本發(fā)明涉及一種貴金屬納米材料電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體是采用CeO2-CuO-NH2-Au NPs作為基底材料，Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒和硫堇作為二抗標(biāo)記物，構(gòu)建了夾心型免疫傳感器并實(shí)現(xiàn)了對玉米赤霉烯酮的特異性檢測，屬于新型生物傳感技術(shù)的發(fā)展和新型傳感方法構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
玉米赤霉烯酮作為一種真菌毒素又名F-2毒素，主要在有赤霉病的玉米中分離得到。玉米赤霉烯酮能污染玉米、小麥、小米等農(nóng)作物，同時(shí)由于它具有雌激素作用，還會(huì)影響動(dòng)物的繁殖技能甚至?xí)?dǎo)致動(dòng)物死亡。傳統(tǒng)的檢測一般都采用液相色譜、氣相色譜、質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳法等方法，但是這些方法大都存在一定的局限性，如對所需儀器設(shè)備要求過高、樣品前處理比較復(fù)雜等，而電化學(xué)傳感器具有操作簡便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，備受人們的關(guān)注。
本發(fā)明基于納米功能材料構(gòu)建了一種新型的夾心型電化學(xué)免疫傳感器，用于玉米赤霉烯酮的檢測。利用CeO2-CuO-NH2-Au NPs作為基底材料，Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒和硫堇作為二抗標(biāo)記物構(gòu)建了夾心型免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對玉米赤霉烯酮的檢測。測試結(jié)果顯示，上述方法制備的電化學(xué)免疫傳感器檢測靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高并且易于小型化，一定程度上解決了儀器設(shè)備成本問題，基于上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一是基于CeO2-CuO-NH2-Au NPs為基底材料，利用Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒和硫堇為標(biāo)記層，構(gòu)建了一種夾心型的快速超靈敏的電化學(xué)免疫傳感器。
本發(fā)明的目的之二是提供一種基于Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，該方法制備的傳感器具有穩(wěn)定性和選擇性好以及靈敏度高的特點(diǎn)。
本發(fā)明的目的之三是實(shí)現(xiàn)了所述電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建并且對玉米赤霉烯酮進(jìn)行了有效的檢測，實(shí)現(xiàn)了所述電化學(xué)免疫傳感器測定玉米赤霉烯酮的作用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
1. 一種基于Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒的玉米赤霉烯酮免疫傳感器的構(gòu)建
（1）用Al2O3拋光粉打磨直徑為4 mm的玻碳電極，超純水清洗干凈；將6 μL 1.0~1.6 mg/mL Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
（2）依次滴加6 μL 1~5 μg/mL的玉米赤霉烯酮抗體anti-ZEN，3 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% ~ 2%的BSA溶液到電極表面，超純水洗凈，室溫下晾干；
（3）滴加6 μL 10-4~100 ng/mL的一系列不同濃度的玉米赤霉烯酮到電極表面，孵化2 h，超純水沖洗，室溫下晾干；
（4）滴加6 μL Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇Th的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th，超純水沖洗，室溫下晾干，制得一種夾心型免疫傳感器。
2. Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液的制備
（1）CeO2納米棒的制備
將10~200 mg CeCl3·7H2O在磁力攪拌下溶解于1~50 mL無水乙醇中并加入1.3 mL 0.75 mol/L的H2SO4，將得到的白色懸浮液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，于10~200 °C下加熱1~50 h，將產(chǎn)物離心分離后加入到飽和氫氧化鈉醇溶液中靜置1~10天，將產(chǎn)物洗滌干燥即得到CeO2納米棒；
（2）CeO2-CuO納米棒的制備
將1~10 mg Cu(CH3COO)2·H2O溶解到16 mL乙醇中，然后將1~100 mg CeO2納米棒加入上述溶液中并在1~200 °C條件下反應(yīng)12 h，將產(chǎn)物離心分離并在80 °C下干燥1~10 h制得CeO2-CuO納米棒；
