本發(fā)明涉及動物血液復(fù)雜基質(zhì)中香豆素的測定方法，具體是一種基于超高效液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap HRMS）的小鼠血液中香豆素及其代謝物的測定方法，該方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，通過超高效液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap HRMS）對小鼠血液中香豆素及其代謝物進行檢測，以此為基礎(chǔ)用香豆素為探針?biāo)幬镌u估細胞色素CYP2A5酶活性的變化。

背景技術(shù)：

細胞色素P450（cytochromeP450，CYP）是在動植物、微生物的各組織中廣泛存在的一類含有鐵卟啉輔基的b族細胞色素，參與多種內(nèi)、外源性物質(zhì)的代謝，在藥理學(xué)和毒理學(xué)方面具有十分重要的地位。通過添加抑制劑或誘導(dǎo)劑使關(guān)鍵代謝酶的活性發(fā)生改變，進而測定其特異性底物的代謝產(chǎn)物生成量變化，可以更直觀的評估其活性。細胞色素酶P450 2A6(cytochrome P450 2A6，CYP2A6)是人體重要的藥物代謝酶，約占人類CYP450酶系統(tǒng)的5%，參與環(huán)磷酰胺、丙戊酸鈉、咖啡因及尼古丁等代謝，能將煙草中大量的亞硝胺致癌原如N-亞硝基二甲胺、NNK、NNN等激活為強致癌物。小鼠CYP2A5是與人類 CYP2A6起源相同的代謝酶，其氨基酸序列與CYP2A6有84%同源，結(jié)構(gòu)和功能極為相似。香豆素是CYP2A5的特異性底物，能被CYP2A5代謝為7-羥基香豆素排出。將香豆素用作CYP2A5的探針底物，通過測定其特異性代謝產(chǎn)物7-羥基香豆素含量來評價其酶活性，是公認的CYP2A5酶活性檢測方法。

文獻報道過多種香豆素類化合物的檢測方法，如傳統(tǒng)檢測方法熒光分光光度計法（Miles J S, McLAREN A W, Forrester L M, et al. Identification of the human liver cytochrome P-450 responsible for coumarin 7-hydroxylase activity[J]. Biochemical Journal, 1990, 267(2): 365-371.），該方法利用香豆素在香豆素羥基化酶即CYP2A5酶的催化下，轉(zhuǎn)化為羥基香豆素后熒光峰值的變化來定性分析，利用熒光強度值來定量分析，但是該方法專一性靈敏度較低，穩(wěn)定性較差，無法給出加合物的結(jié)構(gòu)信息；隨后的高效液相色譜（HPLC）法（Lake B G， Evans J G， Chapuis F， et al． Studies on the disposition， metabolism and hepatotoxicity of coumarin in the rat and Syrian hamster[J]. Food Chem Toxicol, 2002, 40(6): 809-823）、高效液相色譜-紫外檢測器（HPLC-UV）（Sotaniemi E A, Rautio A, Backstrom M, et al. CYP3A4 and CYP2A6 activities marked by the metabolism of lignocaine and coumarin in patients with liver and kidney diseases and epileptic patients[J]. British journal of clinical pharmacology, 1995, 39(1): 71-76.）以及高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-RF）（王二豪，郭延壘，張有金，石亮，張遠冬，王應(yīng)雄，楊竹，于超. HPLC-RF測定小鼠肝微粒體中CYP2A5的酶活性 [J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2013, 29(9): 692-624.），雖然在引入高效液相色譜之后在檢測靈敏度方面有了很大提高，但是同樣不能給出待測物的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)信息，專一性也沒有得到改善；超高效液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC-Orbitrap HRMS）具有檢測限低、選擇性好、靈敏度高、穩(wěn)定性強等優(yōu)點，近年來已多應(yīng)用于藥物分析及復(fù)雜生物基質(zhì)檢測領(lǐng)域（安卓玲, 史忱, 趙瑞, 等. 基于超高效液相色譜-質(zhì)譜的藥物性肝損傷患者血清代謝組學(xué)研究[J]. 分析化學(xué), 2015, 43(9): 1408-1414.），但是對于檢測小鼠體內(nèi)香豆素及其代謝物方面還沒有研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而采用UPLC-Orbitrap HRMS法建立的一種簡單、快速、靈敏度高的測定小鼠血液中香豆素及其代謝物的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種基于UPLC-Orbitrap HRMS的小鼠血液中香豆素及其代謝物的測定方法，通過樣品的采集及前處理、收集血液樣品于離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液，沉淀蛋白混勻離心后，采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析檢測小鼠血液中香豆素及其代謝物，根據(jù)試驗結(jié)果測定香豆素及其代謝物并繪制相應(yīng)的時間-濃度曲線進行藥代動力學(xué)分析。

