本發(fā)明涉及生化分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種檢測(cè)禽蛋中膽固醇含量的酶比色法。
背景技術(shù)：
：膽固醇存在于動(dòng)物的所有組織中，是細(xì)胞的組分，也是維生素和前列腺素的前體和血中脂類的轉(zhuǎn)移因子，是動(dòng)物體維持正常生理活動(dòng)所必需的。然而，過(guò)多的攝入膽固醇可引起高血脂、血栓進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化等一系列心血管疾病。禽蛋是自然界中營(yíng)養(yǎng)最為豐富的食品之一，但是蛋黃中的高膽固醇也引起人們的高度關(guān)注，鑒于膽固醇類組分對(duì)人體的影響，人們不斷采取各種各樣的手段來(lái)控制膽固醇攝入量。因而測(cè)定禽蛋中膽固醇含量即顯得十分重要。目前膽固醇的測(cè)定方法主要有：化學(xué)比色法、色譜法等。化學(xué)比色法是測(cè)定膽固醇含量的傳統(tǒng)方法，包括抽提法和直接測(cè)定法。該方法重現(xiàn)性良好，但比色比較耗時(shí)，即使連續(xù)操作也需要16個(gè)小時(shí)以上，一般當(dāng)天不可能完成試驗(yàn)，所用化學(xué)試劑毒性大且比較昂貴，并且測(cè)定結(jié)果偏高；色譜法如：薄層層析法、氣相色譜法和液相色譜法。這些方法都需要特殊設(shè)備，并且維持費(fèi)用也很昂貴，普通實(shí)驗(yàn)室一般都難以承受，并且操作步驟復(fù)雜，對(duì)試劑和儀器的要求很高，因此難于推廣使用；而酶測(cè)定法敏感、特異、快速，并能自動(dòng)化分析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)禽蛋中膽固醇含量的酶比色法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種檢測(cè)禽蛋中膽固醇含量的酶比色法，包括如下步驟：步驟1：制備待分析試液；步驟2：繪制膽固醇溶液的吸光度隨濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)變化曲線；步驟3：在待分析試液中加入顯色劑，進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)量其吸光度；步驟4：根據(jù)待分析試液的吸光度與所述標(biāo)準(zhǔn)變化曲線計(jì)算待分析試液的膽固醇含量；其中，所述步驟1具體包括：步驟1.1：制備禽蛋樣品，并對(duì)其進(jìn)行皂化；步驟1.2：對(duì)皂化后的所述禽蛋樣品進(jìn)行萃取，得到萃取液；步驟1.3：將所述萃取液制備成待分析試液。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的檢測(cè)禽蛋中膽固醇含量的酶比色法，可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出禽蛋中的膽固醇含量水平，穩(wěn)定性較好，可以適用于給禽蛋和蛋制品中膽固醇含量的檢測(cè)，通用性較強(qiáng)，檢測(cè)效率較高，耗時(shí)短，成本低，無(wú)需昂貴的檢測(cè)設(shè)備即可準(zhǔn)確完成檢測(cè)，適合大面積推廣。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)：進(jìn)一步：所述步驟1.1中，所述禽蛋樣品為全蛋樣品，所述全蛋樣品的制備過(guò)程包括：選取禽蛋，去掉蛋殼，將蛋黃和蛋清充分混勻。進(jìn)一步：所述步驟1.1中，所述禽蛋樣品為蛋黃樣品，所述蛋黃樣品的制備過(guò)程包括：選取禽蛋，去掉蛋殼和蛋清，用濾紙吸干蛋黃表面的蛋清，再將蛋黃充分混勻。進(jìn)一步：所述步驟1.1中，對(duì)所述禽蛋樣品進(jìn)行皂化的過(guò)程包括：取禽蛋樣品1.00-2.00g，并加入皂化劑，在60-70℃的溫水中水浴50-70min；其中，所述皂化劑由體積為5-15mL、濃度為600g/L的氫氧化鉀溶液和體積為15-25mL的甲醇混合組成。進(jìn)一步：所述步驟1.2中，將皂化后的所述禽蛋樣品冷卻至室溫，加入15-25mL水，加入萃取劑萃取，得到萃取液。進(jìn)一步：所述步驟1.2中，得到所述萃取液后，還向所述萃取液加入濃度為50g/L的氯化鈉溶液3-4mL，再將所述萃取液水洗至酸堿中性。進(jìn)一步：所述步驟1.3中，將所述萃取液轉(zhuǎn)至雞心瓶中，在45-55℃的溫水中水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，用無(wú)水乙醇溶解定容至10mL，制得待分析試液。進(jìn)一步：所述步驟2中，配置一系列已知濃度的膽固醇溶液，加入所述顯色劑并進(jìn)行顯色反應(yīng)，分別測(cè)量其吸光度，并繪制膽固醇溶液的吸光度隨膽固醇濃度標(biāo)準(zhǔn)變化曲線。進(jìn)一步：所述步驟2和步驟3中，所述顯色劑包含80～100U/L膽固醇酯酶、40～60U/L膽固醇氧化酶、1000～1500U/L過(guò)氧化物酶、170.0-175mg膽酸鈉、10.0-10.5mg4-氨基安替比林、30.0-35.0mg苯酚和280.0-320mg聚乙二醇辛基苯基醚的濃度為0.3mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，且所述顯色反應(yīng)的顯色時(shí)間為10-20min，顯色溫度為35-40℃。