本發(fā)明涉及卷煙主流煙氣化學(xué)成分測(cè)定方法，具體涉及一種卷煙主流煙氣中煙堿的手性分析高效液相色譜法。

背景技術(shù)：

煙堿，也叫尼古丁，是一種存在于茄科植物中的生物堿，也是煙草的重要成分。煙堿分子含有一個(gè)手性中心，即四氫吡咯環(huán)上的2位碳原子，所以煙堿有兩個(gè)對(duì)映體：S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿。煙堿的兩個(gè)對(duì)映體具有完全不同含量、代謝機(jī)理和生理特性。因此需進(jìn)行卷煙主流煙氣中煙堿的手性分析。

目前關(guān)于煙堿的手性分析，主要是采用氣相色譜法進(jìn)行研究，例如申請(qǐng)?zhí)枮?01610663534.1的專利《一種卷煙煙絲中煙堿的手性分析方法》，該方法前處理步驟復(fù)雜，并且檢測(cè)時(shí)間達(dá)到140min，不能滿足大量樣品的檢測(cè)，目前尚未有關(guān)于卷煙主流煙氣中煙堿的手性分析的高效液相色譜方法。因此有必要開(kāi)發(fā)一種靈敏度高、精密度好、適合大批量準(zhǔn)確定量卷煙主流煙氣中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的方法。手性柱-正相液相色譜紫外檢測(cè)器在異構(gòu)體分離方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)，因此通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)建立了卷煙主流煙氣中煙堿手性的正相液相色譜紫外檢測(cè)分析方法，該方法更適合用于大量樣品中煙堿的手性分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的正是以煙堿為研究對(duì)象，對(duì)卷煙主流煙氣樣品進(jìn)行了前處理方法研究，建立了手性柱-正相液相色譜紫外檢測(cè)的卷煙主流煙氣中煙堿旋光異構(gòu)體的分析方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)卷煙主流煙氣中煙堿旋光對(duì)映體S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的準(zhǔn)確測(cè)定。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：將卷煙樣品抽吸后使用劍橋?yàn)V片捕集主流煙氣中的煙堿，濾片經(jīng)過(guò)氫氧化鈉溶液浸潤(rùn)后，采用甲基叔丁基醚和甲醇溶液萃取，萃取液經(jīng)基質(zhì)分散固相萃取凈化后，使用手性柱-正相液相色譜紫外檢測(cè)器分析，采用峰面積歸一化法定量檢測(cè)卷煙主流煙氣中S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的比例。具體步驟如下：

1. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取約100.0 mg的S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；稱取約50.0 mg的R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為1.0 mg/mL的R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；利用S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋，配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為100 μg/mL和5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，另外分別稀釋得到100 μg/mL的S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2. 卷煙主流煙氣的捕集：將卷煙置于溫度為（22±1）℃，濕度為（60±2）％的環(huán)境中平衡48小時(shí)，按照GB/T16450《常規(guī)分析用吸煙機(jī)定義和標(biāo)準(zhǔn)條件》調(diào)整吸煙機(jī)抽吸參數(shù)，Borgwaldt KC轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)上抽吸平衡后的卷煙5支，留取濾片；

3. 卷煙主流煙氣樣品的萃取：移取捕集有主流煙氣的濾片樣品于50 mL具塞離心管中，加入2.0 mL 5% 的氫氧化鈉溶液，渦旋1 min混勻后靜置10 min浸潤(rùn)樣品。取20 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到離心管中，并于旋渦混合器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

4. 萃取液的凈化：取1.5 mL萃取上清液于2 mL凈化離心管中（內(nèi)含150 mg無(wú)水硫酸鎂，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑；統(tǒng)稱基質(zhì)分散固相萃取材料），于旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以10000 rpm離心1min。取上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)相濾膜后進(jìn)液相分析。

5. 正相高效液相色譜條件：采用對(duì)照標(biāo)樣（即混合標(biāo)準(zhǔn)溶液）與樣品中煙堿色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的定性分析，對(duì)峰面積進(jìn)行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。分析柱為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長(zhǎng) 250 mm ，內(nèi)徑4.6 mm ，固定相粒徑5 μm)；流動(dòng)相為正己烷和甲醇溶液（98:2 ，V/V），流速1 mL/min；等度洗脫；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積 10 μL；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm；分析時(shí)間15 min。