本發(fā)明包括以下具體步驟：

a、樣品采集：小鼠通過腹腔注射CYP2A5探針?biāo)幬锵愣顾厝芤汉笱郾{取血約0.5 mL，置于1.5 mL離心管中，立即于4 ℃、6 000 rpm下離心10 min；

b、樣品前處理：取100 μL上清血清至1.5 mL離心管內(nèi)，加入20 μL濃度為100 ng/mL的4-甲基傘形酮溶液和280 μL乙腈，渦旋30 s以充分混勻，超聲10 min，于4 ℃、12 000 rpm下離心10 min，取上清液，用0.22 μm有機相針式濾器過濾，裝入色譜瓶中待測；

c、標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：使用甲醇溶解、乙腈定容，配制一系列濃度的香豆素、7-羥基香豆素的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

d、定量分析：使用超高效液相色譜-軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap HRMS）對混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行分析，得到線性回歸方程，再對待測樣品進行測定測得分析物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品中目標(biāo)物的含量；

色譜條件： Agilent Zorbax Eclipse XDB–C₁₈色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），柱溫25 ℃，進樣量2 μL，流速0.2 mL/min；流動相A：0.1%甲酸水溶液，B:乙腈（A:B=70:30）。

質(zhì)譜條件：使用Q-Exactive軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)的電加熱噴霧離子源（HESI），噴霧電壓3.5 kV，毛細管加熱溫度320 ℃，加熱器溫度300 ℃。鞘氣（Sheath gas）流速1.67 L/min，輔助氣（Aux gas）流速1 L/min。掃描采用Full MS/ddMS²正離子模式，一級全掃描范圍200±100 amu，分辨率7×10⁴，離子最大注入時間50 ms，自動增益控制（AGC）1×10⁶；使用數(shù)據(jù)依賴掃描（Data dependent）為二級掃描模式，分辨率為1.75×10⁴，自動增益控制1×10⁵，最大注入時間50 ms，歸一化碰撞能量（NCE）60%。

各目標(biāo)化合物質(zhì)量數(shù)和主要二級子離子見表一。

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本發(fā)明方法的線性范圍和檢出限：

香豆素、7-羥基香豆素、4甲基傘形酮分別使用甲醇溶解，乙腈定容配制濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入小鼠空白血清，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中7-羥基香豆素和香豆素的濃度依次為0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL，內(nèi)標(biāo)4-甲基傘形酮濃度始終為5 ng/mL。采用內(nèi)標(biāo)定量法，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積之比（Y）對相應(yīng)的目標(biāo)物濃度（X）進行線性回歸，即可得到各目標(biāo)物的工作曲線方程及相關(guān)系數(shù)。重復(fù)進樣最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液10次，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍和10倍值為方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。結(jié)果如表2所示，香豆素及其代謝物在0.2 ng/mL~1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，方法檢出限在0.011~0.016 ng/mL之間，定量限在0.036~0.052 ng/mL之間。

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本發(fā)明方法的回收率和重復(fù)性：

取空白血清，加入目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備高、中、低3種濃度的質(zhì)控樣品，香豆素及其代謝物濃度為1、50和500 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為5 ng/mL，采用上述方法進行前處理和內(nèi)標(biāo)法定量分析。于同一天內(nèi)，對高、中、低3個濃度的質(zhì)控樣品分別進行6次重復(fù)進樣分析，定量測定目標(biāo)物含量，進而計算出3個濃度水平下目標(biāo)物的日內(nèi)精密度和回收率，如表3所示，3種濃度的質(zhì)控樣品回收率為90.2%~110.4%，精密度（RSD）在1.86%~7.08%之間，說明該方法準(zhǔn)確度較高，重復(fù)性較好，能夠滿足復(fù)雜基質(zhì)中痕量目標(biāo)物檢測的方法學(xué)要求。

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本發(fā)明的方法是一種新的血液中香豆素及其代謝物的檢測方法，針對血液樣品優(yōu)化了前處理方法，并對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的相關(guān)檢測條件進行了優(yōu)化，與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果：

①與傳統(tǒng)檢測方法熒光分光光度法、HPLC 、HPLC-UV、HPLC-RF等相比，UPLC-Orbitrap HRMS法分析效率和靈敏度更高。

②本方法具有前處理簡便，操作快速準(zhǔn)確，靈敏度高重復(fù)性好的優(yōu)點。

附圖說明

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中（1）和給藥0.5 h后樣品血液中（2）香豆素及其代謝物色譜圖（A.7-羥基香豆素 B. 4-甲基傘形酮 C. 香豆素）。

