一種HPLC結(jié)合UPLC-MS檢測(cè)PQQ對(duì)乳酸作用的方法，屬于生物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的能量供應(yīng)主要依賴(lài)外周血中的葡萄糖。血腦屏障中的主要成份星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取葡萄糖，經(jīng)糖酵解產(chǎn)生乳酸釋放至細(xì)胞外液，細(xì)胞外液反映神經(jīng)細(xì)胞的生存環(huán)境。乳酸作為糖酵解的代謝產(chǎn)物，一直被認(rèn)為對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有損害作用。因此，乳酸在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用一直為科學(xué)家所重視。已有報(bào)道急性腦外傷病人腦脊液乳酸含量升高；正常人腦脊液乳酸含量很低，報(bào)道發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤中乳酸含量明顯升高；血清乳酸已作為腦損傷的生物標(biāo)志物。美國(guó)科學(xué)院院刊PANS也報(bào)道了乳酸濃度的上升與衰老有關(guān)，這可能是線粒體DNA機(jī)能障礙引發(fā)小鼠大腦的代謝變化，由此改變控制乳酸形成的特定基因的表達(dá)，這種變化導(dǎo)致了大腦乳酸濃度增加。因此，檢測(cè)乳酸濃度對(duì)探測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與衰老有關(guān)的疾病具有重要意義，加速腦內(nèi)乳酸代謝、降低乳酸的含量維持乳酸低濃度是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)重要手段。吡咯并喹呤醌(PQQ)是一種氧化還原酶輔基，其結(jié)構(gòu)式為：其能夠減少神經(jīng)細(xì)胞死亡，在腦中能夠促進(jìn)神經(jīng)因子的產(chǎn)生對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。PQQ在神經(jīng)系統(tǒng)方面的重要功能可能與其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，具有多羰基和多羧基的官能團(tuán)，能夠與多種活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。比如能夠與多種氨基酸發(fā)生反應(yīng)因而對(duì)氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用。而是否對(duì)與衰老基因有關(guān)的重要因素乳酸具有調(diào)節(jié)作用，至今無(wú)相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明采用UPLC方法研究了PQQ與乳酸的反應(yīng)，優(yōu)化了分離條件，使PQQ與多個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物達(dá)到分離。并采用UPLC-MS對(duì)其反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析。以往的研究顯示PQQ結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)羰基與氨基酸參與縮合反應(yīng)生成惡唑類(lèi)化合物，本文首次研究PQQ與乳酸的反應(yīng)行為，在反應(yīng)液中發(fā)現(xiàn)了3種產(chǎn)物，其準(zhǔn)分子離子【M+H】+分別為403，475和547。通過(guò)產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子初步分析PQQ分別與一分子乳酸、二分子乳酸、三分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa1、PQQLa2及PQQLa3。通過(guò)不同反應(yīng)時(shí)間各生成物的峰面積發(fā)現(xiàn)主要以一分子酯化產(chǎn)物PQQLa1存在，酯化后的產(chǎn)物透過(guò)血腦屏障進(jìn)入細(xì)胞外液，由此降低了細(xì)胞外液乳酸的含量。對(duì)研究PQQ在神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，尤其與衰老有關(guān)的疾病研究方面具有極為重要的研究?jī)r(jià)值。乳酸含量的測(cè)定有比色法、EDTA滴定法、HPLC分析法、酶法、GC分析法，比色法及EDTA方法簡(jiǎn)單、快速，但靈敏度及精密度差；酶法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻而且費(fèi)用高；氣相色譜法中乳酸易發(fā)生分解，影響其測(cè)定準(zhǔn)確性。腦組織中乳酸含量極低，乳酸的紫外吸收極低，文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC法大多采用210nm檢測(cè)，干擾因素較多，報(bào)道的最低檢測(cè)濃度5μM，對(duì)于腦組織生物樣本檢測(cè)靈敏度太低。