本發(fā)明涉及液體活檢病理學(xué)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶聯(lián)合在前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測中的應(yīng)用及試劑盒。
背景技術(shù)：
：前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生的結(jié)果是前列腺癌。前列腺癌被形容為“沉默的殺手”，其早期不易被發(fā)現(xiàn)，通常確診時(shí)病情已發(fā)展至晚期，70％患者延誤治療，多名世界名人死于前列腺癌。主要癥狀表現(xiàn)為尿血、尿痛及骨痛。數(shù)據(jù)顯示，前列腺癌已成為全球范圍內(nèi)男性中第二位最常見的癌癥，2012年新診斷的前列腺癌患者為110萬，約占新增癌癥病例總數(shù)的15％。近十年來，中國的前列腺癌發(fā)病率驟增，而大城市更成為“重災(zāi)區(qū)”。北京市前列腺癌發(fā)病率由2001年的5.53/10萬上升至2010年的16.62/10萬，上海市20年間的前列腺癌發(fā)病率則增長了10余倍。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提高前列腺癌治愈率、降低死亡率的有效措施。PIN(前列腺上皮內(nèi)腫瘤)：形態(tài)學(xué)上具有一定異型性、尚保存原腺體結(jié)構(gòu)或基底細(xì)胞層，無間質(zhì)浸潤的病變統(tǒng)稱為PIN，是前列腺的癌前期病變。從生物學(xué)行為來看，DNA非整倍體的PIN常出現(xiàn)在非整倍體前列腺癌附近；前列腺癌及PIN均表現(xiàn)為8p染色體上的腫瘤抑制基因的缺失，上皮內(nèi)腫瘤的增生細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞特征，有進(jìn)展為浸潤癌的潛能。臨床研究表明，從PIN轉(zhuǎn)化為腺癌至少需要10年或更多的時(shí)間，低度PIN往往在30多歲即出現(xiàn)。對(duì)PIN尤其是HGPIN患者進(jìn)行篩查早期診斷和治療可能會(huì)降低前列腺癌的發(fā)病率，有助于預(yù)防前列腺癌，亦可能延緩前列腺癌的侵襲過程，從而推遲患者手術(shù)或放療時(shí)間，提高患者的生活質(zhì)量。目前，前列腺癌常用的篩查方法是用直腸指檢加血清PSA濃度測定。但約有30％的患者PSA可能不升高，因而特異度不高。CT或MRI檢查可顯示前列腺形態(tài)改變、腫瘤及轉(zhuǎn)移。前列腺穿刺活檢，可作為確診前列腺癌的方法。未能穿刺取出腫瘤組織不能否定診斷。目前，臨床尚未發(fā)現(xiàn)便捷、快速、無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確的篩查方法。另外，目前臨床檢測前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生的篩查方法都是針對(duì)單個(gè)的標(biāo)志物進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果的敏感度和特異度并不高，對(duì)前列腺癌的診斷結(jié)果不準(zhǔn)確。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物在制備前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒中的應(yīng)用，將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶同時(shí)作為聯(lián)合標(biāo)志物，用于檢測前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生，具有敏感度和特異度高的特點(diǎn)，有助于提高對(duì)由前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的前列腺癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明的另一目的在于提供一種前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒，該試劑盒以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，可用于對(duì)由前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的前列腺癌的篩查、早診、預(yù)后判斷及指導(dǎo)個(gè)體治療等領(lǐng)域，具有較高的敏感度和特異度。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物在制備前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒中的應(yīng)用。一種前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒，其以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，該前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒包括：用于檢測原血紅素的原血紅素檢測試劑膜和用于檢測β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜。