本發(fā)明屬于含氧量測(cè)定領(lǐng)域，特別涉及一種快速液體氧氣指示劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氧氣對(duì)于許多化學(xué)和生物都是必不可少的，也是導(dǎo)致大部分食物變質(zhì)的原因，因此需要在包裝食品中去除。對(duì)于氧氣的去除可以通過向食品包裝內(nèi)添加氮?dú)?、二氧化碳等氣體，或者通過氧氣清除劑清除。然而，隨著時(shí)間的推移而增加，由于封裝材料的密封性不持久，或者運(yùn)輸、儲(chǔ)存過程中包裝被損壞，結(jié)果導(dǎo)致食物被氧氣污染而變質(zhì)。此外，氧氣也是重要的，在廣泛的工業(yè)，包括但不限于食品包裝，鋼鐵生產(chǎn)，污水處理，石油加工以及玻璃、紙張、啤酒的生產(chǎn)過程。因此，氧的測(cè)量在這些領(lǐng)域中是一個(gè)重要特征。

目前已經(jīng)建立的檢測(cè)氧的方法，包括克拉克電極和氣相色譜法。然而，這些檢測(cè)系統(tǒng)通常是價(jià)格昂貴的，無(wú)論是初始資本支出還是運(yùn)行的成本。而視覺上的氧氣指示劑是廉價(jià)的，能使消費(fèi)者可以通過肉眼檢測(cè)氧氣的存在。一些比色型氧氣指示劑已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，例如三菱氣體化學(xué)公司生產(chǎn)的Ageless Eye產(chǎn)品。近年來(lái)，還有許多通過紫外線激活的比色型氧氣指示劑被報(bào)道。它們大多數(shù)的原理都是利用還原性物質(zhì)與氧氣結(jié)合發(fā)生可逆的氧化還原應(yīng)，并且伴隨著顏色的變化，通過這種方式來(lái)指示氧氣的存在與否。但是存在顏色變化不明顯，不能適應(yīng)濕度較大的環(huán)境，在光作用下不穩(wěn)定，易失去效用等缺點(diǎn)，此外大部分氧氣指示劑不能循環(huán)使用，造成資源浪費(fèi)等環(huán)保問題。

Andrew Mills和Katherine Lawrie研制出新型的氧氣指示劑Pt-TiO₂/MB/glycerol/SPS，用鉑來(lái)控制反應(yīng)時(shí)間，通過提高鉑的負(fù)載量，可以延緩恢復(fù)時(shí)間，當(dāng)鉑的負(fù)載量為1.52％時(shí)，恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)12小時(shí)。這種氧氣指示劑能指示出食品在冷藏的情況下開封了多久。實(shí)驗(yàn)表明，此種指示劑可以重復(fù)使用，在使用至第5次時(shí)，沒有明顯功能減退。但是這種技術(shù)使用的材料成本昂貴，市場(chǎng)售價(jià)高。此外，目前國(guó)內(nèi)在氧氣指示劑方面的產(chǎn)品很少，且大多具有不可重復(fù)使用、成本昂貴、操作復(fù)雜、檢測(cè)不靈敏、無(wú)法定量等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速液體氧氣指示劑及其制備方法和應(yīng)用，該液體氧氣指示劑可快速指示氧氣存在并可定量氧濃度；制備方法簡(jiǎn)單，使用時(shí)將液體指示劑內(nèi)注入待測(cè)空氣，震蕩數(shù)秒即可發(fā)生顏色反應(yīng)，無(wú)氧時(shí)顯示淺黃色，有氧時(shí)根據(jù)氧濃度不同顯示深淺不一的藍(lán)綠色；可用于食品密封保藏環(huán)境中氧氣檢測(cè)，醫(yī)療無(wú)氧環(huán)境、厭氧菌培養(yǎng)環(huán)境及其他無(wú)氧操作環(huán)境中檢測(cè)氧氣是否存在及確定氧濃度。

本發(fā)明的一種快速液體氧氣指示劑，所述氧氣指示劑的組成包括：活性黑5(Reactive Black 5，Sigma-Aldrich公司)，肺炎克雷伯氏菌株KL1，液體培養(yǎng)基和蒸餾水。