（3）Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs的制備
將制得的CeO2-CuO納米棒加入到50 mL無水乙醇中，并加入1 mL三氨丙基三乙氧基硅烷70 °C下加熱2 h，通過離心分離得到氨基化CeO2-CuO，將氨基化CeO2-CuO加入Au NPs洗滌干燥即得Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs。
3. Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th的制備
（1）Au@Ag異質(zhì)結(jié)結(jié)納米棒的制備
將1~200 mg硝酸銀、0.6 mL 20 mg/mL氯金酸及0.5640 g PDDA同時(shí)加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C條件下反應(yīng)80 h，將產(chǎn)物離心分離并用超純水洗滌即得Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒；
（2）Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th的制備
將0.5 mL 1.0 mg/mL Au@Ag 異質(zhì)結(jié)納米棒樣品溶于1.0 mL超純水中，并加入0.1 mL的玉米赤霉烯酮抗體anti-ZEN和硫堇，4 °C下振蕩1~5 h，得到的產(chǎn)物14500 rpm離心分離，固體重新分散在蒸餾水中即為Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th。
4. 玉米赤霉烯酮的檢測
（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的含有濃度為4~6 mmol/L鐵氰化鉀和10-2~10 mmol/L硝酸鉀溶液中進(jìn)行測試；
（2）用方波伏安法對玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，其電壓測試范圍為0V ~ 0.6V；
（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，通過記錄玉米赤霉烯酮加入前后的傳感器的峰電流值的變化，繪制工作曲線。
本發(fā)明的有益成果
（1）本發(fā)明的發(fā)明人首次將Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒作為二抗標(biāo)記物應(yīng)用到電化學(xué)免疫傳感器的制備當(dāng)中，Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒能夠很好的連接玉米赤霉烯酮抗體，同時(shí)具有很強(qiáng)的電子傳遞能力，使電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度得以提高。
（2）在本發(fā)明的制備方法中，將氨基化的CeO2-CuO與金納米顆粒的復(fù)合物CeO2-CuO-NH2-Au NPs作為基底材料，能夠加速電極表面的電子傳遞，并且Au易于牢固的和抗體連接，提高了傳感器的穩(wěn)定性。
（3）本發(fā)明采用硫堇作為電子媒介體，構(gòu)建了一個(gè)夾心型電化學(xué)免疫傳感器，并且對玉米赤霉烯酮進(jìn)行了有效的檢測，此方法操作簡單，耗時(shí)短且降低了成本。
（4）本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器用于玉米赤霉烯酮的檢測，該電化學(xué)傳感器穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，檢測限低，線性范圍寬，可以實(shí)現(xiàn)簡單、快速、高靈敏和特異性檢測。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 一種基于Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒的玉米赤霉烯酮免疫傳感器的構(gòu)建
（1）用Al2O3拋光粉打磨直徑為4 mm的玻碳電極，超純水清洗干凈；將6 μL1.0 mg/mL Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
（2）依次滴加6 μL 1 μg/mL的玉米赤霉烯酮抗體anti-ZEN，3 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的BSA溶液到電極表面，超純水洗凈，室溫下晾干；
（3）滴加6 μL 10-4~100 ng/mL的一系列不同濃度的玉米赤霉烯酮到電極表面，孵化2 h，超純水沖洗，室溫下晾干；
（4）滴加6 μL Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th，超純水沖洗，室溫下晾干，制得一種夾心型免疫傳感器。
實(shí)施例2 一種基于Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒的玉米赤霉烯酮免疫傳感器的構(gòu)建
（1）用Al2O3拋光粉打磨直徑為4 mm的玻碳電極，超純水清洗干凈；將6 μL 1.2 mg/mL Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