本發(fā)明的原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶聯(lián)合在前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測中的應(yīng)用及試劑盒的有益效果是：相較于以單個(gè)的原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物，本發(fā)明首次提出將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物，應(yīng)用于檢測前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生的情況，令人驚喜的發(fā)現(xiàn)，相較于單獨(dú)地以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行檢測，將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物進(jìn)行檢測的敏感度(88％)、特異度(94％)以及約登指數(shù)(0.82)均明顯提高，其有助于提高對(duì)由前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的前列腺癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的原血紅素比色板的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的β-葡萄糖醛酸苷酶比色板的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶聯(lián)合在前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測中的應(yīng)用及試劑盒進(jìn)行具體說明。原血紅素是血紅素家族的重要成員，是血紅素在人體內(nèi)的存在形式，是血紅素結(jié)合蛋白的活性基。它由原卟啉Ⅸ與二價(jià)鐵離子結(jié)合而成。據(jù)其分子結(jié)構(gòu)和功能不同又分為原血紅素a、b、c，在腫瘤發(fā)生過程中被釋放，屬于醫(yī)學(xué)相關(guān)生物標(biāo)志(medicine-relatedbiomarker)。致癌因素導(dǎo)致前列腺細(xì)胞糖代謝異常，腫瘤細(xì)胞的耗糖量是正常細(xì)胞的十倍，而且磷酸戊糖途徑代謝活躍，稱為“瓦博格氏效應(yīng)”。在腫瘤細(xì)胞能量代謝電子傳遞過程中，其間芬頓氏反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基、過氧自由基等對(duì)線粒體造成氧化損傷，改變細(xì)胞蛋白的極性量值，使位居線粒體基膜中血紅素結(jié)合蛋白疏水核(又稱血紅素口袋)中的原血紅素釋放，導(dǎo)致前列腺液或精液中原血紅素含量增加，其釋放量與細(xì)胞癌變程度呈正相關(guān)。原血紅素具有過氧化物酶的作用，可以使過氧化物脫氧，進(jìn)而使供氫體氧化成含顯色集團(tuán)的物質(zhì)。用比色法測定前列腺液或精液中原血紅素含量，即可顯示前列腺細(xì)胞是否存有異質(zhì)性增生。β-葡萄糖醛酸苷酶是前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生過程中活性增強(qiáng)的一種生物標(biāo)志物。它是由四個(gè)相同亞單位組成的糖蛋白，廣泛存在于人體的各種組織及體液中，生理狀態(tài)下具有參與細(xì)胞增生的作用，而在病理狀態(tài)下，β-葡萄糖醛酸苷酶可以作用于葡萄糖醛酸甙的β一糖苷鍵，水解癌周結(jié)締組織中的蛋白多糖及糖蛋白，破壞其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的防御作用，有利于癌細(xì)胞的浸潤與擴(kuò)散。有關(guān)前列腺癌β-葡萄糖醛酸苷酶活性增高的機(jī)制，一是為適應(yīng)腫瘤生存引起的機(jī)體對(duì)酶代謝的改變，如癌細(xì)胞分泌β-葡萄糖醛酸苷酶增強(qiáng)，癌細(xì)胞膜對(duì)β-葡萄糖醛酸苷酶通透性改變，對(duì)該酶抑制劑的缺乏或增加；二是腫瘤組織浸潤并且破壞周圍正常組織，引起其它組織酶生成異常，或因腫瘤壓迫梗阻引起該酶的大量釋放，造成β-葡萄糖醛酸苷酶增高。通過聯(lián)合應(yīng)用形態(tài)學(xué)細(xì)胞水平的免疫組化技術(shù)、亞細(xì)胞水平的免疫電鏡技術(shù)和機(jī)能學(xué)的ELISA技術(shù)，對(duì)前列腺癌組織及前列腺液或精液中β-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行的同步檢測顯示，β-葡萄糖醛酸苷酶在前列腺癌患者組織及前列腺液或精液中增高，是由癌細(xì)胞自身的生物學(xué)特性決定的，緣于腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)其快速過度增殖和異常分化的自主性生長的生存方式而產(chǎn)生的自我調(diào)控，由其自身獨(dú)特的生長方式?jīng)Q定并成為內(nèi)因的。在最適溫度與PH條件下，酚酞葡萄糖醛酸甙經(jīng)β-葡萄糖醛酸苷酶催化水解，釋放出游離酚酞。加堿性溶液終止反應(yīng)，酚酞呈紅色。觀察酚酞指示的顏色變化，即可了解樣本液中β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，顯示前列腺細(xì)胞是否存有惡變及其程度。但是，以單個(gè)的原血紅素a/b/c作為標(biāo)志物檢測前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生的特異度比較低，而以單個(gè)的β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生的敏感度比較低。鑒于此，一方面，本發(fā)明提供了原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物在制備前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，上述的前列腺細(xì)胞為前列腺腺泡上皮細(xì)胞。進(jìn)一步地，上述的前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒使用前列腺液或精液作為檢驗(yàn)樣本，檢測樣本內(nèi)是否含有異質(zhì)性增生的前列腺腺泡上皮細(xì)胞。本發(fā)明首次提出將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物，用于檢測前列腺細(xì)胞尤其是前列腺腺泡上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生情況。