本發(fā)明屬于藥物分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體的說，是關(guān)于一種泛影酸原料藥的高效液相色譜定性定量分析方法及其應(yīng)用，所述高效液相色譜方法用于對(duì)泛影酸原料藥、泛影酸原料藥合成中的原料及關(guān)鍵中間體進(jìn)行成分分析以及用于對(duì)泛影酸原料藥的含量進(jìn)行快速測(cè)定。

背景技術(shù)：

泛影酸(Diatrizoic acid，結(jié)構(gòu)式如下式所示)，化學(xué)名為3,5-雙(乙酰氨基)-2,4,6-三碘-苯甲酸，為X線診斷用陽性造影劑，供配制泛影葡胺、泛影酸鈉或復(fù)方泛影葡胺注射液應(yīng)用。主要用于泌尿系造影，亦用于心血管、腦血管、周圍血管、膽管等造影及各種注射法造影如關(guān)節(jié)腔、子宮輸卵管及瘺管等造影，

泛影酸的工藝路線如下，因此泛影酸原料藥中很能會(huì)存在原料硝基物、及其中間體氨基物和碘代物，

目前，有少量的文獻(xiàn)有關(guān)于泛影酸分析方法的文獻(xiàn)報(bào)道，泛影葡胺注射液收錄于《中國(guó)藥典》2005年版，含量測(cè)定方法是采用加氫氧化鈉試液、加熱回流處理樣品，然后用硝酸銀滴定，該方法操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)誤差大?！吨袊?guó)藥物與臨床》2011年第5期，寧慧青等人發(fā)表的題目為《高效液相色譜法測(cè)定泛影葡胺注射液含量》文章中，采用甲醇-緩沖液(0.025mol/L磷酸二氫鈉水溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH＝3.0)＝10-90為流動(dòng)相，控制流速在1.0mL/min，但是該方法是對(duì)制劑中的泛影酸進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)生產(chǎn)中可能存在的中間體，沒有說明。該方法在實(shí)際檢測(cè)的中，可以檢測(cè)合成工藝中的氨基物，卻無法檢測(cè)出合成路徑中的關(guān)鍵中間體碘代物及原料硝基物。因此，研究一種泛影酸的高效液相色譜分析方法，這對(duì)醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)來說顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種方便快捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的泛影酸原料藥的高效液相色譜定性定量分析方法，以解決現(xiàn)有的硝酸銀滴定法操作繁瑣、實(shí)驗(yàn)誤差大的問題；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種高效液相色譜定性定量分析方法在泛影酸原料藥的成分分析以及泛影酸原料藥的含量測(cè)定中的應(yīng)用，保證原料藥的生產(chǎn)和質(zhì)量。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種泛影酸原料藥的高效液相色譜定性定量分析方法，以核殼型色譜柱為色譜柱，以乙腈和磷酸水為流動(dòng)相，采用等度洗脫的方式進(jìn)行分離，所述乙腈和磷酸水的體積配比為30:70。

根據(jù)本發(fā)明，所述的色譜柱為Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18 100A 150×4.6mm。

根據(jù)本發(fā)明，所述磷酸水溶液的pH值為2.0。

進(jìn)一步的，所述高效液相色譜定性定量分析方法采用如下的色譜分離條件進(jìn)行分離：

流動(dòng)相的流速為1.00mL/min；

色譜柱溫度為30℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)為238nm；

進(jìn)樣量為10μL。

進(jìn)一步的，所述等度洗脫的時(shí)間為12min。

一種泛影酸原料藥的高效液相色譜定性定量分析方法在泛影酸原料藥的成分分析和含量檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的泛影酸原料藥的高效液相色譜定性定量分析方法及應(yīng)用，其有益效果是：

1、不僅能夠?qū)Ψ河八嵩纤幍暮窟M(jìn)行快速的測(cè)定，還能夠?qū)铣芍械脑霞瓣P(guān)鍵中間體進(jìn)行檢測(cè)，保證原料藥的生產(chǎn)和質(zhì)量；