本發(fā)明采用熒光增強(qiáng)試劑NBD-COCl（4-(N-氯甲酰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑），與乳酸反應(yīng)生成響應(yīng)值較大的熒光物質(zhì)，測(cè)定了PQQ對(duì)D-gal（D-半乳糖）誘導(dǎo)大鼠衰老模型生物樣本中乳酸含量的影響，最低檢測(cè)濃度達(dá)10nM。測(cè)定結(jié)果顯示PQQ能降低因D-gal引起的衰老模型大鼠血漿、腦組織及細(xì)胞外液乳酸含量的升高，對(duì)PQQ抗衰老的機(jī)理研究具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種HPLC結(jié)合UPLC-MS檢測(cè)PQQ對(duì)乳酸作用的方法，對(duì)PQQ抗衰老的機(jī)理研究具有重要意義。本發(fā)明的技術(shù)方案：一種HPLC結(jié)合UPLC-MS檢測(cè)PQQ對(duì)乳酸作用的方法，步驟為：（1）UPLC分析條件ACQUiTYUPLC@BEHC18column(2.1×100mm,1.7μm)，流動(dòng)相A：H2O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95B/A洗脫5min，20min梯度洗脫至75/25B/A。檢測(cè)波長(zhǎng)322nm。（2）波長(zhǎng)的確定稱(chēng)取一定量的PQQ及乳酸，分別用0.1M鹽酸溶液溶解，配制成1mM的PQQ溶液及1mM的乳酸溶液，按v/v為1︰5混合，避光，于37℃水浴孵育24h，冰浴終止反應(yīng)。紫外掃描圖顯示322nm紫外吸收較高；選擇322nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。（3）流動(dòng)相組分對(duì)分離的影響在流動(dòng)相中分別添加質(zhì)量百分為：0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3%TFA（三氟乙酸）試驗(yàn)，當(dāng)TFA含量為0.2%時(shí)，流動(dòng)相A：H2O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95B/A洗脫5min，20min梯度洗脫至75/25B/A。各組份峰型對(duì)稱(chēng)性較好，PQQ與3種生成物都能達(dá)到基線分離。（4）UPLC-MS對(duì)PQQ與乳酸的反應(yīng)產(chǎn)物的定性分析采用ACQUiTYUPLC@BEHC18column(2.1×100mm,1.7μm)，質(zhì)譜檢測(cè)器SQDetector2及PDA檢測(cè)器。優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)：脫溶劑氣溫度(DesolvationTemp)：400℃；脫溶劑氣流量(DesolvationGasFlow)：600L/h；離子源溫度（sourcetemperature）：110℃；錐孔氣流量(ConeGasFlow)：50L/h；毛細(xì)管電壓（capillaryvoltage）：3000V；錐孔電壓（conevoltage）：30V。質(zhì)譜采用電噴霧正離子模式(ESI+)，質(zhì)量掃描范圍為m/z50～800。流動(dòng)相A：H2O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95B/A洗脫5min，20min梯度洗脫至75/25B/A。進(jìn)樣10μL。反應(yīng)液的ESI-MS譜圖中，主要離子為m/z403,475,547三個(gè)峰。通過(guò)產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子初步分析PQQ分別與一分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa1，403，M+1峰，330，M-72（乳酸）峰；與二分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa2，475，M+1峰，402，M-72（乳酸）峰；與三分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa3，547，M+1峰。質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖3、圖4、圖5。PQQLa3含量較低，圖5b為圖5a局部放大圖。其化學(xué)反應(yīng)式見(jiàn)圖6。從三種產(chǎn)物的積分面積比值PQQLa1/PQQLa2/PQQLa3為9.6/1.6/1。三種產(chǎn)物的積分面積見(jiàn)圖7。（5）3種產(chǎn)物峰面積（AUS）隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線將PQQ與乳酸分別配制以摩爾比為1︰5混合反應(yīng)，避光，充分?jǐn)嚢?，置?7℃水浴孵育，于4、8、16、24、32、48h各時(shí)間點(diǎn)抽取反應(yīng)液，甲醇稀釋直接進(jìn)樣進(jìn)行UPLC-MS分析。采集【M+1】+分別為403，475，547的積分面積AUS，用AUS對(duì)時(shí)間作圖，見(jiàn)圖8。