進(jìn)一步：所述步驟4中，根據(jù)待分析試液的吸光度在所述標(biāo)準(zhǔn)變化曲線上讀取待分析液中膽固醇的濃度，并根據(jù)待分析液中膽固醇濃度計(jì)算待分析試液的膽固醇含量，具體公式為：其中，X表示待分析液中膽固醇含量，單位為mg/100g；C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的待分析試液中膽固醇的濃度，單位為mg/mL；V表示待分析試液的體積，單位為mL；M表示待分析試液的質(zhì)量，單位為g。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明中加入氫氧化鉀濃度與膽固醇提取量的關(guān)系曲線示意圖；圖2為本發(fā)明中皂化溫度與膽固醇提取量的關(guān)系曲線示意圖；圖3為本發(fā)明中皂化時(shí)間與膽固醇提取量的關(guān)系曲線示意圖；圖4為本發(fā)明中膽固醇溶液的吸光度隨膽固醇濃度標(biāo)準(zhǔn)變化曲線示意圖；圖5為本發(fā)明中膽固醇溶液的吸光度隨波長(zhǎng)的變化曲線示意圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。一種檢測(cè)禽蛋中膽固醇含量的酶比色法，包括如下步驟：步驟1：制備待分析試液；步驟2：繪制膽固醇溶液的吸光度隨濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)變化曲線；步驟3：在待分析試液中加入顯色劑，進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)量其吸光度；步驟4：根據(jù)待分析試液的吸光度與所述標(biāo)準(zhǔn)變化曲線計(jì)算待分析試液的膽固醇含量；其中，所述步驟1具體包括：步驟1.1：制備禽蛋樣品，并對(duì)其進(jìn)行皂化；步驟1.2：對(duì)皂化后的所述禽蛋樣品進(jìn)行萃取，得到萃取液；步驟1.3：將所述萃取液制備成待分析試液。本實(shí)施例中，所述步驟1.1中，所述禽蛋樣品可以為全蛋樣品，所述全蛋樣品的制備過(guò)程包括：選取禽蛋，去掉蛋殼，將蛋黃和蛋清充分混勻。實(shí)際中可以選取2-3個(gè)禽蛋樣品，如鴿蛋等小蛋可適當(dāng)增加樣品數(shù)量，去殼，將蛋黃和蛋白于勻漿機(jī)或粉碎機(jī)中充分混勻，裝入清潔容器內(nèi)，作為全蛋樣品。本實(shí)施例中，所述步驟1.1中，所述禽蛋樣品也可以為蛋黃樣品，所述蛋黃樣品的制備過(guò)程包括：選取禽蛋，去掉蛋殼和蛋清，用濾紙吸干蛋黃表面的蛋清，再將蛋黃充分混勻。實(shí)際中可以選取2-3個(gè)禽蛋樣品，如鴿蛋等小蛋可適當(dāng)增加禽蛋樣品數(shù)量，去殼和蛋清，用濾紙吸干蛋黃表面的蛋清，將蛋黃于勻漿機(jī)或粉碎機(jī)中充分混勻，裝入清潔容器內(nèi)，作為蛋黃樣品。所述步驟1.1中，對(duì)所述禽蛋樣品進(jìn)行皂化的過(guò)程包括：取禽蛋樣品1.00-2.00g，并加入皂化劑，在60-70℃的溫水中水浴50-70min；其中，所述皂化劑由體積為5-15mL、濃度為600g/L的氫氧化鉀溶液和體積為15-25mL的甲醇混合組成。優(yōu)選地，稱取全蛋樣品2.00g(精確到0.01g)或蛋黃試料1.00g(精確到0.01g)于50mL燒杯中，加入濃度為600g/L的氫氧化鉀溶液10mL和甲醇20mL，搖勻，在65℃水浴1h。每隔20min～30min振搖一次使其皂化完全。本實(shí)施例中，選用雞蛋黃作為皂化實(shí)驗(yàn)樣品，在不同的氫氧化鉀濃度(300g/L、400g/L、500g/L、600g/L、700g/L)，不同的皂化溫度(60℃、70℃、80℃、85℃、90℃、95℃)及不同的皂化時(shí)間(30min、40min、50min、60min、70min、80min)條件下，測(cè)定膽固醇的含量，得到膽固醇含量隨氫氧化鉀濃度的變化曲線，如圖1、2和3所示。由圖1氫氧化鉀濃度與膽固醇含量的關(guān)系可知，膽固醇的提取量隨著氫氧化鉀濃度的增加而增大，但超過(guò)600g/L時(shí)反而下降，因此選擇氫氧化鉀濃度為600g/L。由圖2皂化溫度與膽固醇含量的關(guān)系可知，隨著提取溫度的提高，膽固醇提取量先增大后減小，在65℃時(shí)膽固醇提取量達(dá)到最大，說(shuō)明皂化程度最完全。為了減少皂化溫度引起的誤差，本試驗(yàn)選擇65℃為最佳皂化溫度。由圖3皂化時(shí)間與膽固醇含量的關(guān)系可知，膽固醇的提取量隨著皂化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)皂化時(shí)間達(dá)到60min時(shí)膽固醇提取量達(dá)到最大，說(shuō)明此時(shí)皂化已基本完成，超過(guò)60min后膽固醇的含量反而減少，因此選擇60min為最佳皂化時(shí)間。所述步驟1.2中，將皂化后的所述禽蛋樣品冷卻至室溫，加入15-25mL水，加入萃取劑萃取，得到萃取液。這里，所述萃取劑選用有機(jī)溶劑，比如正己烷、乙醚和石油醚等有機(jī)溶劑。