冰水浴條件下進(jìn)行)提取30min，然后離心(4℃，12000r/min離心20min)，取上清液。

1.2還原及烷基化：取100μL上清液，加入50mmol/L二硫蘇糖醇溶液10μL，56℃振蕩反應(yīng)1h，然后降至室溫，加入100mmol/L碘乙酰胺溶液20μL，暗處反應(yīng)30min，再加入50mmol/L二硫蘇糖醇溶液15μL，暗處反應(yīng)15min。

1.3酶切：向上述反應(yīng)體系中加入25mmol/L Tris-HCl，pH 8.0緩沖溶液750μL，然后加入20μg胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為8.0，37℃反應(yīng)過夜；向上述酶解液中加入TFA調(diào)pH值小于2終止反應(yīng)，并加入1mL水，所得溶液用于過柱除鹽。

1.4過柱除鹽：，將1.3所得溶液用C₁₈固相萃取柱除鹽，收集洗脫液過濾后，準(zhǔn)備上機(jī)。

步驟1.1中所述提取液為0.05mol/L Tris-HCl+7mol/L尿素+2mol/L硫脲，pH 8.0。

步驟1.4中依次用乙腈、50％乙腈/水、0.1％TFA活化C₁₈固相萃取柱，將1.3所得溶液上樣，再依次用0.1％TFA，0.5％乙酸清洗，最后用1mL 60％乙腈+0.5％乙酸洗脫，收集的洗脫液經(jīng)0.22μm濾膜過濾。

2、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)肉類食品中的特征多肽，并與標(biāo)準(zhǔn)植物成分的特征多肽進(jìn)行比較，從而判定對(duì)應(yīng)的植物源性成分

采用液質(zhì)聯(lián)用三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，具體如下：

色譜條件：C₁₈色譜柱2.1mm×100mm(直徑×長(zhǎng)度)，填料粒徑1.9μm；流動(dòng)相：A相0.1％FA/H₂O，B相0.1％FA/CAN；色譜梯度為：0～0.2min，3％～10％B；0.2～16min，10％～40％B；16～17min，40％～80％B；17.5～18.5min，80％～3％B；18.5～25min，3％B；進(jìn)樣量為10μL，每個(gè)樣品至少采集三次數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓3500V；鞘氣38Arb；輔氣15Arb；離子傳輸管溫度275℃；離子源霧化溫度380℃；離子源溫度380℃；碰撞氣為1.5mTorr；Q1和Q3分辨率均為0.7。

通過對(duì)待測(cè)樣品的特征多肽進(jìn)行母離子掃描以及MRM掃描，根據(jù)保留時(shí)間，多個(gè)定性離子匹配以及豐度信息，與標(biāo)準(zhǔn)植物成分的特征多肽進(jìn)行比較，從而判定待測(cè)樣品中含有的植物源性成分。

共在肉類食品中檢測(cè)出大豆多肽12條，花生多肽9條，每個(gè)母離子下有多個(gè)子離子(表1)。圖2、圖3分別列舉了大豆和花生的總離子流圖(TIC圖)，以及多肽Peanut_1和Soy_6的子離子選擇離子流圖。圖4列舉了肉制品中檢測(cè)出大豆及花生的色譜圖。結(jié)果表明，在肉類食品中檢測(cè)出大豆成分及花生成分。

表1大豆、花生的特征多肽

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。