本發(fā)明提供了一種卷煙主流煙氣中煙堿的手性分析高效液相色譜法，具有以下優(yōu)良效果：可減低樣品液對(duì)色譜柱的污染，液相檢測(cè)方法靈敏度高，分析時(shí)間短，能實(shí)現(xiàn)對(duì)S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的基線分離，R-(+)-煙堿的檢出限（LOD）為0.08%，能夠滿足大批量卷煙主流煙氣樣品中煙堿的手性分析。

附圖說(shuō)明

圖1為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，

圖2為卷煙主流煙氣樣品的色譜圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)以下具體實(shí)施例作進(jìn)一步描述，但不限制本發(fā)明。

1. 儀器和試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀配制紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司），AE163電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司），Borgwaldt KC轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)，美國(guó)Coleparmer Votex-Genie漩渦振蕩器，德國(guó)SIGMA 3-30K-高速臺(tái)式冷凍型離心機(jī)。正己烷（色譜純），氫氧化鈉（分析純），甲醇（色譜純），，S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：54-11-5），R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：25162-00-9）。

2. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取約100.0 mg的S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；稱取約50.0 mg的R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為1.0 mg/mL的R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；利用S-(-)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋，配制S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿濃度分別為100 μg/mL和5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，另外分別稀釋得到100 μg/mL的S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3. 卷煙主流煙氣的捕集：將卷煙置于溫度為（22±1）℃，濕度為（60±2）％的環(huán)境中平衡48小時(shí)，按照GB/T16450《常規(guī)分析用吸煙機(jī)定義和標(biāo)準(zhǔn)條件》調(diào)整吸煙機(jī)抽吸參數(shù)，Borgwaldt KC轉(zhuǎn)盤(pán)吸煙機(jī)上抽吸平衡后的卷煙5支，留取濾片；

4. 卷煙主流煙氣樣品的萃?。阂迫〔都兄髁鳠煔獾臑V片樣品于50mL具塞離心管中，加入2.0 mL 5% 的氫氧化鈉溶液，渦旋1min混勻后靜置10 min浸潤(rùn)樣品。取20 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到離心管中，并于旋渦混合器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

5. 萃取液的凈化：取1.5 mL上清液于2 mL凈化離心管中（內(nèi)含150 mg無(wú)水硫酸鎂，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑），于旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以10000 rpm離心1min。取上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)相濾膜后進(jìn)液相分析。

6. 正相高效液相色譜條件：采用對(duì)照標(biāo)樣與樣品中煙堿色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的定性分析，對(duì)峰面積進(jìn)行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。分析柱為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長(zhǎng) 250 mm ，內(nèi)徑4.6 mm ，固定相粒徑5 μm)；流動(dòng)相為正己烷和甲醇溶液（98:2 ，V/V），流速1 mL/min；等度洗脫；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積 10 μL；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm；分析時(shí)間15 min。

7. R-(+)-煙堿的檢出限

煙堿的手性組成通常以R-(+)-煙堿占總煙堿的百分比來(lái)表示。為評(píng)估R-(+)-煙堿的檢出限，本發(fā)明方法在S-(-)-煙堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入R-(+)-煙堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果表明，S-(-)-煙堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液中即可觀察到R-(+)-煙堿的響應(yīng)信號(hào)，對(duì)定量離子峰面積進(jìn)行歸一化后，S-(-)-煙堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液中R-(+)-煙堿的比例為0.08%（峰面積相對(duì)于總煙堿峰面積），以此作為本方法R-(+)-煙堿的檢出限。

8. 卷煙主流煙氣樣品中煙堿的手性分析實(shí)例

將按照上述步驟處理的卷煙主流煙氣樣品進(jìn)行正相高效液相色譜分析；采用對(duì)照標(biāo)樣與卷煙主流煙氣樣品煙堿色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿的定性分析，對(duì)峰面積進(jìn)行歸一化定量S-(-)-煙堿和R-(+)-煙堿占總煙堿的比例。

采用該方法對(duì)5個(gè)卷煙主流煙氣樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

9. 分析方法的精密度

取同一卷煙主流煙氣樣品進(jìn)行5次日內(nèi)和日間平行測(cè)定，考察了本發(fā)明方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。結(jié)果表明，卷煙主流煙氣樣品中R-(+)-煙堿的日內(nèi)和日間測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)分別為3.19%和2.94%，精密度較好。

采用具體實(shí)施方式中的方法對(duì)上述5個(gè)卷煙主流煙氣樣品進(jìn)行了檢測(cè)。檢測(cè)得到的色譜圖如圖1和圖2所示。