優(yōu)選地，所述萃取劑選用乙醚。在實(shí)際中，在皂化后的所述禽蛋樣品冷卻至室溫后，向皂化后的所述禽蛋樣品中先后分三次加入等量的萃取劑，并收集三次萃取后的萃取液，這樣可以確保將皂化后的所述禽蛋樣品中的膽固醇完全萃取出來(lái)，提高檢測(cè)結(jié)果的精度。優(yōu)選地，所述步驟1.2中，得到所述萃取液后，還向所述萃取液加入濃度為50g/L的氯化鈉溶液3-4mL，再將所述萃取液水洗至酸堿中性。通過(guò)上述步驟加入氯化鈉并水洗，可以去除萃取液中的氫氧化鉀等堿性物質(zhì)，使得所述萃取液成中性，這樣避免對(duì)后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。本實(shí)施例中，所述步驟1.3中，將所述萃取液轉(zhuǎn)至雞心瓶中，在45-55℃的溫水中水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，再用無(wú)水乙醇溶解定容至10mL，制得待分析試液。優(yōu)選地，水浴蒸發(fā)溫度選取為50℃。本實(shí)施例中，所述步驟2中，配置一系列已知濃度的膽固醇溶液，加入所述顯色劑并進(jìn)行顯色反應(yīng)，分別測(cè)量其吸光度，并繪制膽固醇溶液的吸光度隨膽固醇濃度標(biāo)準(zhǔn)變化曲線。實(shí)際中，分別準(zhǔn)確吸取0.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL的容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度(10mL)，配制成濃度為0.0mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL、1.2mg/mL和1.6mg/mL膽固醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按表1加入試劑，混勻后置于37℃水浴中恒溫反應(yīng)15min，取出冷卻至室溫。在波長(zhǎng)505nm處，測(cè)定吸光值。以膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值減去試劑空白的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。表1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)試劑添加量單位為毫升試劑管A管1管2管3管4管5管6標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1(0.0mg/mL)—0.060—————標(biāo)準(zhǔn)工作溶液2(0.4mg/mL)——0.060————標(biāo)準(zhǔn)工作溶液3(0.8mg/mL)———0.060———標(biāo)準(zhǔn)工作溶液4(1.2mg/mL)————0.060——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液5(1.6mg/mL)—————0.060—標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0mg/mL)——————0.060無(wú)水乙醇0.060——————顯色劑3.0003.0003.0003.0003.0003.0003.000由圖4可知，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在0mg/mL～2.0mg/mL范圍內(nèi)符合郞伯-比爾定律，曲線回歸方程為Y＝0.3207X+0.0891，相關(guān)系數(shù)良好(R2＝0.9992)。為了減少酶試劑用量，不再增設(shè)＞2.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，如果實(shí)測(cè)待分析試液吸光值超過(guò)此范圍，可以對(duì)其進(jìn)行稀釋。在測(cè)量吸光度時(shí)，準(zhǔn)備2支離心管(管B，管C)，按表2加入試劑，混勻后置于37℃水浴中恒溫反應(yīng)15min，取出冷卻至室溫。在波長(zhǎng)505nm處，測(cè)定吸光值，如表5所示。表2測(cè)定試料時(shí)試劑添加量單位為毫升試劑管B管C待分析試液0.0600.060水3.000—顯色劑—3.000吸光度的計(jì)算公式如下：A＝Atot-Abl-Aex其中，Atot表示總吸光值(管C)；Abl表示試劑空白吸光值(管A)；Aex表示試料空白吸光值(管B)，Abl和Aex不應(yīng)該大于總吸光值的20％，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線，Aex為零。本實(shí)施例中，所述步驟2和步驟3中，所述顯色劑包含80～100U/L膽固醇酯酶、40～60U/L膽固醇氧化酶、1000～1500U/L過(guò)氧化物酶、170.0-175mg膽酸鈉、10.0-10.5mg4-氨基安替比林、30.0-35.0mg苯酚和280.0-320mg聚乙二醇辛基苯基醚的濃度為0.3mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，且所述顯色反應(yīng)的顯色時(shí)間為10-20min，顯色溫度為35-40℃。