本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種華支睪吸蟲囊蚴膠體金快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)：

華支睪吸蟲，又稱為肝吸蟲，肝吸蟲病是我國(guó)感染人數(shù)多、流行范圍大的一種人獸共患寄生蟲病。人和動(dòng)物主要通過(guò)食入含有感染性活囊蚴的淡水魚蝦感染肝吸蟲。成蟲主要寄生在肝膽管內(nèi)，一方面通過(guò)機(jī)械刺激損傷膽管上皮或皮下血管等；另一方面蟲體分泌排泄產(chǎn)物能夠通過(guò)上皮細(xì)胞引發(fā)炎癥和其他損傷，最終能夠引起化膿性膽管炎、阻塞性膽石病、膽囊炎、胰腺炎，甚至引起膽管癌、肝纖維化、肝癌等嚴(yán)重的肝膽管疾病。

在我國(guó)珠三角地區(qū)的餐館對(duì)食用淡水魚進(jìn)行抽樣調(diào)查，結(jié)果顯示60％以上感染了肝吸蟲囊蚴。由此引發(fā)的淡水魚食品衛(wèi)生問(wèn)題直接影響到我國(guó)人民身體健康和淡水魚市場(chǎng)健康發(fā)展。因而對(duì)淡水魚肝吸蟲囊蚴感染的快速檢測(cè)和監(jiān)控將有利于華支睪吸蟲的防治。目前針對(duì)魚體病原體感染的檢測(cè)多采用魚肉壓片、人工胃液消化法查找華支睪吸蟲囊蚴，或者分子生物學(xué)方法查找魚肉中華支睪吸蟲囊蚴基因等方法：

1.魚肉壓片鏡檢法：取魚鰓、魚背(靠頭部分)、魚鰭基部和尾鰭基部等部位約豌豆大小的肌肉組織，置于兩張蓋玻片間壓成薄片后在解剖鏡下(10x)觀察組織樣品中是否含有華支睪吸蟲的囊蚴。這一方法由于取材的隨機(jī)性，在感染率低的淡水魚中檢測(cè)極容易出現(xiàn)假陰性；并且需要檢測(cè)人員具備專業(yè)知識(shí)才能準(zhǔn)確在顯微鏡下識(shí)別囊蚴；

2.人工胃蛋白酶魚肉消化法：用剪刀將魚肉剪成碎小狀，放入合適的燒瓶中，按照魚肉重量：消化液體積＝1：10加入消化液(2g胃蛋白酶溶于100ml雙蒸水中，使用前加0.7ml 100％濃鹽酸，現(xiàn)配現(xiàn)用)，37℃消化6—8h(每隔1小時(shí)混勻1次)。將消化產(chǎn)物用80目網(wǎng)篩過(guò)濾，靜置30min后棄去上清液，然后向沉淀中加入自來(lái)水，再靜置20min，棄去上清液，重復(fù)水洗沉淀步驟直至上清液澄清。最后將沉淀吸入平皿中，用解剖鏡(10×)檢測(cè)是否有囊蚴存在，該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作步驟繁瑣，對(duì)與體積較大的成年魚很難消化完全，因此存在漏檢可能，并且對(duì)檢測(cè)的每一條魚是都是致死性的；

3.分子生物學(xué)方法：提取魚肉中的總DNA(或RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA)做模板，設(shè)計(jì)特異性的引物，擴(kuò)增華支睪吸蟲囊蚴DNA中的某一特異片段來(lái)檢測(cè)魚肉中囊蚴的感染。該方法需要有高端的溫控設(shè)備，操作過(guò)程中對(duì)環(huán)境要求較高，否則容易污染，從而造成假陰性。

以上檢測(cè)淡水魚中囊蚴的傳統(tǒng)方式有一定優(yōu)勢(shì)的同時(shí)均存在局限，例如費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢測(cè)對(duì)于淡水魚是致死性，不適合大規(guī)模的野外快速檢測(cè)。

