本發(fā)明公開了一種量化分析細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中主要微量生物堿的方法，具體來說是涉及一種基于氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測定細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中主要微量生物堿的方法，屬于卷煙理化指標(biāo)檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來，隨著人們健康意識的不斷提高，消費者對卷煙產(chǎn)品的選擇也逐漸向高品質(zhì)低危害轉(zhuǎn)變，細(xì)支卷煙的低焦油特點更是迎合了這一趨勢，使其逐步得到消費者認(rèn)可和青睞。作為快速增長的中式卷煙新品類，細(xì)支卷煙在減害降焦、降本增效等領(lǐng)域有著天然的優(yōu)勢。但是，其在抽吸過程中存在勁頭滿足感方面一定程度上弱于同檔次常規(guī)卷煙。為探明原因，必須剖析細(xì)支卷煙抽吸過程中內(nèi)在化學(xué)成分的遞送規(guī)律，深入了解相關(guān)物質(zhì)釋放量的規(guī)律特性，為掌控細(xì)支卷煙的品質(zhì)定位提供科學(xué)依據(jù)和理論支撐。

對于細(xì)支卷煙而言，較小的橫截面積和較大的煙支長度均導(dǎo)致其吸阻明顯大于常規(guī)卷煙。而卷煙吸阻對感官質(zhì)量特性起到重要作用，過大的卷煙吸阻容易影響消費者抽吸時的輕松感、滿足感等體驗。研究表明，煙草中生物堿是提供煙氣滿足感的內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)，這其中最主要的生物堿是煙堿，其約占了煙草生物堿總量的95％以上，其次是降煙堿、去甲基去氫煙堿(麥司明)、新煙草堿、假木賊堿。準(zhǔn)確測定卷煙主流煙氣中生物堿對卷煙的吸食品質(zhì)評價有重要作用。

文獻(xiàn)調(diào)研表明，通常煙草和煙氣中的生物堿可采用薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)等方法分離，再結(jié)合氮磷檢測器(NPD)或質(zhì)譜(MS)進(jìn)行鑒定。常用的提取方法有蒸餾萃取法、超臨界流體萃取、液膜萃取和離子交換法等。1967年，Kossey使用二維薄層色譜(TLC)同時分離了10種煙草生物堿。1980年，Plade等使用HPLC分離測定了煙草提取液中的4種生物堿。1981年，Severson等使用快速玻璃毛細(xì)管GC-NPD定性定量地測定了煙草中的煙堿、降煙堿、麥斯明、新煙堿、假木賊堿和2’3-聯(lián)吡啶。2004年，蘇明亮等采用溶劑超聲提取煙草生物堿，并結(jié)合GC-NPD分析技術(shù)系統(tǒng)分析了煙絲、煙氣和濾嘴樣品中的煙堿、降煙堿、假木賊堿、新煙草堿、麥斯明和可替寧等6種生物堿。2006年，許燕娟等將煙草樣品經(jīng)二氯甲烷/甲醇萃取和DB-5MS毛細(xì)管柱分離，采用GC-FID法進(jìn)行了定量分析。2016年，姬厚偉等人建立了超聲萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)同時測定卷煙主流煙氣中8種生物堿(煙堿、降煙堿、麥斯明、二烯煙堿、假木賊堿、新煙草堿、2’3-聯(lián)吡啶和可替寧)的分析方法。捕集了卷煙主流煙氣總粒相物的劍橋濾片經(jīng)8％的NaOH溶液浸泡后，用乙酸乙酯超聲萃取，在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下進(jìn)行GC-MS/MS分析，內(nèi)標(biāo)法定量。