實(shí)際中，取80～100U/L的膽固醇酯酶、50U/L的膽固醇氧化酶、1250U/L的過(guò)氧化物酶、172.0mg膽酸鈉、10.2mg4-氨基安替比林、33.0mg苯酚、300.0mg聚乙二醇辛基苯基醚置于100mL的容量瓶中，用0.3mol/L磷酸鹽緩沖溶液(4.2.5)稀釋至刻度處(100mL)。為了找到酶比色反應(yīng)的最優(yōu)顯色溫度和顯色時(shí)間，我們分別檢測(cè)了不同顯色溫度與吸光度以及不同顯色時(shí)間與吸光度的關(guān)系，如表3和表4所示。表3顯色時(shí)間與吸光度的關(guān)系表4顯色溫度與吸光度的關(guān)系由表3可見(jiàn)，顯色12min后吸光度趨于恒定，在15min時(shí)吸光度達(dá)到最大值，說(shuō)明此時(shí)反應(yīng)已基本完全，故顯色時(shí)間取15min。由表4可見(jiàn)，當(dāng)顯色溫度達(dá)到30℃時(shí)吸光度明顯變大，說(shuō)明溫度越高越利于反應(yīng)進(jìn)程，到37℃時(shí)吸光度趨于平穩(wěn)，說(shuō)明反應(yīng)已基本完全，故顯色溫度取37℃為宜。為了找到合適的檢測(cè)波長(zhǎng)，取2.0mg/mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液60μL，按本試驗(yàn)方法顯色，用分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描測(cè)定吸光度值，結(jié)果如圖5所示，可知波長(zhǎng)在505nm處有最大吸收，因此本試驗(yàn)選擇505nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)施例中，所述步驟4中，根據(jù)待分析試液的吸光度在所述標(biāo)準(zhǔn)變化曲線上讀取待分析液中膽固醇的濃度，并根據(jù)待分析液中膽固醇濃度計(jì)算待分析試液的膽固醇含量，具體公式為：其中，X表示待分析液中膽固醇含量，單位為mg/100g；C表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的待分析試液中膽固醇的濃度，單位為mg/mL；V表示待分析試液的體積，單位為mL；M表示待分析試液的質(zhì)量，單位為g。本實(shí)施例中，選用雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鴿蛋和鵪鶉蛋分別制成全單樣品和蛋黃樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品取6個(gè)平行試樣，按本試驗(yàn)方法提取膽固醇并測(cè)其吸光度，計(jì)算批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表5。按照同樣方式進(jìn)行6個(gè)批次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表6。表5批內(nèi)精密度(n＝6)表6批間精密度(n＝6)由表5和表6可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均低于2.1％，遠(yuǎn)低于GB/T27404(2.7％)的要求，說(shuō)明試驗(yàn)具有很好的重復(fù)性，精密度高。在全蛋樣品及其蛋黃樣品中分別添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制100mg/100g，200mg/100g和400mg/100g三個(gè)濃度的試樣溶液，每一濃度6次平行，計(jì)算批內(nèi)添加回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表7。按照同樣方式進(jìn)行6個(gè)批次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算批間添加回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表8。表7批內(nèi)添加回收率精密度續(xù)表7表7批內(nèi)添加回收率精密度表8批間添加回收率精密度續(xù)表8表8批間添加回收率精密度由表7和表8可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于GB/T27404(2.7％)的要求，說(shuō)明試驗(yàn)具有很好的重復(fù)性，精密度高。本發(fā)明的檢測(cè)禽蛋中膽固醇含量的酶比色法，可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出禽蛋中的膽固醇含量水平，穩(wěn)定性較好，可以適用于給禽蛋和蛋制品中膽固醇含量的檢測(cè)，通用性較強(qiáng)，檢測(cè)效率較高，耗時(shí)短，成本低，無(wú)需昂貴的檢測(cè)設(shè)備即可準(zhǔn)確完成檢測(cè)，適合大面積推廣。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3