國(guó)內(nèi)外已有研究發(fā)現(xiàn)，硬骨魚類有相對(duì)成熟的免疫系統(tǒng)包括免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)淡水魚血清IgM抗體在抗病原體免疫應(yīng)答發(fā)揮重要作用。除了血清之外，IgM還存在于魚類的粘液中，在魚類機(jī)體的免疫防御方面，尤其是抗寄生蟲、細(xì)菌和真菌等病原體方面具有明顯功效。因此可利用肝吸蟲抗原檢測(cè)魚血清或粘液中其特異的IgM抗體，檢測(cè)淡水魚的肝吸蟲感染，為保證淡水魚產(chǎn)品的安全，切斷肝吸蟲病傳播提供技術(shù)支持。

膠體金免疫層析法是80年代繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和酶)后發(fā)展起來(lái)的固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。應(yīng)用層析式間接法原理,特異性檢測(cè)樣品中的針對(duì)特定抗原的抗體,靈敏度高,成本低,操作簡(jiǎn)便快速,無(wú)需特殊設(shè)備輔助。

目前并沒(méi)有應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)診斷淡水魚吸蟲感染特異性抗體的類似研究或產(chǎn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便快捷、不需要特殊儀器設(shè)備輔助、生產(chǎn)成本低、對(duì)魚體沒(méi)有任何傷害的淡水魚華支睪吸蟲囊蚴感染膠體金快速檢測(cè)試紙條。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種華支睪吸蟲囊蚴膠體金快速檢測(cè)試紙條，包括支持板、以及位于支持板表面的從加樣端依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述金標(biāo)墊上包含膠體金標(biāo)記的兔抗淡水魚多克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線T和質(zhì)控線C。

優(yōu)選地，所述支持板為PVC底板。

優(yōu)選地，所述硝酸纖維素膜上，檢測(cè)線T位于離加樣端較近一側(cè)，質(zhì)控線C位于離加樣端較遠(yuǎn)一側(cè)。

優(yōu)選地，所述檢測(cè)線T上包被有華支睪吸蟲粗抗原。

將活的華支睪吸蟲成蟲破碎、離心，獲取上清即為華支睪吸蟲粗抗原。

優(yōu)選地，所述質(zhì)控線C上包被有羊抗兔IgG。

優(yōu)選地，所述兔抗淡水魚多克隆抗體為兔抗淡水魚IgM二抗。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述兔抗淡水魚多克隆抗體的制備方法包括步驟：

(1)采集淡水魚的血，分離獲得血清，將所述血清進(jìn)行過(guò)濾后再純化，獲得淡水魚IgM抗體；

(2)采用步驟(1)獲得的淡水魚IgM抗體對(duì)兔進(jìn)行免疫，采集兔血，分離血清，將所述血清過(guò)濾后再純化，獲得兔抗淡水魚多克隆抗體。

優(yōu)選地，所述淡水魚選自草魚。

優(yōu)選地，所述兔選自新西蘭兔。

優(yōu)選地，步驟(2)中，對(duì)兔進(jìn)行免疫的具體方法包括步驟：將淡水魚IgM抗體與等體積完全佐劑乳化之后注射給兔，首次免疫后的第2周和第4周，再分別將淡水魚IgM抗體與弗氏不完全佐劑乳化后各加強(qiáng)免疫一次，末次免疫2周后采集兔血。

優(yōu)選地，步驟(2)中，采用濾膜過(guò)濾血清。

所述濾膜的孔徑為0.22～0.45μm。

本發(fā)明一些實(shí)施方式中列舉了采用0.23μm的濾膜過(guò)濾血清。

優(yōu)選地，步驟(2)中，采用Protein G親和層析柱純化。

優(yōu)選地，所述樣品墊選用玻璃纖維素膜。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的樣品墊還經(jīng)過(guò)預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理液選自含有牛血清白蛋白的PBS緩沖液。

所述預(yù)處理的具體步驟為：將樣品墊在預(yù)處理液中浸潤(rùn)完全，取出放于40～45℃條件下烘干。本發(fā)明的一些實(shí)施方式中列舉了在43℃條件下烘干。

