本專利涉及一種測定左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)的方法，具體為一種親水作用色譜測定左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)的方法，屬于藥物分析領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
左卡尼汀，化學(xué)名稱為(R)-3-羧基-2-羥基-N,N,N-三甲基-1-丙胺氫氧化物，是哺乳動物能量代謝中必需的體內(nèi)天然物質(zhì)，其主要功能是協(xié)助細(xì)胞進行脂質(zhì)代謝并產(chǎn)生能量。
E-4-(三甲基銨基)丁-2-烯酸乙酯(簡稱雜質(zhì)A)是左卡尼汀中主要的雜質(zhì)及降解產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)中含有共軛結(jié)構(gòu)，響應(yīng)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于左卡尼汀，需要對其進行單獨定量。
左卡尼汀及其雜質(zhì)A的結(jié)構(gòu)式如下，
左卡尼汀注射液在臨床上應(yīng)用廣泛，是治療心力衰竭的首選藥物，適用于慢性腎衰長期血透病人因繼發(fā)性肉堿缺乏產(chǎn)生的一系列并發(fā)癥狀。目前已被美國藥典、歐洲藥典和我國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載。由于左卡尼汀和左卡尼汀雜質(zhì)A結(jié)構(gòu)類似，不易分離，在國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對左卡尼汀原料和制劑中左卡尼汀雜質(zhì)A進行檢測。歐洲藥典所選用的色譜柱為丙胺基甲基硅烷鍵合硅膠柱，在國內(nèi)尚未找到相應(yīng)的色譜柱，且該標(biāo)準(zhǔn)對左卡尼汀與其雜質(zhì)A的分離度限度要求(≥0.9)較低。美國藥典選用色譜柱為氨基鍵合相色譜柱，方法中樣品分析前對色譜柱進行長達3h柱平衡的需求過于嚴(yán)苛，容易造成柱流失導(dǎo)致保留時間漂移、理論塔板數(shù)降低，該法柱壽命較短，分離度限度要求(≥1.0)也較低。
因此，有必要開發(fā)一種左卡尼汀含量及其雜質(zhì)A測定的新方法，以提高藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和安全性，為該品種的研發(fā)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提出了一種親水作用色譜測定左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)的方法，并進行了方法學(xué)驗證，結(jié)果表明該方法分離度高，測定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于左卡尼汀注射液的有關(guān)物質(zhì)控制，為左卡尼汀注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了參考；同時，本發(fā)明的方法可用于左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)的測定。
具體技術(shù)方案如下，
一種親水作用色譜測定左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)的方法，包括以下步驟，
(1)色譜條件：
色譜柱為Waters XBridge Amide(250mm×4.60mm，3.5μm)，
檢測波長為205nm，
柱溫為30～40℃，
流動相為有機相-水相，其中，所述水相為pH值為5.0的10mM乙酸銨緩沖液，所述有機相為乙腈，所述有機相與水相的體積比為80:20～85:15，所述流動相的流速為1.2mL/min，
進樣量10μL，
檢測器為紫外檢測器；
(2)樣品測定：
精密吸取左卡尼汀注射液適量，加所述流動相稀釋制成1mL含左卡尼汀2mg的溶液，即得供試品溶液；
取左卡尼汀對照品適量，精密稱定，加所述流動相溶解稀釋制成濃度為2mg/mL的溶液，即得左卡尼汀對照溶液；
取左卡尼汀雜質(zhì)A對照品適量，精密稱定，加所述流動相溶解稀釋制成濃度為206μg/mL的溶液，即得雜質(zhì)A對照儲備溶液；
取左卡尼汀對照溶液、雜質(zhì)A對照儲備溶液、供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，按所述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，然后采用外標(biāo)法計算左卡尼汀注射液中左卡尼汀及其雜質(zhì)A的含量；其中，所述雜質(zhì)A為E-4-(三甲基銨基)丁-2-烯酸乙酯。
優(yōu)選，所述色譜條件中所述有機相與水相的體積比為85:15，此時左卡尼汀及其雜質(zhì)A的分離度最優(yōu)，為3.598，但保留時間較長。
優(yōu)選，所述色譜條件中柱溫為40℃，柱溫較高時左卡尼汀及其雜質(zhì)A具有良好的分離度。