圖2 小鼠腹腔注射香豆素后，對照組（■）、5-MOP組（●）血漿中香豆素及其代謝物的濃度-時間曲線。

具體實施方式

本發(fā)明以下結(jié)合實例做進一步描述，但并不是限制本發(fā)明。

實例1：

1．儀器與材料：

Ultimate超高效液相色譜儀，Q-Exactive軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore）；Agilent Zorbax Eclipse XDB-C₁₈（2.1×150 mm, 3.5 μm）。

雌性小鼠（SPF級C57BL/6，7±1周齡，體質(zhì)量17±1 g，常州卡文斯實驗動物有限公司提供）。甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck）；甲酸（色譜純，德國Serva）；香豆素（>98%，加拿大TRC）；7-羥基香豆素、4-甲基傘形酮、5-甲氧基補骨脂素（>99%，美國Aldrich）；氯化鈉（分析純，鄭州派尼試劑）。

2．樣品處理：小鼠通過腹腔注射CYP2A5探針?biāo)幬锵愣顾厝芤海?00 mg/kg，1 mL/100 g 體質(zhì)量）0.5 h之后，眼眥取血0.5 mL注入1.5 mL離心管離心處理（條件：4℃、6000 rpm）10 min；之后取其100 μL上清血清注入盛有20 μL、100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液和280 μL乙腈的1.5 mL離心管中，渦旋30 s混合均勻，并超聲10 min；最后于4℃、12 000 rpm下離心處理10 min后，用0.22 μm有機相針式濾器過濾其上清液，進樣分析。

3．測定方法：吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和前處理之后的血液樣品各5 μL，注入UPLC-Orbitrap HRMS系統(tǒng)進行分離分析，測得樣品中香豆素及其代謝物的含量。

實例2：按實施例1所述，使用本研究建立的分析方法檢測對照組和CYP2A5酶活性抑制小鼠血液中香豆素及其代謝物的含量。

1．取C57BL/6小鼠100只，隨機分為對照組和5-甲氧基補骨脂素（5-MOP）組各50只，兩組分別再以每組5只隨機分為10個小組，并且每組對應(yīng)一個相同時間點。每日上午9時，5-MOP組灌胃5-MOP溶液（溶于玉米油，25 mg/kg，1 mL/100 g 體質(zhì)量），對照組則灌胃等體積生理鹽水。連續(xù)給藥三次，每次間隔24小時。第三次給藥12小時前，將小鼠飼料移除。實驗期間小鼠可自由飲水。

最后一次給藥1小時后，每只小鼠通過腹腔注射CYP2A5探針?biāo)幬锵愣顾厝芤海?00 mg/kg，1 mL/100 g 體質(zhì)量）。首先于不同時間（5、10、15、30、45、60、90、120、180、240 min）下，眼眥取血0.5 mL注入1.5 mL離心管離心處理（條件：4℃、6 000 rpm）10 min；之后取其100 μL上清血清注入盛有20 μL、100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液和280 μL乙腈的1.5 mL離心管中，渦旋30 s混合均勻，并超聲10 min；最后于4℃、12 000 rpm下離心處理10 min后，用0.22 μm有機相針式濾器過濾其上清液，進樣分析。

2. 數(shù)據(jù)處理：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0 軟件進行統(tǒng)計分析，并通過非房室模型的統(tǒng)計矩原理計算藥代動力學(xué)參數(shù)。

以香豆素及其代謝物的濃度為縱坐標(biāo)，以采樣時間為橫坐標(biāo)，對照組和5-MOP組小鼠血液中香豆素及代謝物濃度隨時間的變化曲線如圖2所示。

由圖2可以看出，5-MOP組各時間點香豆素的平均血藥濃度均明顯高于對照組，且7-羥基香豆素的平均血藥濃度均明顯低于對照組。對小鼠血液中香豆素及代謝物濃度隨時間變化的數(shù)據(jù)進行非房室模型分析，其主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表4。結(jié)果表明，5-MOP組的最大血藥濃度C_max為對照組的1.42倍（P<0.01），藥時曲線下面積AUC_0-∞為1.59倍（P<0.05），香豆素半衰期t_1/2為1.05倍（P<0.01），由于香豆素代謝與CYP2A5酶活性誘導(dǎo)相關(guān)，由此表明5-MOP使小鼠體內(nèi)CYP2A5酶活性明顯降低，與文獻一致（王二豪. 芹菜提取物對CYP2A6酶活性的影響[D]. 重慶醫(yī)科大學(xué), 2014.）。

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