相較于單獨(dú)地以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物，將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物，用于檢測前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生情況，這兩種標(biāo)志物的檢測結(jié)果可相互印證，相互補(bǔ)充，從而彌補(bǔ)其各自的不足，因而具有更高的敏感度和特異度，有助于提高對(duì)由前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的前列腺癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。另一方面，本發(fā)明還提供了一種前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒，其以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，該前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒包括：用于檢測原血紅素的原血紅素檢測試劑膜和用于檢測β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜。本發(fā)明所提供的前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒可同時(shí)對(duì)前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生的標(biāo)志物原血紅素和β葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行同時(shí)聯(lián)合檢測，具有操作簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。其可用于對(duì)由前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的前列腺癌的篩查、早診、預(yù)后判斷及指導(dǎo)個(gè)體治療等領(lǐng)域，具有較高的敏感度和特異度。進(jìn)一步地，上述前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒還包括樣本前處理液，該樣本前處理液由pH為6.8-7.8、濃度為0.05mol/L的Tris-Hcl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)緩沖液與EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)混合制得。優(yōu)選地，Tris-Hcl緩沖液的pH為7.4。優(yōu)選地，EDTA在樣本前處理液中的濃度為0.01-0.03mol/L，更優(yōu)選地，EDTA在樣本前處理液中的濃度為0.02mol/L。進(jìn)一步地，上述的原血紅素檢測試劑膜由以下方法制得：(1)將聚乙烯吡咯烷酮與磷酸緩沖液混合，得到第一混合液；(2)將原血紅素空白試劑膜浸泡于上述第一混合液中，去除上述原血紅素空白試劑膜的水分后，得到原血紅素試劑膜半成品；其中，去除上述原血紅素空白試劑膜的水分為：淋去原血紅素空白試劑膜上的多余試劑，烘干，得到原血紅素試劑膜半成品，當(dāng)然，也可按其他的方法將浸泡后的原血紅素空白試劑膜的水分除去，其也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。(3)將上述原血紅素試劑膜半成品浸泡于第二混合液中，去除上述原血紅素試劑膜半成品的水分后，得到成品的原血紅素檢測試劑膜，上述第二混合液由3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺、無水乙醇和過氧化羥基異丙苯混合制得。其中，去除上述原血紅素試劑膜半成品的水分為：淋去原血紅素試劑膜半成品上多余的試劑，均勻地烘干即可。優(yōu)選地，上述的磷酸緩沖液的濃度為0.8-2mol/L、pH為3.2-6.8。更優(yōu)選地，上述的磷酸緩沖液的濃度為1.75mol/L、pH為4.5。優(yōu)選地，上述的第一混合液中的聚乙烯吡咯烷酮的濃度為7-9g/100ml。即每100ml第一混合液中含有聚乙烯吡咯烷酮7-9g。更優(yōu)選地，上述的第一混合液中的聚乙烯吡咯烷酮的濃度為8g/100ml。優(yōu)選地，上述的第二混合液按以下方法制得：將0.5-1g的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺加入到500ml的無水乙醇中，然后加入1-2ml的過氧化羥基異丙苯后制得第二混合液。更優(yōu)選地，3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的加入量為0.75g，過氧化羥基異丙苯的加入量為1ml。進(jìn)一步地，上述β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜由以下方法制得：(1)將聚乙烯吡咯烷酮、酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁鹽與醋酸緩沖液混合，得到第三混合液；(2)將β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜浸泡于上述第三混合液中，去除上述β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜的水分后，得到β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品；其中，去除上述β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜的水分為：淋去β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜上的多余試劑，避光條件下，28℃流動(dòng)空氣干燥2小時(shí)。(3)將上述β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品浸泡于甘氨酸緩沖液中，去除β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品的水分，得到β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜。其中，去除β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品的水分為：淋去β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品上多余的試劑，于40℃均勻地烘干。