2、能夠準(zhǔn)確測(cè)定泛影酸原料藥的含量，以及測(cè)定泛影酸原料藥的純度，比藥典沉淀滴定法方便快捷、準(zhǔn)確，解決了泛影酸原料藥的質(zhì)量控制問題，確保了泛影酸原料藥的質(zhì)量，為工業(yè)化大生產(chǎn)帶來了巨大的社會(huì)意義，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1分離度溶液的色譜圖；

圖2為實(shí)施例1氨基物儲(chǔ)備液的色譜圖；

圖3為實(shí)施例1泛影酸對(duì)照品溶液的色譜圖；

圖4為實(shí)施例2分離度溶液的色譜圖；

圖5為實(shí)施例2碘代物儲(chǔ)備液的色譜圖；

圖6為實(shí)施例2氨基物儲(chǔ)備液的色譜圖；

圖7為實(shí)施例2硝基物儲(chǔ)備液的色譜圖；

圖8為實(shí)施例3的其中一針泛影酸對(duì)照品溶液的色譜圖；

圖9為實(shí)施例3的其中一針泛影酸供試品溶液的色譜圖；

圖10為實(shí)施例3的泛影酸的線性關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件進(jìn)行。

實(shí)施例1-4所用到的儀器如下：

(1)戴安(DIONEX)UltiMate 3000，含UltiMate 3000Pump，UltiMate 3000Autosampler，UltiMate 3000Column Compartment，UltiMate 3000Photodiode Arrary detector，Chromeleon工作站，美國(guó)戴安公司；

(2)Ultra Sonic Cleaner USK Type超聲波清洗器；

(3)色譜柱：Kinete XB-C18 100A 5μm 150×4.6mm，廣州費(fèi)羅門科學(xué)儀器有限公司。

實(shí)施例1-3中的樣品制備如下：

(1)泛影酸對(duì)照品溶液：稱取泛影酸對(duì)照品10mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加2ml-3ml甲醇溶解并用流動(dòng)相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，搖勻，配置成濃度約為0.2mg/mL的乙腈水溶液。

(2)泛影酸供試品溶液：稱取泛影酸供試品10mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加2ml-3ml甲醇溶解并用流動(dòng)相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，搖勻，配置成濃度約為0.2mg/mL的乙腈水溶液。

(3)分離度溶液：稱取泛影酸對(duì)照品10mg、碘代物、氨基物以及硝基物質(zhì)對(duì)照品1mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加2ml-3ml甲醇溶解并用流動(dòng)相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，搖勻。其中泛影酸的濃度約為0.2mg/mL，碘代物、氨基物和硝基物的濃度約為20μg/mL。

(4)碘代物儲(chǔ)備液：稱取碘代物1mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，流動(dòng)相(乙腈和水配溶液)溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度約為20μg/mL的乙腈水溶液。

(5)氨基物儲(chǔ)備液：稱取碘代物0.5mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，流動(dòng)相(乙腈和水配溶液)溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度約為10μg/mL的乙腈水溶液。

(6)硝基物儲(chǔ)備液：稱取碘代物1mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，流動(dòng)相(乙腈和水配溶液)溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度約為10μg/mL的乙腈水溶液。

實(shí)施例1采用文獻(xiàn)的方法定性檢測(cè)泛影酸以及合成泛影酸的原料硝基物、關(guān)鍵中間體

《中國(guó)藥物與臨床》2011年第5期，寧慧青等人發(fā)表的題目為《高效液相色譜法測(cè)定泛影葡胺注射液含量》的文獻(xiàn)中對(duì)制劑中泛影酸進(jìn)行檢測(cè)。但對(duì)生產(chǎn)中可能存在的中間體沒有說明。為此申請(qǐng)人用文獻(xiàn)中的方法對(duì)原料藥和原料藥中可能存在有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，步驟如下：

(1)色譜條件

流動(dòng)相流速：1.0mL/min；

色譜柱溫度：30℃；

進(jìn)樣體積：5μL；

檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；

色譜柱：Agilent SB-C18 5μm 150×4.6mm；

流動(dòng)相等度洗脫：甲醇：緩沖液(0.025mol/L磷酸二氫鈉水溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH＝3.0)＝10：90，等度洗脫20min。