反應(yīng)24h后基本處于穩(wěn)定。（6）PQQ對(duì)D-gal（D-半乳糖）誘導(dǎo)大鼠衰老模型生物樣本中乳酸含量的影響測(cè)定腦組織中La含量極低，La的紫外吸收極低，文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC法大多采用210nm檢測(cè)，干擾因素較多，報(bào)道的最低檢測(cè)濃度5μM，對(duì)于腦組織生物樣本檢測(cè)靈敏度太低。我們采用熒光增強(qiáng)試劑NBD-COCl（4-(N-氯甲酰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑）反應(yīng)生成響應(yīng)值較大的熒光物質(zhì)（衍生反應(yīng)見(jiàn)圖9），來(lái)檢測(cè)生物樣本中含量極低的La，最低檢測(cè)濃度達(dá)10nM。色譜條件：美國(guó)WATERS600高效液相色譜儀，2175熒光檢測(cè)器，色譜柱AmethystC18-H（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相15%乙腈-H2O含0.05%TFA，流速1ml/min，熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)483nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm。血漿或細(xì)胞外液處理：10μL血漿（細(xì)胞外液）+10μL去離子水+180μL甲醇，充分混勻，15000rpm/4℃離心5min，10μL上清液冷凍干燥，干燥殘?jiān)芙庠?0μL去離子水中直接用于衍生反應(yīng)。腦組織處理：腦組織稱(chēng)重取0.1g，加入0.9mL預(yù)冷的生理鹽水，電動(dòng)勻漿，15000rpm/4℃離心15min，取10μL上清液+10μL去離子水+180μL甲醇，充分混勻，15000rpm/4℃離心5min，10μL上清液冷凍干燥，干燥殘?jiān)芙庠?0μL去離子水中直接用于衍生反應(yīng)。衍生反應(yīng)：10μL樣本+10μL50mMN-甲基嗎啉+5μL20mMNBD-COCl，60℃反應(yīng)15min。加150μL2%TFA終止反應(yīng)，取10μL直接進(jìn)行HPLC分析。線性關(guān)系與檢測(cè)限測(cè)定：精密稱(chēng)取乳酸對(duì)照品，加去離子水配成0.1，0.5，1，5，10，20，30，40，50mmol/L的對(duì)照溶液，按上述衍生反應(yīng)方法反應(yīng)后進(jìn)行HPLC分析。所得積分面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得方程式y(tǒng)=1602534x+18831，R2=0.9999。在0.1～50mmol/L范圍內(nèi)線性良好（圖15）。生物樣本中乳酸的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。最小檢出濃度為10nM（S/N≥3）。X為濃度mmol/L，Y為峰面積。重復(fù)性和精確度的測(cè)定：在確定的色譜條件下于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，根據(jù)峰面積計(jì)算所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為3.8%(n=6)，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為0.84%（n=6）。表1乳酸濃度的測(cè)定結(jié)果組別血漿(mmol/L)細(xì)胞外液腦組織(mmol/g)正常組1.56±0.854.82±0.980.38±0.02D-gal衰老模型組3.87±0.28*7.25±1.32*0.66±0.05*D-gal+PQQ給藥組2.05±0.06﹟5.03±1.18﹟0.42±0.09﹟*p<0.01與對(duì)照組相比,﹟p<0.01與模型組相比發(fā)現(xiàn)正常組細(xì)胞外液乳酸濃度是血漿的3.08倍。D-gal誘導(dǎo)衰老模型鼠血漿、腦組織和細(xì)胞外液中乳酸含量顯著升高，PQQ給藥組乳酸含量顯著下降?？赡苡捎赑QQ與乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)生成PQQLa，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點(diǎn)提供了新的理論依據(jù)。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用UPLC方法研究了PQQ與乳酸的反應(yīng)，優(yōu)化了分離條件，使PQQ與多個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物達(dá)到分離。并采用UPLC-MS對(duì)其反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行了定性分析。本發(fā)明首次研究PQQ與乳酸的反應(yīng)行為，在反應(yīng)液中發(fā)現(xiàn)了3種產(chǎn)物，其準(zhǔn)分子離子【M+H】+分別為403，475及547。