優(yōu)選地，所述金標(biāo)墊選用玻璃纖維素膜。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的金標(biāo)墊還經(jīng)過(guò)預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理液選自含有牛血清白蛋白的PBS緩沖液。

所述預(yù)處理的具體步驟為：將金標(biāo)墊在預(yù)處理液中浸潤(rùn)完全，取出放于40～45℃條件下烘干。本發(fā)明的一些實(shí)施方式中列舉了在43℃條件下烘干。

所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。

本發(fā)明的第二方面提供前述華支睪吸蟲囊蚴膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備方法，包括如下步驟：

1)用膠體金標(biāo)記的兔抗淡水魚多克隆抗體溶液噴涂金標(biāo)墊，制得包含兔抗淡水魚多克隆抗體的金標(biāo)墊；

2)在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線T和質(zhì)控線C上分別噴涂華支睪吸蟲粗抗原及羊抗兔IgG，制得包被后的硝酸纖維素膜；

3)將樣品墊、步驟1)制備金標(biāo)墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在支持板上，切裁制得檢測(cè)試紙條。

優(yōu)選地，所述兔抗淡水魚多克隆抗體為兔抗淡水魚IgM二抗。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述兔抗淡水魚多克隆抗體的制備方法包括步驟：

(1)采集淡水魚的血，分離獲得血清，將所述血清進(jìn)行過(guò)濾后再純化，獲得淡水魚IgM抗體；

(2)采用步驟(1)獲得的淡水魚IgM抗體對(duì)兔進(jìn)行免疫，采集兔血，分離血清，將所述血清過(guò)濾后再純化，獲得兔抗淡水魚多克隆抗體。

優(yōu)選地，所述淡水魚選自草魚。

優(yōu)選地，所述兔選自新西蘭兔。

優(yōu)選地，步驟(2)中，對(duì)兔進(jìn)行免疫的具體方法包括步驟：將淡水魚IgM抗體與等體積完全佐劑乳化之后注射給兔，首次免疫后的第2周和第4周，再分別將淡水魚IgM抗體與弗氏不完全佐劑乳化后各加強(qiáng)免疫一次，末次免疫2周后采集兔血。

優(yōu)選地，步驟(2)中，采用濾膜過(guò)濾血清。

所述濾膜的孔徑為0.22～0.45μm。

本發(fā)明一些實(shí)施方式中列舉了采用0.23μm的濾膜過(guò)濾血清。

優(yōu)選地，步驟(2)中，采用Protein G親和層析柱純化。

優(yōu)選地，所述樣品墊選用玻璃纖維素膜。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的樣品墊還經(jīng)過(guò)預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理液選自含有牛血清白蛋白的PBS緩沖液。

所述預(yù)處理的具體步驟為：將樣品墊在預(yù)處理液中浸潤(rùn)完全，取出放于40～45℃條件下烘干。本發(fā)明的一些實(shí)施方式中列舉了在43℃條件下烘干。

優(yōu)選地，所述金標(biāo)墊選用玻璃纖維素膜。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的金標(biāo)墊還經(jīng)過(guò)預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理液選自含有牛血清白蛋白的PBS緩沖液。

所述預(yù)處理的具體步驟為：將金標(biāo)墊在預(yù)處理液中浸潤(rùn)完全，取出放于40～45℃條件下烘干。本發(fā)明的一些實(shí)施方式中列舉了在43℃條件下烘干。

所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。

優(yōu)選地，所述樣品墊選用玻璃纖維素膜。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的樣品墊還經(jīng)過(guò)預(yù)處理，預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理液選自含有牛血清白蛋白的PBS緩沖液。

所述預(yù)處理的具體步驟為：將樣品墊在預(yù)處理液中浸潤(rùn)完全，取出放于40～45℃條件下烘干。本發(fā)明的一些實(shí)施方式中列舉了在43℃條件下烘干。