所述液體培養(yǎng)基的成分包括：磷酸二氫鉀2.66g/L，氯化銨0.2g/L，無(wú)水硫酸鈉0.5g/L，酵母提取物3g/L。

所述液體氧氣指示劑重生的方法為：將經(jīng)氧氣氧化顯色后的氧氣指示劑重新靜置，于30～40℃恒溫培養(yǎng)8～10小時(shí)，得到重生的液體氧氣指示劑。

所述液體氧氣指示劑重生循環(huán)使用次數(shù)大于等于18次。

所述液體氧氣指示劑的反應(yīng)及存儲(chǔ)容器為4mL色譜進(jìn)樣瓶(CNW Technologies GmbH)。

所述的快速液體氧氣指示劑的制備方法，包括：

將恒溫靜置培養(yǎng)24～48h的肺炎克雷伯氏菌株KL1接入到含有活性黑5的經(jīng)過滅菌的液體培養(yǎng)基中，混勻，密封條件下(每4mL分裝到色譜進(jìn)樣瓶中，蓋上螺紋蓋)于30～40℃恒溫靜置培養(yǎng)24～48h，(等到活性黑5顏色褪去，徹底變成淺黃色時(shí))得到液體氧氣指示劑。

本發(fā)明中的肺炎克雷伯氏菌株KL1，保藏單位名稱：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC No.13552，保藏日期為2017年01月09日，建議分類命名為：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

所述肺炎克雷伯氏菌株KL1恒溫靜置培養(yǎng)的溫度為30～40℃，pH為4.0～9.0。

所述肺炎克雷伯氏菌株KL1的接種量為1％～10％(V/V)。

所述含有活性黑5的經(jīng)過滅菌的液體培養(yǎng)基中活性黑5的濃度為100～1000mg/L。

本發(fā)明還提供了一種快速液體氧氣指示劑的應(yīng)用，所述應(yīng)用的方法為：

用氣體采集注射器采集待測(cè)氣體，然后全部注射入液體氧氣指示劑中，上下顛倒震蕩3～10秒，即可顯色，然后與標(biāo)準(zhǔn)氧濃度比色卡進(jìn)行比色，定量氧濃度；具體可應(yīng)用于食品包裝內(nèi)氧含量檢測(cè)或其他需要監(jiān)測(cè)環(huán)境氧含量的指示領(lǐng)域。

本發(fā)明所述氧濃度均指氧氣占待測(cè)氣體中的體積百分?jǐn)?shù)。

所述液體氧氣指示劑無(wú)氧還原態(tài)呈淺黃色，經(jīng)氧氣氧化反應(yīng)后變成氧化態(tài)呈藍(lán)綠色。

所述氣體采集注射器為100μL微量進(jìn)樣器(上海高鴿生物科技有限公司)，采集待測(cè)氣體并注射入色譜進(jìn)樣瓶。

所述標(biāo)準(zhǔn)氧濃度比色卡的制備方法包括：取數(shù)個(gè)液體氧氣指示劑排列成一排，第一個(gè)不注射氧氣，最后一個(gè)注射過量氧氣，期間按照氧濃度梯度注射氧氣，產(chǎn)生一列氧體積濃度為0％～100％的顏色卡。

本發(fā)明涉及的用于制備指示物質(zhì)的溶液為：磷酸二氫鉀2.66g/L，氯化銨0.2g/L，無(wú)水硫酸鈉0.5g/L，酵母提取物3g/L，活性黑5染料0.1～1g/L。

本發(fā)明提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)氧濃度比色卡，使用本發(fā)明提供的快速氧氣指示劑并通過該比色卡可定量檢測(cè)低氧環(huán)境中氧濃度。

快速氧氣指示劑的重生：

快速氧氣指示劑使用后變成藍(lán)綠色，將其放置于30～40℃環(huán)境，恒溫靜置8～10小時(shí)后，藍(lán)綠色徹底褪去，重新呈現(xiàn)淺黃色，此時(shí)氧氣指示劑重生完成。利用此方法，可循環(huán)使用同一支快速氧氣指示劑18次以上。

本發(fā)明提供的快速氧氣指示劑是由肺炎克雷伯氏菌株KL1對(duì)活性黑5染料的生化作用制備的，并且通過肺炎克雷伯氏菌株KL1提供的還原力實(shí)現(xiàn)氧氣指示劑的多次循環(huán)使用功能。