以上相關(guān)文獻(xiàn)對生物堿的定量分析主要是針對煙草或整個卷煙主流煙氣進(jìn)行，并沒有對卷煙主流煙氣逐口中的釋放量進(jìn)行分析。唯一關(guān)聯(lián)文獻(xiàn)是，2011年丁超等人為測定卷煙煙氣總粒相物中5種生物堿(煙堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿和新煙草堿)，采用經(jīng)改造的吸煙機對卷煙進(jìn)行抽吸，用劍橋濾片捕集20支卷煙的每口煙氣總粒相物，濾片經(jīng)超聲波萃取、離心后，取上層清液用GC/MS進(jìn)行測定分析。但該方法是針對常規(guī)粗支卷煙進(jìn)行研究的，對于細(xì)支卷煙而言，除了適合檢測釋放量最大的煙堿外，其余微量的主要生物堿因其釋放量較低，并不適合采用該方法進(jìn)行分析。為此，本專利采用GC-MS/MS的分析手段，首次測定細(xì)支卷煙主流煙氣逐口煙氣中麥司明、假木賊堿、新煙草堿等3種主要微量生物堿的釋放量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有的技術(shù)缺陷，提供一種采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中麥司明、假木賊堿、新煙草堿等3種主要微量生物堿的方法，該方法能準(zhǔn)確量化分析卷煙主流煙氣中微量的主要生物堿含量，測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，基質(zhì)干擾少。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種量化分析細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中主要微量生物堿的方法，包括以下步驟：

(1)內(nèi)標(biāo)溶液的制備：以正十七碳烷為內(nèi)標(biāo)物，使用甲醇為溶劑，制備內(nèi)標(biāo)溶液。

(2)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備：以麥司明、假木賊堿、新煙草堿等物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品為目標(biāo)物，使用甲醇為溶劑，經(jīng)逐級稀釋制備成標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，然后分別加入一定量的內(nèi)標(biāo)溶液，制備成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

(3)樣品溶液的制備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法對細(xì)支卷煙進(jìn)行抽吸，固定抽吸口數(shù)，用劍橋濾片收集每口煙氣的粒相物。然后對每個捕有粒相物的劍橋濾片分別加入一定量的內(nèi)標(biāo)溶液、一定體積的稀氫氧化鈉溶液和一定體積的萃取溶劑，超聲提取，再將提取液離心，取上清液過裝有無水硫酸鈉的微孔過濾器后，得樣品溶液。

(4)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析：用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行檢測分析。

(5)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制及樣品結(jié)果的計算。

所述的內(nèi)標(biāo)溶液的制備，具體過程為：準(zhǔn)確稱取0.2g正十七碳烷，精確至0.1mg，于100mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。

所述的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備具體包括以下步驟：

(1)單標(biāo)儲備液：準(zhǔn)確稱取10mg麥司明、10mg假木賊堿、5mg新煙草堿標(biāo)準(zhǔn)樣品，精確至0.1mg，各移置于50mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。

(2)混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確移取1mL麥司明單標(biāo)儲備液、0.5mL假木賊堿單標(biāo)儲備液以及1mL新煙草堿單標(biāo)儲備液，混合于50mL的容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別量取混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液0.05mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2.5mL和5mL，再分別加入內(nèi)標(biāo)溶液25μL，于10mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得到6級系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

所述的樣品溶液的制備具體包括以下步驟：

(1)卷煙抽吸：按照GB/T 19609標(biāo)準(zhǔn)的要求抽吸20支細(xì)支卷煙，固定抽吸口數(shù)為5口/支，用44mm劍橋濾片捕集細(xì)支卷煙主流煙氣中的粒相物。

(2)粒相物萃?。簩γ總€捕有粒相物的劍橋濾片分別加入25μL內(nèi)標(biāo)溶液、2.5mL濃度為8％的氫氧化鈉溶液，以及10mL萃取溶劑乙酸乙酯，超聲提取30min，再將提取液于3000r/min條件下離心5min，取上清液1.5mL裝有2g無水硫酸鈉的微孔過濾器，分別得到第1口至第5口逐口煙氣對應(yīng)的樣品溶液。

所述的GC-MS/MS分析，其儀器分析條件為：采用DB-17MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛細(xì)管色譜柱；載氣為氦氣，恒流速度為1.0mL/min；進(jìn)樣方式：進(jìn)樣量為1μL，脈沖不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣脈沖壓力為25psi，時間為0.75min；進(jìn)樣口溫度為250℃；傳輸線溫度為280℃；升溫程序為初始溫度為60℃，保持1min，以5℃/min的速率升高至200℃，再以10℃/min的速率升高至280℃，保持10min。其質(zhì)譜分析條件為：電離方式為EI源，正離子模式；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：均為150℃；碰撞氣：氮氣，流速1.5mL/min，載氣(氦氣)流速為2.25mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，詳細(xì)參數(shù)列于下表。