本發(fā)明第三方面提供前述華支睪吸蟲囊蚴膠體金快速檢測(cè)試紙條在華支睪吸蟲囊蚴檢測(cè)領(lǐng)域的用途。

本發(fā)明的第四方面，提供一種華支睪吸蟲囊蚴膠體金快速檢測(cè)試劑盒，包括前述華支睪吸蟲囊蚴膠體金快速檢測(cè)試紙條和卡殼，所述卡殼包括背卡和上蓋，所述背卡設(shè)有試紙條卡槽，前述華支睪吸蟲囊蚴膠體金快速檢測(cè)試紙條嵌于所述試紙條卡槽內(nèi)，所述上蓋設(shè)有測(cè)試窗和加樣孔，所述測(cè)試窗的位置與所述檢測(cè)線T和質(zhì)控線C的位置相配合，所述加樣孔的位置與所述樣品墊的位置相配合。

更優(yōu)選地，所述卡殼為塑料卡殼。

優(yōu)選地，所述檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)樣品中的華支睪吸蟲囊蚴，所述樣品選自淡水魚全血、血清、血漿或者體表粘液中的一種或多種的組合。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)目前用于淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴檢測(cè)的方法存在諸多缺陷：首先，操作繁瑣，過(guò)程復(fù)雜，需要大量人力物力；其次，取樣隨機(jī)，容易受檢測(cè)人員的專業(yè)技術(shù)水平的影響，靈敏度和特異性較差，同時(shí)對(duì)環(huán)境和設(shè)備要求較高，檢測(cè)穩(wěn)定性很難保證；最后，檢測(cè)過(guò)程對(duì)淡水魚來(lái)說(shuō)都是有創(chuàng)的甚至是致死性的。因此這些方案并不適用于野外大規(guī)模測(cè)田間檢測(cè)。本發(fā)明通過(guò)篩選華支睪吸蟲囊蚴特異的抗原；提取淡水魚血液和粘液中抗體免疫新西蘭兔，制備兔抗淡水魚抗體的二抗并進(jìn)行膠體金標(biāo)記；組裝成試紙條。用試紙條檢測(cè)淡水魚粘液中華支睪吸蟲的特異性抗體，從而檢測(cè)其是否感染華支睪吸蟲。

(2)本發(fā)明只需將淡水魚血清/粘液滴在檢測(cè)區(qū)，幾分鐘后觀察檢測(cè)線T是否變色，通過(guò)肉眼判斷結(jié)果，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，無(wú)需特定的儀器設(shè)備；本發(fā)明應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)特異性的抗體，保證其靈敏性和特異性；

(3)本發(fā)明對(duì)所檢測(cè)的淡水魚是微創(chuàng)的或無(wú)創(chuàng)的，非致死性的，容易被接受。本發(fā)明適用于在流行病學(xué)調(diào)查時(shí)的大規(guī)模田間檢測(cè)和進(jìn)出口淡水魚食品安全現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

(4)本發(fā)明解決了現(xiàn)有淡水魚華支睪吸蟲囊蚴感染檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、需要特殊儀器設(shè)備、漏檢率高、效率低、無(wú)法實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，不能大范圍推廣等問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1：總體技術(shù)方案框架示意圖。

圖2：草魚常見(jiàn)吸蟲抗血清滴度測(cè)定結(jié)果。

圖3：SDS-PAGE驗(yàn)證草魚血清中純化的IgM抗體純度，其中，M：marker，1：草魚IgM抗體。

圖4：純化后兔抗草魚IgM二抗SDS-PAGE(A)與Western-Blotting(B)驗(yàn)證。

圖5：膠體金溶液的燒制及紫外可見(jiàn)光譜測(cè)定，其中A：加入不同檸檬酸三鈉制備的膠體金溶液，B：膠體金紫外可見(jiàn)光光譜測(cè)定。

圖6：膠體金溶液的電鏡掃描鑒定其均一性及粒徑大小。

圖7：膠體金試紙條示意圖。

圖8：試紙條特異性評(píng)價(jià)，其中，1.麝貓后睪吸蟲抗血清，2.異形吸蟲抗血清，3-4.華支睪吸蟲抗血清。

圖9：試紙條敏感性實(shí)驗(yàn)，血清稀釋到1:500時(shí)，依然能夠顯色。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實(shí)施例1

