本發(fā)明涉及一種植物提取物的鑒別及其中原花青素含量的測(cè)定方法，具體涉及一種越橘提取物的鑒別及其中原花青素含量的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

原花青素(Proanthocyanidins，PC)是植物中廣泛存在的一大類(lèi)多酚化合物的總稱(chēng)，屬于生物類(lèi)黃酮，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素聚合而成，其最高平均聚合度達(dá)十五聚體。按聚合度的大小，通常將二至四聚體稱(chēng)為低聚原花青素(簡(jiǎn)稱(chēng)OPC)，將五聚體以上的稱(chēng)為高聚原花青素(簡(jiǎn)稱(chēng)PPC)。原花青素是目前國(guó)際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑，同時(shí)還具有良好的抗癌、抗炎、調(diào)節(jié)血壓、保護(hù)視力、軟化血管等作用，是多種功能性食品的有效成分，其來(lái)源廣泛，葡萄籽、銀杏葉、越橘、櫻桃、玫瑰花、松樹(shù)皮中均含有原花青素。由于原花青素的多種健康功能，近年來(lái)從植物中提取的各種原花青素已廣泛應(yīng)用于各類(lèi)保健食品中，其成分鑒別和含量測(cè)定是評(píng)價(jià)保健食品功能的重要指標(biāo)。

目前對(duì)原花青素的檢測(cè)方法主要有分光光度法和高效液相色譜法。

分光光度法的基本原理是利用原花青素在無(wú)機(jī)酸存在和加熱的條件下被降解，產(chǎn)生紅色的花青素，在546nm處有最大吸收，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定原花青素在水解過(guò)程中生成的花青素離子，從而測(cè)定原花青素類(lèi)化合物。此方法具有代表性的是2003版的《保健食品評(píng)價(jià)與技術(shù)規(guī)范》。此法雖能測(cè)得原花青素總量，但方法中規(guī)定的原花青素對(duì)照品過(guò)于籠統(tǒng)(葡萄籽提取物，純度95％)，不易購(gòu)得，準(zhǔn)確度較低，且該方法不能鑒別原花青素成分及來(lái)源。

高效液相色譜法的基本原理是樣品經(jīng)過(guò)前處理后，利用HPLC色譜柱將原花青素中的各類(lèi)組分分離，再用標(biāo)準(zhǔn)品定量。此法不僅可鑒別原花青素的成分及來(lái)源，還可測(cè)定原花青素含量，但由于原花青素的組分黃烷-3-醇類(lèi)的立體異構(gòu)化，原花青素以許多立體異構(gòu)體形式存在，且各聚合體和同聚異構(gòu)體之間極性相近，因此，利用HPLC對(duì)原花青素進(jìn)行分離分析和結(jié)構(gòu)表征非常困難，目前有關(guān)利用HPLC對(duì)原花青素進(jìn)行定性定量的研究也僅限于原花青素單體及低聚體。

由于不同來(lái)源原花青素提取物的產(chǎn)品價(jià)格差異較大，各類(lèi)原花青素產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)較低，且檢測(cè)主要集中于原花青素含量，導(dǎo)致一些商家將低價(jià)格的原花青素產(chǎn)品摻加到高價(jià)格產(chǎn)品中，以次充好，擾亂市場(chǎng)，甚至危害食用者的健康和安全。對(duì)比市場(chǎng)目前幾個(gè)廠家的原料發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量不一，液相色譜圖與SW/T 22013國(guó)際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖的出峰情況差別較大，因此市售越橘提取物存在真假混淆的可能。

