本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及膠體金標記檢測技術，具體涉及一種大觀霉素膠體金檢測試劑盒。

背景技術：

大觀霉素又稱壯觀霉素、奇放線菌素、壯觀菌素等，是鏈霉素所產(chǎn)生的一種由中性糖和氨基環(huán)醇一苷鍵結(jié)合而成的氨基環(huán)醇類抗生素，主要通過作用于細菌核糖體30s亞基來抑制其蛋白質(zhì)的合成，對革蘭陰性菌(如大腸埃希菌、沙門菌、布魯菌、變形菌、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌等)有較強作用，對革蘭陽性菌和支原體亦有一定作用。

大觀霉素作為一種專治淋病的抗生素，其對于家畜生長具有促進作用，現(xiàn)在已廣泛用于動物飼料領域，常作為飼料添加劑使用。但是，由于我國目前飼料行業(yè)對于添加劑使用的極不透明，加入監(jiān)管部門的監(jiān)管不力，導致飼料行業(yè)存在多種抗生素濫用的行為，導致畜牧產(chǎn)品大量抗生素殘留，被人體攝入之后，人體內(nèi)細菌產(chǎn)生抗性，對人們的身體健康造成嚴重威脅。我國獸藥典獸藥使用指南(化學藥品卷，2005版)及美國FDA均規(guī)定本品在牛、羊、豬、雞等食用組織中最高允許殘留量分別為：肌肉：500μg/kg；脂肪、肝：2000μg/kg和腎：5000μg/kg。

目前，對于大觀霉素的檢測，有理化方法和生物學方法；其中，有研究人員已經(jīng)研究出反相色譜測定法，但是存在成本高，對于設備要求嚴格的特點，不利于快速檢測；生物學方法中酶聯(lián)免疫法相關技術也已經(jīng)公開，測定的結(jié)果較為精確，但是同樣不能快速檢測，而且成本也相對較高；膠體金測定法是目前較為理想的快速測定方法，但是目前仍存在檢測不精確的特點，一方面是研究人員對于膠體金與特異性抗體結(jié)合之問題，另一方方面是外界環(huán)境對于檢測的影響。

公開號為CN 103808939A專利文獻，公開了一種“大觀霉素膠體金檢測卡”，該方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分及吸水部分。檢測反應部分上面包被有檢測用抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG1條作為參照線。該快速檢測試紙條特異性強，能夠半定量檢測，環(huán)境溫度為4-40℃都可以使用，適合于個體養(yǎng)殖戶、食品衛(wèi)生質(zhì)檢部門、海關等動物源食品進行大觀霉素殘留的快速檢測。

通過以上技術方案可知，這也是通過膠體金標記大觀霉素特異性抗體進行檢測的方法，該方案雖然可以進行檢測，但是存在兩個問題：第一，檢測卡容易受到外界因素的干擾；第二，檢測結(jié)果并不精確，實際并不能做到半定量檢測。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于：現(xiàn)有大觀霉素膠體金標記檢測方法檢測結(jié)果靈敏度不高、準確性較差的問題，本發(fā)明提供一種大觀霉素膠體金檢測試劑盒。

技術方案：

一種大觀霉素膠體金檢測試劑盒，包括試劑盒盒體，在所述盒體內(nèi)設有樣品稀釋液、一次性吸管及檢測試紙條；

其中，所述檢測試紙條包括底板、吸收墊、反應膜、吸水墊和保護套；所述吸收墊和吸水墊位于底板兩端，保護套設置在吸收墊上，不僅可以降低外界的干擾，也便于試紙條的抽??；

其中，所述檢測試紙條上反應膜上設置有NC膜檢測線和質(zhì)控線，用于檢測分析；

其中，所述NC膜檢測線包被有大觀霉素—BSA偶聯(lián)物；所述質(zhì)控線包被有大觀霉素抗抗體；

其中，所述吸收墊內(nèi)含有凍干大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物，將大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物凍干于吸收墊內(nèi)，不僅能夠方便快捷，而且也利于樣品內(nèi)大觀霉素與大膠體金標記的大觀霉素特異性抗體結(jié)合，以提高檢測結(jié)果的精確性；

其中，所述膠體金為40nm膠體金，40nm膠體金對于大觀霉素特異性抗體的結(jié)合性能更為理想，對于樣品中大觀霉素的吸收更為有效；

作為優(yōu)選，所述40nm膠體金的制備工藝為，取99單位體積的超純水在700r/min攪拌速度下加熱沸騰，加入1單位體積的1％檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱保持170s，然后加入1單位體積的0.1％氯金酸，反應15min后，直接收集，自然冷卻；制備得到的40nm膠體金清亮透明，顏色為酒紅色，顆粒大小均勻，無聚集現(xiàn)象；