優(yōu)選，所述流動相平衡前，使用5倍柱體積不含鹽的流動相進行平衡，防止鹽在色譜柱及系統(tǒng)中析出。
上述方法可用于左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)測定的用途，具體為用于左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)A測定的用途。
親水作用色譜(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)是用來分離極性、親水性物質(zhì)的一種高選擇性的液相色譜分離方式。本發(fā)明選用的色譜柱為XBridge Amide色譜柱，使用了化學(xué)穩(wěn)定的、三鍵鍵合式的酰胺官能團，其選擇性與氨基柱相近，且基于BEH(亞乙基橋雜化顆粒)技術(shù)，色譜柱耐受性更強(pH2-11)，相對于氨基鍵合相的穩(wěn)定性更高(柱流失減少)。左卡尼汀屬于氨基酸衍生物，其分子內(nèi)含有季銨結(jié)構(gòu)，同時也有內(nèi)鹽結(jié)構(gòu)，親水。故本發(fā)明的創(chuàng)新在于采用親水作用色譜建立左卡尼汀含量及其雜質(zhì)A的測定方法，同時也提供了該方法的用途。
有益效果，
本研究選定的方法和色譜條件使左卡尼汀與雜質(zhì)A的分離度大于2.0，達到了完全分離的要求。
相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提出的左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)A測定方法的專屬性、精密度、線性與范圍、準(zhǔn)確度均符合要求，能夠準(zhǔn)確地測定左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)A。該方法克服了國外藥典中色譜柱不易得、左卡尼汀與雜質(zhì)A分離度不好等問題，可為左卡尼汀注射液質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供可靠手段。
附圖說明
圖1為左卡尼汀及雜質(zhì)A混合對照溶液圖譜；
其中1為左卡尼汀，2為雜質(zhì)A。
具體實施方式
以下實施例有助于對本發(fā)明的進一步了解，但本發(fā)明并非限于這些內(nèi)容。
一種親水作用色譜測定左卡尼汀注射液含量及雜質(zhì)的方法。
1材料準(zhǔn)備
島津LC-20A高效液相色譜儀系統(tǒng)(包括LC-20AT泵；DGU-20A脫氣機；SIL-20A自動進樣器；CTO-10ASvp柱溫箱；SPD-20A紫外檢測器；Lab solution色譜工作站)；Waters XBridge Amide色譜柱(4.6mm×250mm，3.5μm)；萬分之一電子天平(AR1140，Ohaus Corp.Brook，NJ，USA)；十萬分之一電子天平(MS105Du型，METTLER TOLEDO)；電子pH計(pH Meter PHS-3C，上海精科實業(yè)有限公司)；超聲波清洗器(SK250HP，無錫建儀實驗器材有限公司)。
左卡尼汀對照品由中國食品藥品檢定研究院提供，批號：101041-201503；左卡尼汀雜質(zhì)A對照品由歐洲藥品質(zhì)量管理局提供，批號：003K19；左卡尼汀注射液：東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：8150407、8150527，規(guī)格：5mL:1g；乙腈為色譜純，冰醋酸、乙酸銨為分析純，水為哇哈哈純凈水。
2具體步驟及方法學(xué)驗證
2.1溶液的制備
左卡尼汀對照溶液：取左卡尼汀對照品適量，精密稱定，加流動相溶解稀釋制成濃度為2mg/mL的溶液，即得。
雜質(zhì)A對照儲備溶液：取左卡尼汀雜質(zhì)A對照品適量，精密稱定，加流動相溶解稀釋制成濃度為206μg/mL的溶液，即得。
供試品溶液：精密吸取左卡尼汀注射液適量，加流動相稀釋制成每1mL約含左卡尼汀2mg的溶液，即得。
系統(tǒng)適用性試驗溶液：取左卡尼汀對照品和左卡尼汀雜質(zhì)A對照品適量，用流動相溶解并制成每1mL約含左卡尼汀2mg和左卡尼汀雜質(zhì)A0.01mg的混合溶液，即得。
2.2色譜條件
色譜柱為Waters XBridge Amide(250mm×4.60mm，3.5μm)，柱溫40℃，流動相為10mM乙酸銨緩沖液(pH5.0)-乙腈(15:85)，流速1.2mL/min，檢測波長205nm，進樣量10μL。
取“2.2”項下左卡尼汀原料藥供試品在紫外可見分光光度計掃描波長，由吸收譜圖可知其在短波長處有吸收峰，為排除溶劑峰的影響，采用205nm為檢測波長。
緩沖液-乙腈(20:80)和(15:85)均可為流動相，其中，緩沖液為10mM 乙酸銨緩沖液(pH5.0)，左卡尼汀和雜質(zhì)A有良好的分離度，雜質(zhì)A不影響左卡尼汀含量的測定；本例中采用有機相與水相(緩沖液-乙腈)的體積比為85:15，此時左卡尼汀及其雜質(zhì)A的分離度為3.598，具有更明顯的分離效果。但是從節(jié)約時間及減少流動相的使用角度出發(fā)，也可以采用緩沖液-乙腈(20:80)為流動相進行含量測定。