通過(guò)產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子初步分析PQQ分別與一分子乳酸、二分子乳酸、三分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa1、PQQLa2及PQQLa3。通過(guò)不同反應(yīng)時(shí)間各生成物的峰面積發(fā)現(xiàn)主要以一分子酯化產(chǎn)物PQQLa1存在，酯化后的產(chǎn)物透過(guò)血腦屏障進(jìn)入細(xì)胞外液，由此降低了細(xì)胞外液乳酸的含量。對(duì)研究PQQ在神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，尤其與衰老有關(guān)的疾病機(jī)理研究方面具有極為重要的研究?jī)r(jià)值。附圖說(shuō)明圖1PQQ與乳酸產(chǎn)物的紫外掃描圖譜。圖2PQQ與乳酸反應(yīng)液的色譜圖。圖3產(chǎn)物PQQLa1質(zhì)譜圖。圖4產(chǎn)物PQQLa2質(zhì)譜圖。圖5產(chǎn)物PQQLa3質(zhì)譜圖，圖5b為圖5a局部放大圖。圖6PQQ與乳酸化學(xué)反應(yīng)式。圖7三種產(chǎn)物PQQLa1/PQQLa2/PQQLa3的積分面積圖譜。圖8三種產(chǎn)物PQQLa1/PQQLa2/PQQLa3的積分面積隨反應(yīng)時(shí)間的變化圖。圖9乳酸衍生反應(yīng)。圖10空白衍生試劑HPLC色譜圖。圖11乳酸對(duì)照衍生反應(yīng)后的HPLC色譜圖。圖12血漿衍生反應(yīng)HPLC色譜圖。圖13腦組織衍生反應(yīng)HPLC色譜圖。圖14細(xì)胞外液衍生反應(yīng)HPLC色譜圖。圖15標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種HPLC結(jié)合UPLC-MS檢測(cè)PQQ對(duì)乳酸作用的方法，步驟為：（1）UPLC分析條件：ACQUiTYUPLC@BEHC18column(2.1×100mm,1.7μm)，流動(dòng)相A：H2O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95B/A洗脫5min，20min梯度洗脫至75/25B/A；檢測(cè)波長(zhǎng)322nm；（2）波長(zhǎng)的確定稱(chēng)取一定量的PQQ，乳酸，分別用0.1M鹽酸溶液溶解，配制成1mM的PQQ溶液和乳酸溶液，按v/v為1︰5混合，避光，于37℃水浴孵育24h，冰浴終止反應(yīng)；紫外掃描圖顯示322nm紫外吸收較高；選擇322nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；（3）流動(dòng)相組分對(duì)分離的影響在流動(dòng)相中分別添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3%TFA（三氟乙酸）試驗(yàn)，當(dāng)TFA含量為0.2%時(shí)，流動(dòng)相A：H2O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95B/A洗脫5min，20min梯度洗脫至75/25B/A；各組份峰型對(duì)稱(chēng)性較好，PQQ與3種生成物都能達(dá)到基線分離；（4）UPLC-MS對(duì)PQQ與乳酸的反應(yīng)產(chǎn)物的定性分析采用ACQUiTYUPLC@BEHC18column(2.1×100mm,1.7um)，質(zhì)譜檢測(cè)器SQDetector2及PDA檢測(cè)器，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)：脫溶劑氣溫度(DesolvationTemp)：400℃；脫溶劑氣流量(DesolvationGasFlow)：600L/h；離子源溫度（sourcetemperature）：110℃；錐孔氣流量(ConeGasFlow)：50L/h；毛細(xì)管電壓（capillaryvoltage）：3000V；錐孔電壓（conevoltage）：30V；質(zhì)譜采用電噴霧正離子模式(ESI+)，質(zhì)量掃描范圍為m/z50～800。流動(dòng)相A：H2O+0.2%TFA，B：甲醇；5/95B/A洗脫5min，20min梯度洗脫至75/25B/A，進(jìn)樣10μL，反應(yīng)液的ESI-MS譜圖中，主要離子為m/z403,475,547三個(gè)峰；通過(guò)產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰及碎片離子初步分析PQQ分別與一分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa1，403，M+1峰；330，M-72（乳酸）峰；與二分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa2，475，M+1峰，402，M-72（乳酸）峰；與三分子乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)得產(chǎn)物PQQLa3，547，M+1峰；質(zhì)譜圖分別見(jiàn)圖3、圖4、圖5。PQQLa3含量較低，圖5b為圖5a局部放大圖。