作為優(yōu)選，所述稀釋液為pH7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。

作為優(yōu)選，所述試紙條上的吸收墊上還設有保護膜，用于保護吸收墊，使用時可取下；

作為優(yōu)選，所述NC膜檢測線距離吸收墊5-11mm，所述質(zhì)控線距離吸收墊12-16mm，以利于檢測結(jié)果的準確性分析。

作為優(yōu)選，所述大觀霉素-BSA偶聯(lián)物由大觀霉素抗原與BSA偶聯(lián)得到。

作為優(yōu)選，所述大觀霉素抗原由大觀霉素的四氫呋喃溶液與馬來酸酐在DMAP固體催化反應下得到。

有益效果：

本發(fā)明的檢測原理：本發(fā)明大觀霉素膠體金檢測試劑盒采用了競爭抑制免疫層析的原理，樣品中的大觀霉素在流動的過程中與膠體金標記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制抗體和NC膜檢測線上的大觀霉素—BSA偶聯(lián)物結(jié)合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。利用NC膜檢測線和質(zhì)控線的顏色變化，來快速測定大觀霉素的殘留。

本發(fā)明提供的大觀霉素膠體金檢測試劑盒，是利用膠體金進行抗生素殘留有效的檢測產(chǎn)品，與現(xiàn)有技術相比，具有檢測快速、準確、便捷的有點，而且成本較低，便于操作，非常適合畜牧產(chǎn)品的快速檢測，是一種十分理想的大觀霉素殘留檢測試劑盒。

附圖說明

圖1為本發(fā)明大觀霉素膠體金檢測試劑盒中試紙條的結(jié)構示意圖。

圖中：11、底板；12、吸收墊；13、反應膜；14、吸水墊；15、保護膜；16、NC膜檢測線；17、質(zhì)控線；18、保護套。

圖2為本發(fā)明大觀霉素膠體金檢測試劑盒中試紙條的俯視結(jié)構示意圖.

圖中：1、試紙條。

圖3為本發(fā)明大觀霉素膠體金檢測試劑盒中試紙條的檢測結(jié)果示意圖。

具體實施方式

為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權利要求的限制。

本發(fā)明一種大觀霉素膠體金檢測試劑盒，包括試劑盒盒體，在所述盒體內(nèi)設有樣品稀釋液、一次性吸管及檢測試紙條1；

其中，所述檢測試紙條1，如圖1和圖2所示，包括底板11、吸收墊12、反應膜13、吸水墊14和保護套15，吸收墊12和吸水墊14位于底板11兩端，所述吸收墊12為多層吸濾紙，吸水墊14為吸水紙；反應膜13為硝酸纖維素膜，位于吸收墊12和吸水墊14位于底板11兩端之間，在反應膜13上設置有NC膜檢測線16(T線)和質(zhì)控線17(C線)；所述NC膜檢測線16距離吸收墊12的距離為7mm，所述質(zhì)控線17距離吸收墊12的距離為15mm，

其中，所述保護套18為方形盒體，套在吸收墊12上；

其中，所述NC膜檢測線16包被有大觀霉素—BSA偶聯(lián)物；大觀霉素-BSA偶聯(lián)物由大觀霉素半抗原與BSA偶聯(lián)得到；大觀霉素半抗原是通過由大觀霉素的四氫呋喃溶液與馬來酸酐在DMAP固體催化反應下得到；

一、制備大觀霉素抗原及大觀霉素-BSA偶聯(lián)物

稱取1.6g大觀霉素溶于經(jīng)干燥后的四氫呋喃中，通氮氣保護，加入0.85g馬來酸酐在室溫下攪拌溶解，加入0.15g DMAP固體進行催化反應，用TLC薄層板(德國默克，產(chǎn)品貨號：1.05735.0001)監(jiān)測反應進行，待原料點很淺或沒有原料，停止反應；利用硅膠柱凈化，濃縮得產(chǎn)物，即制備得到大觀霉素抗原，合成線路如下：

將大觀霉素抗原溶解之后，加入到牛血清白蛋白(BSA)水溶液中，磁力攪拌器攪拌反應，透析除去未反應的小分子物質(zhì)，離心收集上清液，分裝，低溫保存?zhèn)溆茫?/p>

所述質(zhì)控線17包被有大觀霉素抗抗體；

二、制備大觀霉素抗抗體

首先，通過動物免疫法將上述制備的大觀霉素—BSA偶聯(lián)物注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生抗血清；其次，取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9：1的比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌大觀霉素單克隆抗體的大觀霉素單克隆雜交瘤細胞株；第三，將雜交瘤細胞用凍存液制成1×10⁹個/mL的細胞懸液，在液氮中長期保存；復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)；第四，增量培養(yǎng)：將雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，在37℃條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體-20℃保存。

所述細胞培養(yǎng)基為向RPMI-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為20％(質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為0.2％(質(zhì)量百分含量)；所述細胞培養(yǎng)基的pH7.4。

其中，作為優(yōu)選，所述大觀霉素抗抗體為羊抗鼠抗抗體，以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；

其中，所述吸收墊12內(nèi)含有凍干大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物，其中，所述膠體金為40nm膠體金；