一、華支睪吸蟲囊蚴膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步驟：

(1)第一步，診斷抗原的制備，具體包含以下步驟：

無(wú)菌條件下從感染華支睪吸蟲貓肝中分離活的華支睪吸蟲成蟲，用含雙抗(青霉素終濃度100U/ml；鏈霉素終濃度0.1mg/ml)的0.2M PBS漂洗2-3次，用高壓處理后的牙簽將成蟲挑入2ml EP管中，加入2ml無(wú)菌PBS溶液。用高通量組織破碎儀將成蟲破碎，12000rpm，4℃，20min離心，獲取上清即為華支睪吸蟲粗抗原，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)第二步，草魚常見(jiàn)吸蟲(華支睪吸蟲、異形吸蟲、麝貓后睪吸蟲等)抗血清制備：

采用肌肉注射法對(duì)草魚進(jìn)行免疫，華支睪吸蟲粗抗原或者草魚其他吸蟲粗抗原100ug與等體積的弗氏完全佐劑混合，乳化完全后肌肉注射給草魚，每種抗原免疫3條草魚，第2周、第4周后50ug抗原與弗氏不完全佐劑混勻乳化后加強(qiáng)免疫一次。末次免疫2周后尾靜脈采血。分離血清，測(cè)抗體滴度(結(jié)果如圖2所示)，分裝后-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)第三步，兔抗草魚IgM二抗的制備，具體步驟如下：

從2Kg體重大小健康草魚尾靜脈抽血共50ml，室溫放置2小時(shí)左右，4℃冰箱放置過(guò)夜，次日，4℃，4500rpm，離心25min，分離血清。血清經(jīng)0.23μm的濾膜過(guò)濾后，采用proteinA親和層析柱純化淡水魚IgM抗體(結(jié)果如圖3所示)。紫外分光光度計(jì)測(cè)蛋白草魚IgM濃度。將純化的淡水魚IgM抗體200ug與等體積完全佐劑乳化之后，背部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭兔，2周之后用100ug淡水魚IgM抗體與弗氏不完全佐劑乳化后加強(qiáng)免疫，第二次免疫2周后，再加強(qiáng)免疫一次；最后一次免疫2周后，耳緣靜脈采血2ml，分離血清后，作為一抗，ELISA方法確定兔抗草魚IgM抗體滴度。確認(rèn)抗體滴度達(dá)到較高水平后，心臟采血方法采集新西蘭兔血清50ml，室溫放置2小時(shí)左右，4℃冰箱放置過(guò)夜，第二天取出，4℃，4500rpm，離心25min，分離血清。血清經(jīng)0.23μm的濾膜過(guò)濾后，采用Protein G親和層析柱純化兔抗淡水魚IgM的二抗(結(jié)果如圖4所示)，分裝后-80℃保存。

(4)第四步，膠體金溶液的制備及鑒定，具體步驟包括如下：

1)稱取0.1g氯金酸鈉，溶解于1L去離子水中；

2)加熱煮沸，劇烈攪拌下，迅速加入25ml新配的1％檸檬酸鈉溶液；

3)繼續(xù)煮沸5分鐘，至溶液變成桔紅色；

4)用蒸餾水將溶液的525nm波長(zhǎng)下的光密度吸收值調(diào)到0.8。

5)全波長(zhǎng)紫外分光度計(jì)測(cè)膠體金在250nm～750nm波長(zhǎng)間的最大吸收峰，檢測(cè)膠體金顆粒的大小及均一性(如圖5所示)。