優(yōu)選地，醋酸緩沖液的濃度為0.1-0.3mol/L、pH為6.5-7.58，更優(yōu)選地，醋酸緩沖液的濃度為0.2mol/L、pH為5.0。優(yōu)選地，上述第三混合液中的酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁鹽的濃度為0.5-1g/100ml，更優(yōu)選地，第三混合液中的酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁鹽的濃度為0.79g/100ml。優(yōu)選地，第三混合液中的聚乙烯吡咯烷酮濃度為7-9g/100ml，更優(yōu)選地，第三混合液中的聚乙烯吡咯烷酮濃度為8g/100ml。優(yōu)選地，甘氨酸緩沖液的濃度為0.2-0.3mol/L、pH為9-12。更優(yōu)選地，甘氨酸緩沖液的濃度為0.22mol/L、pH為10.5。進(jìn)一步地，前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒的檢測樣本為前列腺液或精液。需要說明的是，本發(fā)明提供的原血紅素檢測試劑膜和β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜的制作方法并不限于上述的制作方法，在其他的實(shí)施例中，按其他的方法所制作得到的可用于檢測的原血紅素的原血紅素檢測試劑膜和可用于檢測的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜，只要將其同時(shí)應(yīng)用于檢測原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶，將二者作為聯(lián)合標(biāo)志物，用于檢測前列腺細(xì)胞尤其是前列腺腺泡上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生則均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。還需要說明的是，在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述制作方法中所用的原血紅素空白試劑膜可為31ET濾紙；β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜也可為31ET濾紙，在其他的實(shí)施例中，原血紅素空白試劑膜可和β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜也可以是其他的類型的濾紙，其并不限于31ET濾紙。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例1本實(shí)施例提供了一種前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒，該試劑盒以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測。通過對(duì)原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶的檢測結(jié)果，可用于判斷樣本的前列腺細(xì)胞例如前列腺腺泡上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生情況。本實(shí)施例提供的前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒，其包括用于檢測原血紅素的原血紅素檢測試劑膜和用于檢測β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜。其中，本發(fā)明提供的原血紅素檢測試劑膜按如下方法制作：1.1、制作磷酸緩沖液。緩沖液為1.75mol/L、PH值4.5磷酸鹽緩沖液。1.2、把定量聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述磷酸緩沖液中，得到第一混合液，攪拌至全溶；其中，聚乙烯吡咯烷酮K30用量為8g/100ml。即每100ml磷酸緩沖液中加入8g聚乙烯吡咯烷酮K30。s1.3、將裁切好的31ET濾紙(即原血紅素空白試劑膜)在以上步驟制得的第一混合液中均勻浸泡至透，淋去多余試劑，烘干，為原血紅素試劑膜半成品。1.4、將定量3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺加入到無水乙醇500ml中，攪拌至完全溶解；其中，3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺為0.75g。1.5、將定量過氧化羥基異丙苯加入到上述溶液中，得到第二混合液，攪拌至完全溶解；過氧化羥基異丙苯加入量為1ml。1.6、將步驟1.3制得的原血紅素試劑膜半成品在步驟1.5制得的第二混合液中均勻浸泡至透，淋去多余試劑，均勻地烘干，即得原血紅素檢測試劑膜。1.7、避光、干燥條件下保存。本發(fā)明提供的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜按如下方法制作：2.1、取100ml0.2mol/LpH5.0的醋酸緩沖液。2.2、將定量0.79g的酚酞葡萄糖醛酸苷辛可尼丁鹽(PGA)溶于步驟2.1的醋酸緩沖液中混勻。2.3、把定量聚乙烯吡咯烷酮K30加入上述步驟2.2得到的混合溶液中，得到第三混合液攪拌至全溶；聚乙烯吡咯烷酮K30為8g/100ml。2.4、將裁切好的31ET濾紙(β-葡萄糖醛酸苷酶空白試劑膜)在步驟2.3制得的第三混合液中均勻浸泡至透，淋去多余試劑，得β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品。2.5、避光條件下，28℃流動(dòng)空氣干燥2小時(shí)。2.6、取0.22mol/L、PH值為10.5的堿性甘氨酸緩沖液。2.7、將步驟2.4制得的β-葡萄糖醛酸苷酶試劑膜半成品在步驟2.6制得的甘氨酸緩沖液中均勻浸泡至透，淋去多余試劑，40℃均勻地烘干，即得到β葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜。2.8、避光、干燥條件下保存。本發(fā)明提供的前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒參考如下步驟進(jìn)行檢測：3.1、將來自某個(gè)體(前列腺癌患者、或非前列腺癌患者、或疑似前列腺癌患者)的前列腺液或精液樣本與樣本前處理液(購買或配制)混合，得到樣本混合液。