目前用于鑒別越橘提取物的方法采用SW/T 2-2013國(guó)際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行分析檢測(cè)，通過(guò)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖的比對(duì)鑒別越橘提取物的真假；原花青素含量的測(cè)定采用《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003版“保健食品中原花青素的測(cè)定”，通過(guò)分光光度法測(cè)定原花青素在水解過(guò)程中生成的花青素離子，從而測(cè)定原花青素類(lèi)化合物。由于越橘提取物的鑒別和其中原花青素含量的測(cè)定方法相互獨(dú)立，步驟繁瑣，且通過(guò)分光光度法測(cè)定原花青素的含量，其測(cè)定結(jié)果易受越橘提取物中所含花青素的影響，造成測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中越橘提取物的鑒別和其中原花青素含量的測(cè)定方法相互獨(dú)立、步驟繁瑣、測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確的技術(shù)問(wèn)題，提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的越橘提取物的鑒別和其中原花青素含量的測(cè)定方法。

本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：采用高效液相色譜法，提供一種越橘提取物的鑒別及其中原花青素含量的測(cè)定方法，包括以下步驟：

(1)供試樣品的制備：稱(chēng)取100mg～150mg供試越橘提取物原料于25mL容量瓶中，加入20mL甲醇，超聲處理20min～30min，冷卻至室溫后，加甲醇定容至刻度，搖勻，以4000r/min離心20～30min后，取上清液備用；

(2)經(jīng)水解供試品溶液的制備：將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后，制得正丁醇與鹽酸的混合溶液，取出18mL正丁醇與鹽酸的混合溶液置于具塞錐瓶中，再加入0.6mL硫酸亞鐵銨溶液和3mL步驟(1)中制備的試樣溶液，混勻，置98℃～100℃沸水浴回流，加熱1h后立即置2℃～10℃冷水中冷卻，再用10％磷酸水溶液定容至25mL容量瓶中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得經(jīng)水解處理的供試品溶液A；

(3)未經(jīng)水解供試品溶液的制備：取18mL步驟(2)制得的正丁醇與鹽酸混合溶液于25mL容量瓶中，加入0.6mL硫酸亞鐵銨溶液和3mL步驟(1)中制備的試樣溶液，用10％磷酸水溶液定容至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得未經(jīng)水解處理的供試品溶液B；

(4)花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精確稱(chēng)取10mg矢車(chē)菊素標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻。從中移取2mL于100mL容量瓶中，用10％磷酸水溶液定容至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C；

(5)HPLC分析檢測(cè)：精密吸取步驟(2)制得的經(jīng)水解處理的供試品溶液A、步驟(3)制得的未經(jīng)水解處理的供試品溶液B、步驟(4)制得的花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C各15μL，依次注入高效液相色譜儀，得到高效液相色譜圖，其中HPLC色譜條件如下：

a)色譜柱：Agilent C18，4.6×250mm，5μm；

b)流動(dòng)相A：水∶甲酸＝91.5∶8.5，(V/V)；流動(dòng)相B：水∶乙腈∶甲醇∶甲酸＝41.5∶22.5∶22.5∶8.5，(V/V/V/V)；

梯度條件為0～35min：7～25％B；35～45min：25～65％B；45～46min：65～100％B；46～50min：100％B；50～51min：100～7％B；51～60min：7％B；

c)檢測(cè)波長(zhǎng)：535nm；

d)流速：1.0mL/min。

(6)越橘提取物真假的鑒別：

將步驟(5)所得的未經(jīng)水解處理的供試品溶液B的高效液相色譜圖與國(guó)際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)SW/T 2-2013中的越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖(圖1所示)進(jìn)行對(duì)比，如供試品為假的越橘提取物，則色譜圖與越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖會(huì)有明顯不同。

(7)供試樣品中花青素含量的計(jì)算：

將步驟(5)所得的經(jīng)水解處理的供試品溶液A、未經(jīng)水解處理的供試品溶液B及花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C的高效液相色譜圖，按外標(biāo)法分別計(jì)算未經(jīng)水解處理的供試品和經(jīng)水解處理的供試品中花青素的含量，二者的差值即為試樣中由原花青素水解為花青素的量，從而得出試樣中原花青素的含量。

供試品中游離花青素含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w₁計(jì)，數(shù)值以％表示，按下述公式計(jì)算：

w₁＝∑w_j

式中：

W_j——供試品中各游離花青素組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，％；

A_j——供試品溶液中各游離花青素組分的峰面積(越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖中峰9，16，18，19，20)

