一種雞新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及畜禽病毒病檢測、診斷領域，具體是涉及一種檢測雞新城疫病毒強毒株的膠體金試紙卡的制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]新城疫是由新城疫病毒引起一種禽的急性、高度傳染性疾病，主要侵害雞和火雞，亦可感染其他禽類、鳥類及人類，是世界公認的兩大最重要的禽類傳染病之一。近年來，新城疫的流行趨勢發(fā)生了變化，以發(fā)病率低、臨床癥狀不明顯、死亡率低、蛋用雞產蛋量下降為特征的非典型新城疫，使得新城疫的防治變得更加復雜和棘手，也為NDV的檢測提出了更高的要求。隨著新城疫弱毒疫苗的廣泛應用，單純對NDV檢測已不能滿足生產的需要。亟須建立一種快速區(qū)分NDV強毒株和弱毒株的檢測技術，以便有針對性地采取相應的防治措施。因此，對NDV強弱毒株的診斷鑒定十分有必要。
[0003]膠體金免疫層析技術是結合膠體金技術和免疫層析技術而建立的一種快速免疫學檢測技術，其優(yōu)點是快速、簡單、特異、靈敏、直觀和成本低等，近年來逐漸廣泛應用于獸醫(yī)學領域。單克隆抗體用于NDV診斷，具有快速、靈敏和特異性強的優(yōu)點，并可用于強毒和弱毒的鑒別診斷，這是傳統(tǒng)的血清學方法所達不到的。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種雞新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡及其制備方法，可以臨床快速檢測新城疫病毒強毒株，用于區(qū)分新城疫病毒強毒株、弱毒株的臨床診斷。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術問題的不足，所采用的技術方案如下:
[0006]1、一種雞新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡，其特征在于:
[0007]所述的雞新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡包括膠體金試紙條和扣板式卡槽；扣板式卡槽具有一個容置膠體金試紙條的內置空腔，且扣板式卡槽上設置有觀察區(qū)和加樣區(qū)；膠體金試紙條主要由支持板、NC膜(硝酸纖維素膜)、金標單克隆抗體墊、樣品墊和吸收墊組成；
[0008]所述的NC膜設置在支持板的中部，NC膜一側的支持板上依次粘貼有含有金標單克隆抗體墊和樣品墊，NC膜另一側的支持板上粘貼有吸收墊；
[0009]所述NC膜的中部有一條含有新城疫病毒強毒株多克隆抗體的檢測線和一條含有羊抗鼠二抗的質控線；
[0010]膠體金試紙條設置在卡槽的內置空腔內；卡槽的觀察區(qū)對應膠體金試紙條的顯色區(qū)，加樣孔對應膠體金試紙條的樣品墊。
[0011]所述樣品墊中金標單克隆抗體為鼠源新城疫病毒強毒株F蛋白單克隆抗體；所述NC膜中新城疫病毒強毒株抗體為兔抗新城疫病毒強毒株多克隆抗體；所述NC膜中羊抗鼠二抗為羊抗鼠IgG抗體。
[0012]2、一種制備上述的雞新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡的制備方法，其特征在于:包括以下步驟:
[0013](I)制備 NC 膜
[0014]兔抗新城疫病毒強毒株多克隆抗體的制備:采用致病因子剔除、抗原表位保留的濃縮的新城疫病毒強毒株作為免疫原，提取IgG抗體，制備多克隆抗體；
[0015]檢測線的制備:采用三維噴膜儀，調整噴液量為45?50dotS/mL/cm，用包被緩沖液稀釋兔抗新城疫病毒強毒株多克隆抗體，濃度為56?60 μ g/mL，在NC膜中適當位置劃線，即為檢測線，晾干備用；所述的包被緩沖液為經過0.40?0.45uL濾膜過濾的0.05?0.07M、ρΗ9.6的CBS緩沖液(碳酸鹽緩沖液)；
[0016]質控線的制備:采用三維噴膜儀，調整噴液量為45?48dotS/mL/cm，用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG抗體，濃度為1.6?1.8mg/mL，在NC膜上與檢測線平行的位置劃線，與檢測線間隔4?5_，即為質控線；
[0017]NC膜組裝制備:晾干檢測線和質控線，得到含有檢測線和質控線的NC膜；用封閉工作液將制備的NC膜于室溫72h晾干，封存?zhèn)溆茫凰龅姆忾]工作液為含質量百分比的2.5% BSA,2.5?3.0%脫脂奶粉和0.01M、pH7.0的CBS緩沖液混合后，用0.45?0.48 μ L濾膜過濾得到的封閉工作液。
[0018](2)制備涂覆金標單克隆抗體墊
[0019]鼠源新城疫病毒強毒株F蛋白單克隆抗體的制備:以原核表達并純化的新城疫病毒強毒株F蛋白進行小鼠免疫，ELSIA鑒定抗體效價及活性后，選取合適小鼠進行單克隆抗體的制備。用20mM含質量百分比為1.5% BSA和0.1 % NaN3、3%四硼酸鈉的稀釋緩沖液(水溶液)將金標單克隆抗體稀釋至終濃度0.05mg/ml ;裁取規(guī)格為300 X 7_的玻璃纖維棉，將金標單克隆抗體溶液用單向噴點儀，以5 μ L/cm的速度(大約20ng/條)，均勻噴灑于玻璃纖維棉上，56°C干燥lh，加入干燥劑真空密封后，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0020](3)組裝新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡
[0021]將涂有檢測線和質控線的NC膜粘貼在支持板的中部，在NC膜的一側依次粘貼含有金標單克隆抗體的玻璃纖維棉和樣品墊，在NC膜的另一側粘貼吸收墊，得到試紙板，將試紙板切割成不同寬度的試紙條，將試紙條安放于卡槽中即為新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡。
[0022](4)新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡使用及判定
[0023]新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡在診斷新城疫病毒強毒株中應用，用棉簽采集病雞眼、氣管、肛門分泌物，在稀釋液中反復擠壓棉簽讓分泌物充分溶解。將所得的稀釋液樣本滴加在本試紙卡的樣品墊中，在試紙卡的檢測線、質控線位置均出現(xiàn)紅色條帶時，新城疫病毒強毒株檢測為陽性；僅質控線出現(xiàn)一條紅色條帶時，為陰性結果；在試紙卡的質控線未出現(xiàn)紅色條帶時為無效結果。
[0024]進一步地，步驟(I)中檢測線和質控線的線寬為1mm，兩線相距4mm，位于膜的中間，距NC膜的邊距6?7_。
[0025]有益效果
[0026]本發(fā)明所述的膠體金試紙卡利用膠體金免疫層析技術，通過試紙卡中NC膜上分別噴涂含兔抗新城疫病毒強毒株多克隆抗體的檢測線和含羊抗鼠IgG抗體的質控線，能夠臨床檢測新城疫病毒強毒株，為養(yǎng)殖企業(yè)提供一種臨床診斷新城疫病毒強毒株的試紙卡，該試紙卡具有特異性強、靈敏度高、檢測快速的優(yōu)點，且不需要使用儀器設備，成本低廉，操作方便，能廣泛應用于新城疫病毒強毒株的診斷，為區(qū)分新城疫病毒強毒株、弱毒株奠定了基礎。
【附圖說明】
[0027]圖1是本發(fā)明的膠體金試紙卡的結構示意圖；
[0028]圖中:1、扣板式卡槽2、支持板，3、加樣孔4、樣品墊5、金標抗體墊6、NC膜7、觀察區(qū)8、吸收墊
【具體實施方式】
[0029]實施例1
[0030]一種雞新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡，所述的雞新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡包括膠體金試紙條和扣板式卡槽；扣板式卡槽具有一個容置膠體金試紙條的內置空腔，且扣板式卡槽上設置有觀察區(qū)和加樣區(qū)；膠體金試紙條主要由支持板、NC膜(硝酸纖維素膜)、金標單克隆抗體墊、樣品墊和吸收墊組成；
[0031]所述的NC膜設置在支持板的中部，NC膜一側的支持板上依次粘貼有含有金標單克隆抗體墊和樣品墊，NC膜另一側的支持板上粘貼有吸收墊；
[0032]所述NC膜的中部有一條含有新城疫病毒強毒株多克隆抗體的檢測線和一條含有羊抗鼠二抗的質控線；
[0033]膠體金試紙條設置在卡槽的內置空腔內；卡槽的觀察區(qū)對應膠體金試紙條的顯色區(qū)，加樣孔對應膠體金試紙條的樣品墊。
[0034]所述樣品墊中金標單克隆抗體為鼠源新城疫病毒強毒株F蛋白單克隆抗體；所述NC膜中新城疫病毒強毒株抗體為兔抗新城疫病毒強毒株多克隆抗體；所述NC膜中羊抗鼠二抗為羊抗鼠IgG抗體。
[0035]實施例2
[0036]一種雞新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡的制備方法，包括以下步驟:
[0037](I)制備 NC 膜
[0038]兔抗新城疫病毒強毒株多克隆抗體的制備:采用致病因子剔除、抗原表位保留的濃縮的新城疫病毒強毒株作為免疫原，提取IgG抗體，制備多克隆抗體；
[0039]檢測線的制備:采用三維噴膜儀，調整噴液量為45?50dotS/mL/Cm，用包被緩沖液稀釋兔抗新城疫病毒強毒株多克隆抗體，濃度為56?60 μ g/mL,在NC膜中適當位置劃線，即為檢測線，晾干備用；所述的包被緩沖液為經過0.40?0.45uL濾膜過濾的0.05?
0.07M、ρΗ9.6的CBS緩沖液(碳酸鹽緩沖液)；
[0040]質控線的制備:采用三維噴膜儀，調整噴液量為45?48dotS/mL/cm，用包被緩沖液稀釋羊抗鼠IgG抗體，濃度為1.6?1.8mg/mL，在NC膜上與檢測線平行的位置劃線，與檢測線間隔4?5_，即為質控線；
[0041]NC膜組裝制備:晾干檢測線和質控線，得到含有檢測線和質控線的NC膜；用封閉工作液將制備的NC膜于室溫72h晾干，封存?zhèn)溆茫凰龅姆忾]工作液為含質量百分比的2.5% BSA、2.5?3.0%脫脂奶粉和0.01Μ、ρΗ7.0的CBS緩沖液混合后，用0.45?0.48 μ L濾膜過濾得到的封閉工作液。
[0042](2)制備涂覆金標單克隆抗體墊
[0043]鼠源新城疫病毒強毒株F蛋白單克隆抗體的制備后，用20mM含質量百分比為1.5% BSA和0.1% NaN3、3%四硼酸鈉的稀釋緩沖液將金標單克隆抗體稀釋至終濃度
0.05mg/ml ;裁取規(guī)格為300X7mm的玻璃纖維棉，將金標單克隆抗體溶液用單向噴點儀，以5 μ L/cm的速度(大約20ng/條)，均勾噴灑于玻璃纖維棉上，56°C干燥lh，加入干燥劑真空密封后，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0044](3)組裝新城疫病毒強毒株膠體金檢測試紙卡
[0045]將涂有檢測線和質控線的NC膜粘貼在支持板的中部，在NC膜的一側依次粘貼含有金標單克隆抗體的玻璃纖維棉和樣品墊，在NC膜的另一側粘貼吸收墊，得