3.2、取前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒中的原血紅素檢測試劑膜和β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜分別插入至樣本混合液中，根據(jù)顯色結(jié)果，與相應(yīng)的比色板相比較，判斷出單個(gè)標(biāo)物的情況。通常情況下，原血紅素檢測試劑膜呈現(xiàn)藍(lán)色為陽性，即樣本中含有原血紅素，否則為陰性；β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜呈現(xiàn)紅色為陽性，即樣本中含有β-葡萄糖醛酸苷酶，否則為陰性。具體地，原血紅素檢測結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)參考圖1，圖1示出了原血紅素比色板的顏色(藍(lán)色)深淺所對(duì)應(yīng)的判讀結(jié)果(陰性、可疑陽性、陽性或強(qiáng)陽性)，根據(jù)原血紅素檢測試劑膜的顯色深淺與圖1所示的原血紅素比色板相比較，進(jìn)而判讀出樣本中的原血紅素結(jié)果(陰性、可疑陽性、陽性或強(qiáng)陽性)。β-葡萄糖醛酸苷酶檢測檢測結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)可參考圖2，圖2示出了β-葡萄糖醛酸苷酶比色板的顏色(紅色)深淺所對(duì)應(yīng)的判讀結(jié)果(陰性、可疑陽性、陽性或強(qiáng)陽性)。根據(jù)β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜的顯色深淺與圖2所示的β-葡萄糖醛酸苷酶比色板相比較，進(jìn)而判讀出樣本中的β-葡萄糖醛酸苷酶結(jié)果(陰性、可疑陽性、陽性或強(qiáng)陽性)。對(duì)個(gè)體的前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生的情況按表1的判讀規(guī)則進(jìn)行判讀。其中，樣本前處理液參考下方法制作：稱取Tris試劑6.05g，少許水溶解，水定容至500ml；3.6ml濃鹽酸用蒸餾水定容到420ml；二者混合，再加入水80ml，共1000ml的Tris-Hcl緩沖液；取7.44gEDTA加入前述的1000mlTris-Hcl緩沖液中，混合保存。表1.采用本實(shí)施例提供的細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒對(duì)檢測結(jié)果的判讀規(guī)則表1中的檢測結(jié)果的臨床意義如下：前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生判讀結(jié)果為陽性是指：前列腺細(xì)胞存在異質(zhì)性增生；前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生判讀結(jié)果為陰性是指：前列腺細(xì)胞不存在異質(zhì)性增生；前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生判讀結(jié)果為可疑陽性是指：前列腺細(xì)胞可能存在異質(zhì)性增生。采用本實(shí)施例提供的前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒對(duì)樣本的檢測結(jié)果可供臨床醫(yī)生在對(duì)受檢者進(jìn)一步檢查時(shí)參考。本實(shí)施例提供的試劑盒以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，可用于前列腺細(xì)胞的異質(zhì)性增生進(jìn)行判斷，具有較高的敏感度和特異度，并可進(jìn)一步對(duì)由前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的前列腺癌的進(jìn)行篩查、早診、預(yù)后判斷及用于指導(dǎo)個(gè)體治療等領(lǐng)域。實(shí)施例2本實(shí)施例提供了一種前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒，該試劑盒以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測。通過對(duì)原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶的檢測結(jié)果，用于判斷樣本的細(xì)胞異質(zhì)性增生情況。本實(shí)施例提供的前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒，其包括用于檢測原血紅素的原血紅素檢測試劑膜、用于檢測β-葡萄糖醛酸苷酶的β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜以及用于對(duì)樣本進(jìn)行處理的樣本前處理液。其中，原血紅素檢測試劑膜、β-葡萄糖醛酸苷酶檢測試劑膜以及樣本前處理液的制作方法可參考實(shí)施例1。本實(shí)施例提供的前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒的效果同實(shí)施例1。實(shí)施例3本實(shí)施例提供了將原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物用于檢測前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生的敏感度、特異度以及約登指數(shù)的驗(yàn)證。靈敏度(sensitivity)：又稱敏感度，是指篩檢方法能將實(shí)際有病的人正確地判定為患者的比例；特異度(specificity)：是指篩檢方法能將實(shí)際無病的人正確地判定為非患者的比例。3.1敏感度驗(yàn)證3.1.1標(biāo)本來源：某醫(yī)療單位臨床檢驗(yàn)室收納的前列腺癌病人前列腺液標(biāo)本100份。前列腺癌均經(jīng)病理學(xué)確診。