其化學(xué)反應(yīng)式見(jiàn)圖6。從三種產(chǎn)物的積分面積比值PQQLa1/PQQLa2/PQQLa3為9.6/1.6/1；三種產(chǎn)物的積分面積見(jiàn)圖7。（5）3種產(chǎn)物峰面積（AUS）隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線將PQQ與乳酸分別配制摩爾比為1︰5混合反應(yīng)，避光，充分?jǐn)嚢?，置?7℃水浴孵育，于4、8、15、24、32、48h各時(shí)間點(diǎn)抽取反應(yīng)液，甲醇稀釋直接進(jìn)樣進(jìn)行UPLC-MS分析；采集【M+1】+分別為403，475，547的積分面積AUS，用AUS對(duì)時(shí)間作圖，見(jiàn)圖8；反應(yīng)24h后基本處于穩(wěn)定；（6）PQQ對(duì)D-gal（D-半乳糖）誘導(dǎo)大鼠衰老模型生物樣本中乳酸含量的影響測(cè)定采用熒光增強(qiáng)試劑NBD-COCl（4-(N-氯甲酰甲基-N-甲氨基)-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑）反應(yīng)生成響應(yīng)值較大的熒光物質(zhì)（衍生反應(yīng)見(jiàn)圖9），來(lái)檢測(cè)生物樣本中含量極低的La，最低檢測(cè)濃度達(dá)10nM。色譜條件：美國(guó)WATERS600高效液相色譜儀，2175熒光檢測(cè)器，色譜柱AmethystC18-H（4.6×250mm，5μm），流動(dòng)相15%乙腈-H2O含0.05%TFA，流速1ml/min，熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)483nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm。血漿或細(xì)胞外液處理：10μL血漿（細(xì)胞外液）+10μL去離子水+180μL甲醇，充分混勻，15000rpm/4℃離心5min，10μL上清液冷凍干燥，干燥殘?jiān)芙庠?0μL去離子水中直接用于衍生反應(yīng)。腦組織處理：腦組織稱(chēng)重取0.1g，加入0.9mL預(yù)冷的生理鹽水，電動(dòng)勻漿，15000rpm/4℃離心15min，取10μL上清液+10μL去離子水+180μL甲醇，充分混勻，15000rpm/4℃離心5min，10μL上清液冷凍干燥，干燥殘?jiān)芙庠?0μL去離子水中直接用于衍生反應(yīng)。衍生反應(yīng)：10μL樣本+10μL50mMN-甲基嗎啉+5μL20mMNBD-COCl，60℃反應(yīng)15min。加150μL2%TFA終止反應(yīng)，取10μL直接進(jìn)行HPLC分析。線性關(guān)系與檢測(cè)限測(cè)定：精密稱(chēng)取乳酸對(duì)照品，加去離子水配成0.1，0.5，1，5，10，20，30，40，50mmol/L的對(duì)照溶液，按上述衍生反應(yīng)方法反應(yīng)后進(jìn)行HPLC分析。所得積分面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸，得方程式y(tǒng)=1602534+18831，R2=0.9999。在0.1～50mmol/L范圍內(nèi)線性良好（圖15）。生物樣本中乳酸的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。最小檢出濃度為10nM（S/N≥3）。X為濃度mmol/L，Y為峰面積。重復(fù)性和精確度的測(cè)定：在確定的色譜條件下于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定，根據(jù)峰面積計(jì)算所得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為3.8%(n=6)，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差約為0.84%（n=6）。生物樣本中乳酸含量的測(cè)定：各組樣本按上述方法處理后按上述反應(yīng)條件衍生反應(yīng)后進(jìn)行HPLC分析，外標(biāo)法計(jì)算得到乳酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。表1乳酸濃度的測(cè)定結(jié)果組別血漿(mmol/L)細(xì)胞外液腦組織(mmol/g)正常組1.56±0.854.82±0.980.38±0.02D-gal衰老模型組3.87±0.28*7.25±1.32*0.66±0.05*D-gal+PQQ給藥組2.05±0.06﹟5.03±1.18﹟0.42±0.09﹟*p<0.01與對(duì)照組相比,﹟p<0.01與模型組相比發(fā)現(xiàn)正常組細(xì)胞外液乳酸濃度是血漿的3.08倍。D-gal誘導(dǎo)衰老模型鼠血漿、腦組織和細(xì)胞外液中乳酸含量顯著升高，PQQ給藥組乳酸含量顯著下降?？赡苡捎赑QQ與乳酸發(fā)生酯化反應(yīng)生成PQQLa，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點(diǎn)提供了新的理論依據(jù)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3