A_std——花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C中矢車(chē)菊素的峰面積；

C_std——花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C中矢車(chē)菊素的濃度，單位為mg/mL；

m₁——供試品的稱(chēng)樣量，單位為mg；

V₁——供試品的定容體積，單位為mL；

P——花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C中矢車(chē)菊素的純度，％；

MW_j——供試品溶液中相應(yīng)的游離花青素組分的分子量；

MW_std——矢車(chē)菊素的分子量。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供一種越橘提取物的鑒別及其中原花青素含量的測(cè)定方法，其有益效果在于：

(1)將越橘提取物的鑒別與原花青素含量測(cè)定的步驟簡(jiǎn)化、結(jié)合，供試越橘提取物經(jīng)簡(jiǎn)單的前處理后采用可靠的HPLC分析檢測(cè)，即可簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的在測(cè)定越橘提取物中原花青素含量的同時(shí)鑒別越橘提取物的真假；

(2)將供試品中的原花青素水解為花青素后，經(jīng)HPLC檢測(cè)花青素含量，將其與未經(jīng)水解處理的供試品中花青素的含量相減，通過(guò)所得差值反映試樣中由原花青素水解為花青素的量，從而得出試樣中原花青素的含量，整個(gè)過(guò)程中無(wú)需考慮試樣中原花青素含有的黃烷醇聚合物的類(lèi)型和聚合度，同時(shí)也可排除試樣中本身含有的花青素對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的干擾；

(3)未經(jīng)水解處理的供試品溶液的HPLC譜圖，除了用于測(cè)定供試品中本身含有的花青素的含量外，還可用于與越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖的對(duì)比，從而鑒別供試越橘提取物的真假，前處理方法簡(jiǎn)單、操作步驟少，分析方法快速、準(zhǔn)確，真?zhèn)舞b別方法容易、明確。

本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于以越橘提取物為原料的保健品、醫(yī)藥品和/或化妝品中越橘提取物的鑒別及其中原花青素含量的測(cè)定。

附圖說(shuō)明

圖1為國(guó)際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)SW/T 2-2013中的越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖；

圖2為實(shí)施例1中未經(jīng)水解處理的供試樣品溶液B的HPLC色譜圖；

圖3為實(shí)施例1中經(jīng)水解處理的供試樣品溶液A的HPLC色譜圖；

圖4為實(shí)施例2中未經(jīng)水解處理的供試樣品溶液B的HPLC色譜圖；

圖5為實(shí)施例2中經(jīng)水解處理的供試樣品溶液A的HPLC色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明中所使用的方法如無(wú)特殊規(guī)定，均為常規(guī)的生產(chǎn)方法；所使用的試劑，如無(wú)特殊規(guī)定，均為常規(guī)的市售產(chǎn)品。

實(shí)施例1

提供一種越橘提取物的鑒別及其中原花青素含量的測(cè)定方法，包括以下步驟：

(1)供試樣品的制備：稱(chēng)取100mg供試越橘提取物原料于25mL容量瓶中，加入20mL甲醇，超聲處理30min，冷卻至室溫后，加甲醇定容至刻度，搖勻，以4000r/min離心20min后，取上清液備用；

(2)經(jīng)水解供試品溶液的制備：將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后，制得正丁醇與鹽酸的混合溶液，取出18mL正丁醇與鹽酸的混合溶液置于具塞錐瓶中，再加入0.6mL硫酸亞鐵銨溶液和3mL步驟(1)中制備的試樣溶液，混勻，置100℃沸水浴回流，加熱1h后立即置4℃冷水中冷卻，再用10％磷酸水溶液定容至25mL容量瓶中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得經(jīng)水解處理的供試品溶液A；

(3)未經(jīng)水解供試品溶液的制備：取18mL步驟(2)制得的正丁醇與鹽酸混合溶液于25mL容量瓶中，加入0.6mL硫酸亞鐵銨溶液和3mL步驟(1)中制備的試樣溶液，用10％磷酸水溶液定容至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得未經(jīng)水解處理的供試品溶液B；