目標(biāo)物的MRM參數(shù)情況

所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及結(jié)果計算如下：以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的濃度之比為橫坐標(biāo)，以色譜圖中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將相同條件下測得的樣品溶液中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比，代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)下列公式求得卷煙樣品中目標(biāo)物的含量。

式中：

W——細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中3種主要微量生物堿的含量，單位為微克每支(μg/支)；

A——3種主要微量生物堿的峰面積；

As——對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積；

b——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的截距；

Ms——添加內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量，單位為微克(μg)；

a——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率；

M——煙支的數(shù)量，單位為支。

有益效果：本發(fā)明的檢測方法對樣品處理方法及色譜質(zhì)譜分析條件進(jìn)行了優(yōu)化確認(rèn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)良效果：

(1)本發(fā)明方法創(chuàng)新使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中麥司明、假木賊堿、新煙草堿等3種主要微量生物堿的方法，解決了細(xì)支卷煙逐口煙氣該類化合物水平低，以及煙氣復(fù)雜基質(zhì)對目標(biāo)物的分析干擾嚴(yán)重等因素的影響。

(2)本發(fā)明方法針對細(xì)支卷煙逐口煙氣中目標(biāo)物含量低的特征，創(chuàng)新采用“脈沖不分流”的分析模式，大為提高了目標(biāo)物的響應(yīng)靈敏度。同時，本發(fā)明方法利用內(nèi)標(biāo)法定量，可以不用精準(zhǔn)定容，且可以減少由前處理方法重現(xiàn)性和儀器精密度問題帶來的誤差。

附圖說明

圖1為本發(fā)明測定方法的流程圖；

圖2為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)正十七碳烷和3種微量生物堿的離子對色譜圖；

圖3為細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中內(nèi)標(biāo)正十七碳烷和3種微量生物堿的離子對色譜圖。

具體實施方式

實施例1

本實施例對量化分析細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中麥司明、假木賊堿、新煙草堿等3種主要微量生物堿的檢測方法如下(所述檢測方法的流程圖如圖1所示)：

(1)內(nèi)標(biāo)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.2020g正十七碳烷，于100mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為2020μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

(2)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

①單標(biāo)儲備液：準(zhǔn)確稱取10.24mg麥司明、10.05mg假木賊堿、5.01mg新煙草堿標(biāo)準(zhǔn)樣品，各移置于50mL的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度分別為204.8μg/mL、201μg/mL和100.2μg/mL的單標(biāo)溶液。

②混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確移取1mL麥司明單標(biāo)儲備液、0.5mL假木賊堿單標(biāo)儲備液以及1mL新煙草堿單標(biāo)儲備液，混合于50mL的容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。

③標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別量取混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液0.05mL、0.1mL、0.5mL、1mL、2.5mL和5mL，再分別加入內(nèi)標(biāo)溶液25μL，于10mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，得到6級系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。其中麥司明的濃度范圍為0.1024～10.24μg/mL、假木賊堿的濃度范圍為0.1005～10.05μg/mL以及新煙草堿的濃度范圍為0.0501～5.01μg/mL，其中內(nèi)標(biāo)物的濃度為5.05μg/mL。

(3)樣品溶液的制備

①卷煙抽吸：以一市銷細(xì)支卷煙為對象，按照GB/T 19609標(biāo)準(zhǔn)的要求抽吸20支細(xì)支卷煙，固定抽吸口數(shù)為5口/支，用44mm劍橋濾片捕集細(xì)支卷煙主流煙氣中的粒相物。

②粒相物萃?。簩γ總€捕有粒相物的劍橋濾片分別加入25μL內(nèi)標(biāo)溶液、2.5mL濃度為8％的氫氧化鈉溶液，以及10mL萃取溶劑乙酸乙酯，超聲提取30min，再將提取液于3000r/min條件下離心5min，取上清液1.5mL裝有2g無水硫酸鈉的微孔過濾器，分別得到第1口至第5口逐口煙氣對應(yīng)的樣品溶液，即為1#、2#、3#、4#和5#。