6)用鎳網(wǎng)蘸膠體金溶液后，電鏡掃描，測(cè)量膠體金溶液的平均顆粒大小(如圖6所示)。

(4)第四步，兔抗草魚IgM-膠體金標(biāo)記物及金標(biāo)抗體玻璃纖維膜的制備，具體包含以下步驟：

首先，采用紫外分光光度計(jì)在OD595測(cè)定標(biāo)記兔抗魚IgM抗體的蛋白濃度；將兔抗魚IgM抗體作連續(xù)10倍稀釋各1ml，加入5ml膠體金溶液，1分鐘后加入1ml 10％氯化鈉溶液，靜止5分鐘；以膠體金溶液為空白對(duì)照測(cè)定光吸收度，最低OD值(吸收值)的蛋白質(zhì)濃度為最佳濃度，用最佳濃度加10％的蛋白量用于正式包被。取50ml膠體金溶液，用0.2M K₂CO₃調(diào)pH值為7.6，按照確定的最佳比例將蛋白質(zhì)加入并快速混合，讓蛋白質(zhì)吸附2分鐘后，加0.5ml 1％聚乙二醇，防止非特異性凝集；5000g離心1小時(shí)，棄上清液，將膠體金懸浮于含1％聚乙二醇的PBS中；重復(fù)一次；棄去上清液，將包被的膠體金溶液用5ml含1％BSA的PBS稀釋,經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，4℃保存。

玻璃纖維素膜用10％牛血清白蛋白完全浸潤(rùn)從而降低纖維素膜的非特異吸附，置于干燥箱中，43℃，3h，然后將其置于室溫下干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?。將金?biāo)多克隆抗體溶液用X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于經(jīng)過(guò)處理的玻璃纖維素膜(規(guī)格為20mm×4mm)上，置于干燥箱中，43℃，3h，然后與干燥劑一起密封保存于室溫下的干燥器內(nèi)。

(5)第五步，硝酸纖維素膜的處理

將NC膜放于噴點(diǎn)儀平臺(tái)上，將(1)中制備的診斷抗原蛋白放于貯存池A，羊抗兔IgG二抗(1.5mg/ml)放于貯存池B。將NC膜展平，并放上壓條，開(kāi)機(jī)后將診斷抗原和羊抗兔二抗分別點(diǎn)射于NC膜上形成檢測(cè)線T與質(zhì)控線C，兩條線之間相距0.5cm，位于膜的中間，距膜的邊距分別為0.75cm。置室溫自然干燥后，密閉室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)第六步，試紙條的組裝，具體步驟如下：

將處理好的吸水紙、玻璃纖維素膜、金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜、NC印膜按順序組裝在不干膠支持板的指定位置上將組裝好的半成品試紙放入切割機(jī)槽內(nèi)進(jìn)行切割(2.88mm)，然后將切割好的試紙用塑料外殼包裝好制備成品試紙，最后用多功能薄膜封口機(jī)將制備好的成品試紙與干燥劑一起密封，室溫保存?zhèn)溆?如下圖7所示)。

二、該試紙條的使用方法如下：

首先在樣品墊上的反應(yīng)孔處加入150μl：100稀釋后的待測(cè)淡水魚的標(biāo)本(可以是全血、血清、血漿或體表粘液中的任何一種)，水平放置，5-10min觀察結(jié)果：試紙條上僅C線出現(xiàn)紫紅條帶為陰性；C線、T線出現(xiàn)紫紅色帶為陽(yáng)性；C線沒(méi)有條帶，則試紙條失效。

三、試紙條的滲透速度試驗(yàn)

隨機(jī)抽取10條制備的試紙條，分別加入等量的同一種樣品，記錄從點(diǎn)樣時(shí)開(kāi)始到出現(xiàn)質(zhì)控線C所需的時(shí)間，用以確定試紙的滲透速度，結(jié)果本發(fā)明滲透速率為最快5min，最慢10min，平均7.5min。

四、試紙條特異性檢測(cè)

用以上制備的膠體金檢測(cè)試紙條檢測(cè)麝貓后睪吸蟲囊蚴陽(yáng)性血清、異形異形吸蟲陽(yáng)性血清，分析試紙與這些吸蟲抗血清的交叉反應(yīng)，分析所建立的膠體金檢測(cè)試紙條的診斷特異性。

結(jié)果如圖8所示，試紙條與華支睪吸蟲粗抗原抗血清能夠顯色，而與麝貓后睪吸蟲和異形吸蟲的草魚血清均不發(fā)生反應(yīng)。

五、試紙條敏感性檢測(cè)