3.1.2檢測方法：采用實(shí)施例2提供的前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生檢測試劑盒對(duì)上述的100份樣本進(jìn)行原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶的聯(lián)合檢測，并按實(shí)施例1提供的判讀規(guī)則進(jìn)行判讀。(需要說明的是，也可以采用其他的試劑盒或方法檢測100份樣本原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶，只要以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物用于對(duì)前列腺細(xì)胞的異質(zhì)性增生進(jìn)行檢測即可)，前列腺異質(zhì)性增生的檢測結(jié)果見表2。表2.以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物與單獨(dú)的以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測前列腺癌樣本的敏感度標(biāo)志物強(qiáng)陽性陽性陰性可疑陽性敏感度(％)原血紅素334719181β-葡萄糖醛酸苷酶74840560原血紅素+β-葡萄糖醛酸苷酶861121988注：表中數(shù)據(jù)為相應(yīng)檢測結(jié)果的前列腺癌樣本數(shù)。表2顯示了以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物與單獨(dú)的以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測前列腺癌樣本的敏感度，從表2可知，單獨(dú)地以原血紅素作為標(biāo)志物檢測樣本的敏感度明顯高于單獨(dú)地以β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測樣本的敏感度(p<0.01)；以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測樣本的敏感度高于單獨(dú)地以β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測樣本的敏感度(p<0.01)；以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測樣本的敏感度與以原血紅素作為標(biāo)志物檢測樣本的敏感度差異并不顯著(p>0.05)。3.2特異度驗(yàn)證3.2.1標(biāo)本來源：與步驟3.1.1中的相同醫(yī)療單位臨床檢驗(yàn)室收納的非前列腺癌患者前列腺液標(biāo)本100份。非前列腺癌患者為其它原因需要進(jìn)行病理學(xué)檢查，均除外前列腺癌者。3.2.2檢測方法：同步驟3.1.2。異質(zhì)性增生的檢測結(jié)果見表3。表3.以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物與單獨(dú)的以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測非前列腺癌樣本的特異度標(biāo)志物強(qiáng)陽性陽性陰性可疑陽性特異度(％)原血紅素42766369β-葡萄糖醛酸苷酶09829191原血紅素+β-葡萄糖醛酸苷酶24643094注：表中數(shù)據(jù)為相應(yīng)檢測結(jié)果的非前列腺癌樣本數(shù)。表3顯示了以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物與單獨(dú)的以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測非前列腺癌樣本的特異度，從表3可看出，以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測樣本的特異度明顯高于單獨(dú)地以原血紅素作為標(biāo)志物檢測樣本的特異度(p<0.01)，并且以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測樣本的特異度與單獨(dú)地以β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測樣本的特異度差異并不明顯(p>0.05)。3.3約登指數(shù)3.3.1單獨(dú)地以原血紅素作為標(biāo)志物檢測的約登指數(shù)為0.50；3.3.2單獨(dú)地以β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物檢測的約登指數(shù)為0.51；3.3.3以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物檢測的約登指數(shù)為0.82。約登指數(shù)是指：敏感度與特異度之和減去1，其表示篩檢方法發(fā)現(xiàn)真正的患者與非患者的總能力，指數(shù)越大說明篩查實(shí)驗(yàn)的效果越好，真實(shí)性越大。由上述結(jié)果可知，以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物用于篩查前列腺細(xì)胞的異質(zhì)性增生的效果更好，其真實(shí)性越大，相應(yīng)地診斷結(jié)果也準(zhǔn)確，大大地提高了對(duì)由前列腺細(xì)胞尤其是前列腺腺泡上皮細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的前列腺癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。綜上，本發(fā)明首次以原血紅素和β-葡萄糖醛酸苷酶作為聯(lián)合標(biāo)志物用于檢測前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生情況，令人驚訝的結(jié)果是其敏感度達(dá)到88％、特異度達(dá)到94％、約登指數(shù)達(dá)到0.82，均明顯高于單獨(dú)地以原血紅素或β-葡萄糖醛酸苷酶作為標(biāo)志物的檢測，且漏診率和誤診率都非常低，符合篩查試劑的要求，適合于做大數(shù)據(jù)人群的由前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的前列腺癌篩查，有助于提高對(duì)由前列腺細(xì)胞異質(zhì)性增生引起的前列腺癌的診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3