(4)花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精確稱(chēng)取10mg矢車(chē)菊素標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻。從中移取2mL于100mL容量瓶中，用10％磷酸水溶液定容至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C；

(5)HPLC分析檢測(cè)：用微量移液器吸取步驟(2)制得的經(jīng)水解處理的供試品溶液A、步驟(3)制得的未經(jīng)水解處理的供試品溶液B、步驟(4)制得的花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C各15μL，依次注入高效液相色譜儀，得到高效液相色譜圖，其中HPLC色譜條件如下：

a)色譜柱：Agilent C18，4.6×250mm，5μm；

b)流動(dòng)相A：水∶甲酸＝91.5∶8.5，(V/V)；流動(dòng)相B：水∶乙腈∶甲醇∶甲酸＝41.5∶22.5∶22.5∶8.5，(V/V/V/V)；

梯度條件為0～35min：7～25％B；35～45min：25～65％B；45～46min：65～100％B；46～50min：100％B；50～51min：100～7％B；51～60min：7％B；

c)檢測(cè)波長(zhǎng)：535nm；

d)流速：1.0mL/min。

(6)越橘提取物真假的鑒別：

將步驟(5)所得的未經(jīng)水解處理的供試品溶液B的高效液相色譜圖(圖2所示)與國(guó)際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)SW/T 2-2013中的越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖(圖1所示)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)圖2與圖1出峰情況相似，判斷該供試品為真的越橘提取物。

因無(wú)實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，且檢測(cè)設(shè)備系統(tǒng)適應(yīng)性不同，會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間不同，因此供試樣品與越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖的比對(duì)主要考慮出峰個(gè)數(shù)及大致峰面積是否相似。

(7)供試樣品中花青素含量的計(jì)算：

將步驟(5)所得的經(jīng)水解處理的供試品溶液A(圖3所示)、未經(jīng)水解處理的供試品溶液B及花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C的高效液相色譜圖，按外標(biāo)法分別計(jì)算未經(jīng)水解處理的供試品和經(jīng)水解處理的供試品中花青素的含量，二者的差值即為試樣中由原花青素水解為花青素的量，從而得出試樣中原花青素的含量。

供試品中游離花青素含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w1計(jì)，數(shù)值以％表示，按下述公式計(jì)算：

w₁＝∑w_j

式中：

W_j——供試品中各游離花青素組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，％；

A_j——供試品溶液中各游離花青素組分的峰面積(越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖中峰9，16，18，19，20)；

A_std——花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C中矢車(chē)菊素的峰面積；

C_std——花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C中矢車(chē)菊素的濃度，單位為mg/mL；

m₁——供試品的稱(chēng)樣量，單位為mg；

V₁——供試品的定容體積，單位為mL；

P——花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C中矢車(chē)菊素的純度，％；

MW_j——供試品溶液中相應(yīng)的游離花青素組分的分子量；

MW_std——矢車(chē)菊素的分子量。

經(jīng)計(jì)算，未經(jīng)水解處理的供試品溶液中游離花青素的含量為4.7％，經(jīng)水解處理的供試品溶液中游離花青素的含量為53.5％，即試樣中由原花青素水解產(chǎn)生花青素的量為48.8％，從而得出試樣中原花青素的含量為48.8％。

實(shí)施例2

提供一種越橘提取物的鑒別及其中原花青素含量的測(cè)定方法，包括以下步驟：

(1)供試樣品的制備：稱(chēng)取150mg供試越橘提取物原料于25mL容量瓶中，加入20mL甲醇，超聲處理35min，冷卻至室溫后，加甲醇定容至刻度，搖勻，以4000r/min離心30min后，取上清液備用；

(2)經(jīng)水解供試品溶液的制備：將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后，制得正丁醇與鹽酸的混合溶液，取出18mL正丁醇與鹽酸的混合溶液置于具塞錐瓶中，再加入0.6mL硫酸亞鐵銨溶液和3mL步驟(1)中制備的試樣溶液，混勻，置98℃沸水浴回流，加熱1h后立即置8℃冷水中冷卻，再用10％磷酸水溶液定容至25mL容量瓶中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得經(jīng)水解處理的供試品溶液A；