提高柱溫能使左卡尼汀與雜質(zhì)A的分離度增大，保留時間也有所減小，為了能更好的對左卡尼汀進行定量測定，節(jié)約時間以及流動相，所以采用色譜柱柱溫為40℃進行測定。
2.3系統(tǒng)適用性
精密吸取左卡尼汀及雜質(zhì)A混合對照溶液，按“2.2”項下條件進樣分析，結(jié)果見圖1。理論塔板數(shù)以左卡尼汀峰計算不小于10000，左卡尼汀與雜質(zhì)A分離度為3.598，分離度良好。
2.4線性關(guān)系考察
分別精密吸取左卡尼汀及雜質(zhì)A的對照品儲備液，加流動相制成不同濃度的系列對照品溶液，精密吸取10μL注入高效液相色譜儀，以各自的峰面積A對其濃度C進行線性回歸，左卡尼汀回歸方程為y＝429735x+6869，r＝0.99表明左卡尼汀在0.53～3.16mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。雜質(zhì)A回歸方程y＝22655x-3519，r＝1.0，表明雜質(zhì)A在2.06～82.4μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.5檢測限與定量限
將“2.4”項下左卡尼汀及雜質(zhì)A對照品最低濃度點用流動相逐步稀釋成不同濃度，注入液相色譜儀，分別以信噪比3:1和10:1為標(biāo)準(zhǔn)測定各成分的檢測限和定量限。得左卡尼汀檢測限1.70μg/mL、定量限5.20μg/mL；雜質(zhì)A檢測限40.8ng/mL、定量限81.6ng/mL。
2.6精密度
分別精密吸取左卡尼汀及雜質(zhì)A對照品溶液，按“2.2”項下條件連續(xù)進樣6次，進行精密度試驗。結(jié)果左卡尼汀峰面積的RSD(n＝6)為0.12％，雜質(zhì)A峰面積的RSD(n＝6)為0.55％，表明儀器的精密度良好。
2.7重復(fù)性
精密量取左卡尼汀注射液(批號8150527)適量，加流動相稀釋制成每1mL 中約含左卡尼汀2mg的溶液，平行制備6份。按“2.2”項下條件進樣分析，記錄色譜圖，6個樣品左卡尼汀及其雜質(zhì)A測定結(jié)果的RSD分別為0.68％，RSD為1.20％，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。
2.8穩(wěn)定性
取“2.7”項下的供試品溶液，室溫放置，按“2.2”項下色譜條件于0、2、4、6、8h進樣測定，結(jié)果左卡尼汀峰面積的RSD為0.42％。表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。
2.9加樣回收率
2.9.1左卡尼汀加樣回收率
在一定量的已知含量的樣品中，按80％、100％、120％濃度水平分別精密加入左卡尼汀0.8，1.0，1.2mL各三份，加流動相稀釋定容，搖勻，作為供試品溶液。取“2.4”項下2.11mg/mL左卡尼汀對照品作為對照品溶液。精密吸取供試品溶液和對照品溶液按“2.2”項下色譜條件進樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計算，左卡尼汀平均回收率為100.2％(n＝9)，RSD＝0.69％，結(jié)果見表1，說明該方法準(zhǔn)確度良好。
表1左卡尼汀加樣回收率結(jié)果
2.9.2雜質(zhì)A加樣回收率
在一定量的已知雜質(zhì)A含量的樣品中，按80％、100％、120％濃度水平分別精密加入左卡尼汀雜質(zhì)A對照品儲備溶液0.8，1.0，1.2mL各三份，加流動相稀釋定容，搖勻，作為供試品溶液。取“2.4”項下41.2μg/mL雜質(zhì)A對照品溶液作為對照品溶液。精密吸取供試品溶液和對照品溶液按“2.2”項下色譜條件進樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計算，雜質(zhì)A平均回收率為101.0％(n＝9)，RSD為0.72％，結(jié)果見表2，說明該方法準(zhǔn)確度良好。
表2雜質(zhì)A加樣回收率結(jié)果
2.10樣品測定
精密吸取左卡尼汀注射液2個批次樣品，每個批號平行制備三份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液與對照品溶液，取左卡尼汀對照溶液、雜質(zhì)A對照儲備溶液、供試品溶液，分別注入高效液相色譜儀，按所述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，然后采用外標(biāo)法計算左卡尼汀注射液中左卡尼汀及其雜質(zhì)A的含量，結(jié)果見表3。
表3樣品測定數(shù)據(jù)
在例中所用流動相中含緩沖鹽，為防止鹽在色譜柱及系統(tǒng)中析出，在流動相平衡前，需使用5倍柱體積不含鹽的流動相進行平衡。有機相與水相的比例是物質(zhì)保留及有效分離的關(guān)鍵。同時提高柱溫可明顯提高分離度。本例中，左卡尼汀及雜質(zhì)A的分離度可達3.0以上，而在美國藥典中，兩者所規(guī)定的分離度為1.0。
以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種等同變換，這些等同變換均屬于本發(fā)明的保護范圍。