本發(fā)明提供的快速氧氣指示劑的關(guān)鍵是指示物質(zhì)的制備，指示物質(zhì)經(jīng)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定為TAHNDS，其還原態(tài)為淺黃色，與氧氣接觸氧化后變?yōu)樗{(lán)綠色氧化態(tài)，如圖1所示。

有益效果

本發(fā)明可快速指示氧氣存在并可定量氧濃度；制備方法簡(jiǎn)單，使用時(shí)將液體指示劑內(nèi)注入待測(cè)空氣，震蕩數(shù)秒即可發(fā)生顏色反應(yīng)，無(wú)氧時(shí)顯示淺黃色，有氧時(shí)根據(jù)氧濃度不同顯示深淺不一的藍(lán)綠色；可用于食品密封保藏環(huán)境中氧氣檢測(cè)，醫(yī)療無(wú)氧環(huán)境、厭氧菌培養(yǎng)環(huán)境及其他無(wú)氧操作環(huán)境中檢測(cè)氧氣是否存在及確定氧濃度；本發(fā)明以顏色變化指示氧氣，具有反應(yīng)迅速，顏色變化明顯，易觀察；可循環(huán)使用18次以上；對(duì)環(huán)境友好，無(wú)污染。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中指示物質(zhì)TAHNDS顏色變化分子機(jī)理；

圖2為實(shí)施例2中快速氧氣指示劑使用演示圖；其中，2b是2a的局部放大圖；

圖3為實(shí)施例3中的0％到100％的標(biāo)準(zhǔn)氧濃度氧氣指示劑；

圖4為實(shí)施例3中的0％到100％的標(biāo)準(zhǔn)氧濃度比色卡。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

快速氧氣指示劑的制備：

取恒溫(37℃)靜置培養(yǎng)24h的肺炎克雷伯氏菌株KL1菌液，以10％的接種量(V/V)接入含有500mg/L的活性黑5的液體培養(yǎng)基中，混勻菌液后按每4mL溶液分裝于滅菌的4mL色譜進(jìn)樣瓶中，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)48h，直到活性黑5的顏色完全褪去，溶液變成淺黃色即為制備完成。

上述液體培養(yǎng)基成分：磷酸二氫鉀2.66g/L，氯化銨0.2g/L，硫酸鈉0.5g/L，酵母提取物3g/L。

上述液體培養(yǎng)基及色譜進(jìn)樣瓶均經(jīng)過121℃，100kPa滅菌20分鐘后使用。

實(shí)施例2

快速氧氣指示劑的使用方法：

用氣體采集注射器采集待測(cè)氣體100μL，然后注射入快速氧氣指示劑中，拔出注射器后，將色譜進(jìn)樣瓶上下顛倒震蕩3～10秒，觀察顏色變化。無(wú)氧狀態(tài)顏色呈現(xiàn)淺黃色，氧氣氧化后呈現(xiàn)藍(lán)綠色，即可觀察到氧氣存在與否。將變色的氧氣指示劑與標(biāo)準(zhǔn)氧濃度比色卡比對(duì)可進(jìn)一步確定氧濃度，如圖2a和2b所示。

實(shí)施例3

標(biāo)準(zhǔn)氧濃度比色卡的制備：

取數(shù)個(gè)液體氧氣指示劑排列成一排，第一個(gè)不注射氧氣，最后一個(gè)注射過量氧氣，中間的氧氣指示劑按照氧濃度遞增方式注射定量的梯度濃度氧氣，相應(yīng)的，氧氣指示劑的顏色就會(huì)根據(jù)注射的氧氣含量由低到高而呈現(xiàn)由淺入深的藍(lán)綠色，即對(duì)應(yīng)產(chǎn)生一列氧濃度由0～100％的梯度。將這排氧氣指示劑拍攝成照片，如圖3所示。將圖3裁剪后，即制成一張氧濃度從0％到100％的標(biāo)準(zhǔn)氧濃度比色卡，如圖4所示。

實(shí)施例4

快速氧氣指示劑的重生：

快速氧氣指示劑使用后變成藍(lán)綠色，將其放置于37℃環(huán)境，恒溫靜置10h后，藍(lán)綠色徹底褪去，重新呈現(xiàn)淺黃色，此時(shí)氧氣指示劑重生完成。利用此方法，可循環(huán)使用同一支快速氧氣指示劑18次。