(3)未經(jīng)水解供試品溶液的制備：取18mL步驟(2)制得的正丁醇與鹽酸混合溶液于25mL容量瓶中，加入0.6mL硫酸亞鐵銨溶液和3mL步驟(1)中制備的試樣溶液，用10％磷酸水溶液定容至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得未經(jīng)水解處理的供試品溶液B；

(4)花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：精確稱(chēng)取10mg矢車(chē)菊素標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻。從中移取2mL于100mL容量瓶中，用10％磷酸水溶液定容至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，即得花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C；

(5)HPLC分析檢測(cè)：用微量移液器吸取吸取步驟(2)制得的經(jīng)水解處理的供試品溶液A、步驟(3)制得的未經(jīng)水解處理的供試品溶液B、步驟(4)制得的花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C各15μL，依次注入高效液相色譜儀，得到高效液相色譜圖，其中HPLC色譜條件如下：

a)色譜柱：Agilent C18，4.6×250mm，5μm；

b)流動(dòng)相A：水∶甲酸＝91.5∶8.5，(V/V)；流動(dòng)相B：水∶乙腈∶甲醇∶甲酸＝41.5∶22.5∶22.5∶8.5，(V/V/V/V)；

梯度條件為0～35min：7～25％B；35～45min：25～65％B；45～46min：65～100％B；46～50min：100％B；50～51min：100～7％B；51～60min：7％B；

c)檢測(cè)波長(zhǎng)：535nm；

d)流速：1.0mL/min。

(6)越橘提取物真假的鑒別：

將步驟(5)所得的未經(jīng)水解處理的供試品溶液B的高效液相色譜圖(圖4所示)與國(guó)際商務(wù)標(biāo)準(zhǔn)SW/T2-2013中的越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖(圖1所示)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)圖4與圖1出峰情況明顯不同，判斷該供試品為假的越橘提取物。

因無(wú)實(shí)際標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，且檢測(cè)設(shè)備系統(tǒng)適應(yīng)性不同，會(huì)導(dǎo)致出峰時(shí)間不同，因此供試樣品與越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖的比對(duì)主要考慮出峰個(gè)數(shù)及大致峰面積是否相似。

(7)供試樣品中花青素含量的計(jì)算：

將步驟(5)所得的經(jīng)水解處理的供試品溶液A(圖5所示)、未經(jīng)水解處理的供試品溶液B及花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C的高效液相色譜圖，按外標(biāo)法分別計(jì)算未經(jīng)水解處理的供試品和經(jīng)水解處理的供試品中花青素的含量，二者的差值即為試樣中由原花青素水解為花青素的量，從而得出試樣中原花青素的含量。

供試品中游離花青素含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w₁計(jì)，數(shù)值以％表示，按下述公式計(jì)算：

w₁＝∑w_j

式中：

w_j——供試品中各游離花青素組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，％；

A_j——供試品溶液中各游離花青素組分的峰面積(越橘提取物標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖中峰9，16，18，19，20)；

A_std——花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C中矢車(chē)菊素的峰面積；

C_std——花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C中矢車(chē)菊素的濃度，單位為mg/mL；

m₁——供試品的稱(chēng)樣量，單位為mg；

V₁——供試品的定容體積，單位為mL；

P——花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C中矢車(chē)菊素的純度，％；

MW_j——供試品溶液中相應(yīng)的游離花青素組分的分子量；

MW_std——矢車(chē)菊素的分子量。

經(jīng)計(jì)算，未經(jīng)水解處理的供試品溶液中游離花青素的含量為2.1％，經(jīng)水解處理的供試品溶液中游離花青素的含量為17.3％，即試樣中由原花青素水解產(chǎn)生花青素的量為15.2％，從而得出試樣中原花青素的含量為15.2％。

惟以上所述者，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，當(dāng)不能以此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。