(2)計(jì)算方式

連續(xù)進(jìn)樣兩針分離度溶液，再連續(xù)進(jìn)樣分離度溶液、泛影酸對(duì)照品溶液、碘代物儲(chǔ)備液、氨基物儲(chǔ)備液和硝基物儲(chǔ)備液。根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間和全波長(zhǎng)掃描的紫外吸收?qǐng)D，進(jìn)行定性分析。

(3)液相結(jié)果

典型譜圖見圖1、2、3，圖1為分離度溶液的色譜峰，其中9.167min數(shù)值為泛影酸的峰，3.488min數(shù)值為氨基物的峰。圖2為氨基物儲(chǔ)備液的色譜峰，保留時(shí)間為3.505min，圖3為泛影酸對(duì)照品溶液的色譜峰，保留時(shí)間為8.733min。另外，碘代物儲(chǔ)備液和硝基物儲(chǔ)備液沒有出現(xiàn)色譜峰。

結(jié)論：采用實(shí)施例1的液色譜分析方法可以檢測(cè)出泛影酸以及泛影酸合成中的中間體氨基物，但無法檢測(cè)出合成中的重要中間體及原料硝基物。

實(shí)施例2泛影酸、合成泛影酸的原料硝基物、關(guān)鍵中間體的分離檢測(cè)

(1)色譜條件

流動(dòng)相流速：1.0mL/min；

色譜柱溫度：30℃；

進(jìn)樣體積：10μL；

檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；

色譜柱：Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18 100A 150×4.6mm；

流動(dòng)相等度洗脫：乙腈：磷酸水(pH＝2.0)＝30：70，等度洗脫20min。

(2)計(jì)算方法

連續(xù)進(jìn)樣分離度溶液、碘代物儲(chǔ)備液、氨基物儲(chǔ)備液、硝基物儲(chǔ)備液。根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間以及紫外吸收光譜圖，通過分離度溶液的峰鑒別對(duì)原料藥中可能存在的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，用面積歸一法確定分離度溶液中雜質(zhì)的含量和有關(guān)物質(zhì)的化學(xué)純度。

(3)液相結(jié)果

典型譜圖見4、5、6、7。圖4為分離度溶液液相色譜圖，其中1.740min為泛影酸的峰，1.282min為氨基物的峰，7.088min為碘代物的峰，8.032min為硝基物的峰，氨基物、碘代物和硝基物的含量為6.95％，2.70，34.20。圖5為碘代物儲(chǔ)備液的色譜圖，其中7.027min為碘代物的峰，純度為95.12％。圖6為氨基物儲(chǔ)備液的色譜圖，其中1.283min為氨基物的峰，純度為98.77％。圖7為硝基物儲(chǔ)備液的色譜圖，其中7.540min為硝基物的峰，純度為99.91％。根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間和全波長(zhǎng)掃描的紫外吸收?qǐng)D，進(jìn)行定性分析，確定原料藥中可能存在的有關(guān)物質(zhì)，以及初步確定雜質(zhì)的含量，對(duì)原料的生產(chǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)論：采用實(shí)施例2的色譜分析方法可以對(duì)泛影酸原料藥中可能存在原料硝基物及其關(guān)鍵中間體等進(jìn)行分離檢測(cè)，還可以初步測(cè)定起始原料硝基物和氨基物的化學(xué)純度，保證了起始原料的含量符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)測(cè)定反應(yīng)中重要中間產(chǎn)物碘代物的純度，對(duì)該反應(yīng)進(jìn)行全面的監(jiān)控和質(zhì)量控制。

實(shí)施例3泛影酸原料藥的含量測(cè)定

(1)采用與實(shí)施例1相同的色譜條件，具體如下：

流動(dòng)相流速：1.0mL/min；

色譜柱溫度：30℃；

進(jìn)樣體積：10μL；

檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm；

色譜柱：Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18 100A 150×4.6mm；

流動(dòng)相等度洗脫：乙腈：磷酸水(pH＝2.0)＝30：70，等度洗脫20min。

(2)計(jì)算方法

泛影酸的含量：W_試＝(A_試·m_對(duì)·W_對(duì))/(A_對(duì)·m_試)