(4)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析

分別取6個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和5個樣品待測溶液進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析(所述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、典型樣品溶液中內(nèi)標(biāo)物和目標(biāo)物的色譜圖如圖2～圖3所示)。

其儀器分析條件為：采用DB-17MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛細(xì)管色譜柱；載氣為氦氣，恒流速度為1.0mL/min；進(jìn)樣方式：進(jìn)樣量為1μL，脈沖不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣脈沖壓力為25psi，時間為0.75min；進(jìn)樣口溫度為250℃；傳輸線溫度為280℃；升溫程序為初始溫度為60℃，保持1min，以5℃/min的速率升高至200℃，再以10℃/min的速率升高至280℃，保持10min。其質(zhì)譜分析條件為：電離方式為EI源，正離子模式；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：均為150℃；碰撞氣：氮氣，流速1.5mL/min，載氣(氦氣)流速為2.25mL/min；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，詳細(xì)參數(shù)列于下表。

目標(biāo)物的MRM參數(shù)情況

(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及結(jié)果計算

首先，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的濃度之比為橫坐標(biāo)，以色譜圖中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。取最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，做9次平行檢測分析，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的濃度，換算得出方法的檢出限。與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相對應(yīng)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限等數(shù)據(jù)見下表。

分析方法的工作曲線和檢出限

將相同條件下測得的樣品溶液中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比，代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，根據(jù)下列公式求得卷煙樣品中目標(biāo)物的含量。

式中：

W——細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中3種主要微量生物堿的含量，單位為微克每支(μg/支)；

A——3種主要微量生物堿的峰面積；

As——對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積；

b——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的截距；

Ms——添加內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量，單位為微克(μg)；

a——標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率；

M——煙支的數(shù)量，單位為支。

本實施例中細(xì)支卷煙主流逐口煙氣中3種主要微量生物堿檢測結(jié)果見下表：

實施例2

本實施例對本發(fā)明的精密度和加標(biāo)回收率的檢測方法如下：

以實施例1中所用的細(xì)支卷煙樣品為樣品，針對其中的第3口卷煙煙氣，分別進(jìn)行了日內(nèi)精密度實驗，日內(nèi)精密度實驗為相同樣品在同一條件下平行測定6次(同一批次處理)，分別計算6次平行測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，測定結(jié)果見下表。表中結(jié)果顯示，本實驗方法的日內(nèi)重復(fù)性的RSD<10％，對于痕量物質(zhì)的定量分析來說，表明方法具有良好的精密度。

以重復(fù)性試驗所用細(xì)支卷煙樣品為分析對象，針對其中的第3口卷煙煙氣，按照上述樣品前處理方法進(jìn)行處理，加入其釋放量相當(dāng)?shù)暮康臉?biāo)樣，進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)試驗，結(jié)果見下表。從表中可以看出，樣品的加標(biāo)回收率在80.41％～91.54％之間，說明方法具有較好的準(zhǔn)確性。

本發(fā)明采用正十七碳烷為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量，經(jīng)優(yōu)化后的檢測方法目標(biāo)物提取完善，響應(yīng)靈敏、定量分析準(zhǔn)確，有效地減少了因樣品基質(zhì)復(fù)雜帶來的干擾，所采用的分析儀器條件使得目標(biāo)物具有較好的信號響應(yīng)，并且具有較好的線性相關(guān)性，3種主要微量生物堿的檢出限分別為17.60ng/支、16.59ng/支和10.10ng/支，重復(fù)性(RSD)分別為4.27％、7.82％和8.15％，加標(biāo)回收率分別為91.54％、83.10％和80.41％。說明本方法的靈敏度高，重復(fù)性和回收率較好，適合于細(xì)支卷煙逐口煙氣復(fù)雜基質(zhì)中微量目標(biāo)物的定量分析。

本實施例所用到的標(biāo)準(zhǔn)溶液僅以其中的一個濃度為例進(jìn)行說明的，其它濃度值所制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程與上述實施例相同，在此不在一一列舉。所舉實施例只是為了更好的理解本發(fā)明方法，并不具有任何限制作用，即上述方法或者等同上述情況的方法均包含在本發(fā)明的技術(shù)方案的保護范圍中。