本實施例大觀霉素特異性抗體選用單克隆抗體，同理適用于多克隆抗體。

三、制備膠體金及大觀霉素特異性抗體-膠體金標記物

(1)膠體金的制備

取99mL超純水加入到平底雙勁燒瓶中，利用加熱磁力攪拌器，在700r/min的攪拌速度下加熱至沸騰，加入1mL的1％檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱并保持170s，然后加入1mL的0.1％氯金酸(購于sigma公司，產(chǎn)品目錄號T09041)，反應15min后，直接收集，自然冷卻，制備得到的40nm膠體金清亮透明，顏色為酒紅色，顆粒大小均勻，無漂浮物、無聚集現(xiàn)象；

(2)大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物的制備

去100mL膠體金溶液，在磁力攪拌下，加入0.2mol/L碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金的pH值至7.0，向膠體金溶液中加入12-15mg大觀霉素單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入10％BSA，至BSA體積濃度為1％后，靜置30min；12000rpm、4℃離心30min，棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌兩次，用體積10mL的復溶緩沖液將沉淀重懸，得到的大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物溶液的濃度為50μg單抗/mL溶液，置4℃?zhèn)溆茫?/p>

其中，所述復溶緩沖液：含酪蛋白、吐溫-80的0.02mol/L、pH7.2的磷酸鹽溶液，其中酪蛋白在復溶緩沖液中的終濃度為0.05％-0.1％(體積百分含量)，吐溫-80在復溶緩沖液中的終濃度為0.05％-0.15％(質(zhì)量百分含量)。

四、大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物凍干處理

取100μL大觀霉素單克隆抗體-膠體金標記物滴加至吸收墊12上(可根據(jù)吸收墊大小選擇不同的加入量，本實施例加入100μL)放入冷凍干燥機中，凍干處理后取出，將樣品吸收墊置于BSA-磷酸鹽緩沖液在4℃下浸泡2h，滴干后，裝載在試紙條底板對應的位置；

其中，所述BSA-磷酸鹽緩沖液，為BSA終濃度為0.5％vol和pH7.2、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。

五、大觀霉素膠體金檢測試劑盒檢測分析

(1)試紙條的靈敏度

將大觀霉素標準品(德國Dr)稀釋成如下不同濃度：5μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L；所用的稀釋液為pH7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液；

分別取4試紙條進行檢測，將保護套和保護膜取下，用一次性吸管取大觀霉素標準品稀釋液滴加至試紙條吸收墊末端，滴加3至4滴，液體流動時開始計時，反應5～10min，根據(jù)示意圖判定結(jié)果，結(jié)果如下：

滴加5μg/L大觀霉素標準品稀釋液，試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性；

滴加25μg/L大觀霉素標準品稀釋液，試紙條質(zhì)控線(C)顯色，NC膜檢測線(T)不顯色，呈陽性；

滴加50μg/L大觀霉素標準品稀釋液，試紙條質(zhì)控線(C)顯色，NC膜檢測線(T)不顯色，呈陽性；

滴加100μg/L大觀霉素標準品稀釋液，試紙條質(zhì)控線(C)顯色，NC膜檢測線(T)不顯色，呈陽性；

本試紙條對大觀霉素測靈敏度為：25μg/L。

(2)特異性試驗

特異性是指抗體與結(jié)構不同的抗原決定簇發(fā)生結(jié)合的能力。

本試紙條對大觀霉素檢測靈敏度為25μg/L，將牛奶中常檢的其他藥物(新霉素、鏈霉素、慶大霉素、安普霉素、卡那霉素)用pH7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液進行稀釋，用本實施例中所述的試紙條進行檢測，結(jié)果顯示新霉素、鏈霉素、慶大霉素、安普霉素、卡那霉素在200μg/L濃度時，試紙條質(zhì)控線17和NC膜檢測線16均顯色，可以得出本實施例的試紙條1未對這些藥物發(fā)生交叉反應。

(3)大觀霉素膠體金檢測試劑盒檢測的應用

移取牛奶液100μL與100μL樣品稀釋液混勻，取出試紙條1，取下保護套18及保護膜15，用一次性吸管吸取稀釋后的樣品溶液滴加3～4滴于試紙條1上的吸收墊12上，液體流動時開始計時，反應8min，根據(jù)圖3所示示意圖判定結(jié)果；

陽性：當質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，NC膜檢測線(T)不顯色，判為陽性；

陰性：當質(zhì)控線(C)顯示一條紅色條帶，NC膜檢測線(T)同時也顯示出一條紅色條帶，判為陰性；

無效：當質(zhì)控線(C)不顯示出紅色條帶，則無論NC膜檢測線(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙均判為無效。

(4)假陰性率測定

取經(jīng)過氣相色譜法確證的陰性牛奶樣品100份，編號為1#-100#，按規(guī)定的檢測限濃度添加大觀霉素，將樣品用本發(fā)明試紙條進行檢測，計算其假陰性率。

結(jié)果顯示：在100份陽性牛奶樣品的測定中，試劑盒檢測出的陰性樣品為0份，假陰性率為0，本發(fā)明的大觀霉素膠體金檢測試劑盒可以對大觀霉素殘留進行快速精確的檢測。

對所公開的實施例的上述說明，使本領域?qū)I(yè)技術人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業(yè)技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。