式中：

A_對(duì)—對(duì)照品溶液中，泛影酸峰面積的平均值；

A_試—供試品溶液中，泛影酸面積的平均值；

m_對(duì)—泛影酸對(duì)照品的質(zhì)量，單位為克(g)；

m_試—泛影酸供試品的質(zhì)量，單位為克(g)；

W_對(duì)—泛影酸對(duì)照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以％表示；

W_試—泛影酸供試品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以％表示。

(3)液相結(jié)果

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣五針，其中一針線性泛影酸對(duì)照品溶液的典型圖譜見圖8(其它四針的典型圖譜基本一致，省略)。如圖8所示，泛影酸對(duì)照品溶液的5個(gè)樣品分別進(jìn)樣所得的峰面積的平均值為103.2610mAu*min，RSD為0.11％。

對(duì)供試品進(jìn)樣五針，五針線性泛影酸供試品溶液的典型圖譜見圖9(其它四針的典型圖譜基本一致，省略)，如圖9所示，為泛影酸供試品溶液的5個(gè)樣品所得峰面積平均值為92.6476mAu*min，RSD為0.24％。

采用外標(biāo)法將對(duì)照品和供試品的峰面積的平均值代入計(jì)算方法的方程式中即可得供試品泛影酸的含量為93.75％。

實(shí)施例4實(shí)施例3的檢測(cè)方法的方法學(xué)考察：

(1)精密度

按照實(shí)施例3的方法，選取同一批泛影酸對(duì)照品，按泛影酸對(duì)照品溶液的制備方法，依次配置0.19mg/mL、0.19mg/mL、0.2mg/mL、0.21mg/mL、0.22mg/mL、0.23mg/mL的泛影酸測(cè)試溶液，進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)溶液進(jìn)樣1針用泛影酸測(cè)試溶液計(jì)算主峰回收率。泛影酸的重復(fù)性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1泛影酸的重復(fù)性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

從表1可以看出，6次測(cè)定結(jié)果，泛影酸的平均回收率為104.62％，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD％為1.43％，小于2.0％，(RSD≤2.0％，精密度符合驗(yàn)證要求)。

結(jié)論：實(shí)施例3的色譜分析方法檢測(cè)泛影酸含量的精密度高，重現(xiàn)性好。

(2)線性關(guān)系

按照實(shí)施例3的方法，稱取泛影酸對(duì)照品0.7mg、2mg、2.9mg、4.1mg、5.3mg精密稱定，置10mL容量瓶中，加2ml甲醇溶解并用流動(dòng)相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，搖勻。對(duì)樣品濃度(X)和峰面積(Y)進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析，線性回歸方程為Y＝361.87X+28.43,R²＝0.9983；線性關(guān)系如圖10所示，泛影酸的線性測(cè)試結(jié)果如表2所示。

表2泛影酸的線性測(cè)試結(jié)果

從表2和圖10可以看出：在0.07mg/ml-0.53mg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系。

(3)準(zhǔn)確度

按照實(shí)施例3的方法，配制系線性范圍內(nèi)80％，100％，120％低中高三個(gè)濃度，計(jì)算回收率。按照實(shí)施例3的方法，稱取泛影酸對(duì)照品1.2mg、1.7mg、2.0mg精密稱定，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并用流動(dòng)相(乙腈和水配溶液)定容至刻度，搖勻。分別進(jìn)樣低中高三個(gè)濃度的樣品，回收率在98.30％-104.95％之間(回收率在90.0％-120.0％，符合驗(yàn)證要求)。泛影酸的回收率測(cè)試結(jié)果如表3所示。

表3泛影酸的回收率測(cè)試結(jié)果

結(jié)論：采用實(shí)施例3的方法檢測(cè)泛影酸的含量具有良好的準(zhǔn)確度。

綜上所述，本發(fā)明的一種泛影酸的高效液相色譜分析方法，可以有效將泛影酸原料及中間體分離而進(jìn)一步準(zhǔn)確對(duì)純度進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)泛影酸原料藥進(jìn)行質(zhì)量控制。

以上所述僅是本發(fā)明的實(shí)施方式的舉例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。