將華支睪吸蟲粗抗原免疫后草魚抗血清倍比稀釋(1:100、1:200、1:300、1:400、1:500)。用本發(fā)明建立的試紙條檢測(cè)稀釋后血清，分析檢測(cè)方法的敏感性。如圖9所示，1:500稀釋過(guò)的血清檢測(cè)時(shí)候依然能夠顯色。

此外用本發(fā)明建立的試紙條檢測(cè)12條華支睪吸蟲粗抗原免疫后草魚抗血清，有9條是陽(yáng)性結(jié)果，敏感度約為75％。

六、試紙條重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

用制備的膠體金檢測(cè)試紙條各檢測(cè)15份華支睪吸蟲囊蚴陽(yáng)性的淡水魚血清及15份健康淡水魚血清，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)10次。結(jié)果陽(yáng)性符合率100％、陰性符合率100％，說(shuō)明重復(fù)性較好。

七、試紙條的穩(wěn)定性試驗(yàn)

將同一批次制備的膠體金檢測(cè)試紙條放入含干燥劑的密封袋中4℃或室溫保存，分別于10d，20d，30d后進(jìn)行檢測(cè)，觀察其穩(wěn)定性。結(jié)果本發(fā)明中的試紙條在4℃或室溫保存下30d后依然能夠顯色，且不影響其敏感性和特異性，穩(wěn)定性較好。

綜上所述，本發(fā)明通過(guò)篩選華支睪吸蟲特異性診斷抗原，純化淡水魚IgM抗體免疫新西蘭兔制備兔抗淡水魚IgM的二抗，并進(jìn)行膠體金標(biāo)記，組裝成膠體金試紙條。首次建立了通過(guò)檢測(cè)淡水魚血清或者粘液中的抗體來(lái)診斷淡水魚是否感染囊蚴的方案；特異抗原的篩選保證了診斷的特異性，膠體金標(biāo)記的淡水魚多抗能夠與檢測(cè)線T處結(jié)合了特異抗體的淡水魚IgM抗體結(jié)合然后顯色保證了敏感性。

本發(fā)明用于檢測(cè)淡水魚感染華支睪吸蟲囊蚴僅僅是需要少量淡水魚的血清、全血或者體表粘液，對(duì)淡水魚來(lái)說(shuō)微創(chuàng)或者無(wú)創(chuàng)(無(wú)害)，僅用肉眼判斷檢測(cè)區(qū)域顏色變化來(lái)判斷結(jié)果，具有簡(jiǎn)便快速、不需要專業(yè)技術(shù)知識(shí)等優(yōu)點(diǎn)，極易在普通人群及在大規(guī)模流行病學(xué)野外調(diào)查中推廣使用。

本發(fā)明包含的兔抗淡水魚多克隆抗體，并不只是單單針對(duì)一種淡水魚的，而是可以識(shí)別市場(chǎng)銷售大多數(shù)常見(jiàn)淡水魚體內(nèi)的抗體，極大的擴(kuò)充了本發(fā)明提供的膠體金試紙條的檢測(cè)范圍。

本發(fā)明提供了一種華支睪吸蟲囊蚴膠體金檢測(cè)試紙條，通過(guò)檢測(cè)淡水魚血清或者體表粘液中的抗體來(lái)檢測(cè)魚體內(nèi)的囊蚴的感染。不存在取材隨機(jī)性而影響檢測(cè)結(jié)果，在試紙條保存完好的情況下，檢測(cè)結(jié)果不會(huì)受環(huán)境條件的影響。同時(shí)也不需要特殊的儀器設(shè)備，可操作性較強(qiáng)。膠體金標(biāo)記的兔淡水魚IgM抗體多克隆抗體，能夠與結(jié)合在檢測(cè)抗原處的淡水魚抗體結(jié)合，保證了該檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。本發(fā)明提供的膠體金檢測(cè)試紙條所用的到的檢測(cè)標(biāo)本(全血、血清或體表粘液)不需要像魚肉壓片法或者人工消化法那樣將魚殺死才能獲得，而僅僅是微創(chuàng)或者無(wú)創(chuàng)條件就能取得，極大的提高了檢測(cè)的便捷性。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。