（2）依次滴加6 μL 3.5 μg/mL的玉米赤霉烯酮抗體anti-ZEN，3 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA溶液到電極表面，超純水洗凈，室溫下晾干；
（3）滴加6 μL 10-4~100 ng/mL的一系列不同濃度的玉米赤霉烯酮到電極表面，孵化2 h，超純水沖洗，室溫下晾干；
（4）滴加6 μL Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th，超純水沖洗，室溫下晾干，制得一種夾心型免疫傳感器。
實(shí)施例3 一種基于Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒的玉米赤霉烯酮免疫傳感器的構(gòu)建
（1）用Al2O3拋光粉打磨直徑為4 mm的玻碳電極，超純水清洗干凈；將6 μL1.6 mg/mL Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液滴加到電極表面，室溫下晾干成膜；
（2）依次滴加6 μL 5 μg/mL的玉米赤霉烯酮抗體anti-ZEN，3 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的BSA溶液到電極表面，超純水洗凈，室溫下晾干；
（3）滴加6 μL 10-4~100 ng/mL的一系列不同濃度的玉米赤霉烯酮到電極表面，孵化2 h，超純水沖洗，室溫下晾干；
（4）滴加6 μL Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th，超純水沖洗，室溫下晾干，制得一種夾心型免疫傳感器。
實(shí)施例4 Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液的制備
（1）CeO2納米棒的制備
將10 mg CeCl3·7H2O在磁力攪拌下溶解于1 mL無水乙醇中并加入1.3 mL 0.75 mol/L的H2SO4，將得到的白色懸浮液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，于10 °C下加熱1 h，將產(chǎn)物離心分離后加入到飽和氫氧化鈉醇溶液中靜置1天，將產(chǎn)物洗滌干燥即得到CeO2納米棒；
（2）CeO2-CuO納米棒的制備
將1 mg Cu(CH3COO)2·H2O溶解到16 mL乙醇中，然后將1 mg CeO2納米棒加入上述溶液中并在1 °C條件下反應(yīng)12 h，將產(chǎn)物離心分離并在80 °C下干燥1 h制得CeO2-CuO納米棒；
（3）Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs的制備
將制得的CeO2-CuO納米棒加入到50 mL無水乙醇中，并加入1 mL三氨丙基三乙氧基硅烷70 °C下加熱2 h，通過離心分離得到氨基化CeO2-CuO，將氨基化CeO2-CuO加入Au NPs洗滌干燥即得Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs。
實(shí)施例5 Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液的制備
（1）CeO2納米棒的制備
將145 mg CeCl3·7H2O在磁力攪拌下溶解于20 mL無水乙醇中并加入1.3 mL0.75 mol/L的H2SO4，將得到的白色懸浮液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，于130 °C下加熱23 h，將產(chǎn)物離心分離后加入到飽和氫氧化鈉醇溶液中靜置5天，將產(chǎn)物洗滌干燥即得到CeO2納米棒；
（2）CeO2-CuO納米棒的制備
將6 mg Cu(CH3COO)2·H2O溶解到16 mL乙醇中，然后將60 mg CeO2納米棒加入上述溶液中并在150 °C條件下反應(yīng)12 h，將產(chǎn)物離心分離并在80 °C下干燥5 h制得CeO2-CuO納米棒；
（3）Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs的制備
將制得的CeO2-CuO納米棒加入到50 mL無水乙醇中，并加入1 mL三氨丙基三乙氧基硅烷70 °C下加熱2 h，通過離心分離得到氨基化CeO2-CuO，將氨基化CeO2-CuO加入Au NPs洗滌干燥即得Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs。
實(shí)施例6 Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs分散液的制備
（1）CeO2納米棒的制備
將200 mg CeCl3·7H2O在磁力攪拌下溶解于50 mL無水乙醇中并加入1.3 mL0.75 mol/L的H2SO4，將得到的白色懸浮液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，于200 °C下加熱50 h，將產(chǎn)物離心分離后加入到飽和氫氧化鈉醇溶液中靜置10天，將產(chǎn)物洗滌干燥即得到CeO2納米棒；
（2）CeO2-CuO納米棒的制備
將10 mg Cu(CH3COO)2·H2O溶解到16 mL乙醇中，然后將100 mg CeO2納米棒加入上述溶液中并在200 °C條件下反應(yīng)12 h，將產(chǎn)物離心分離并在80 °C下干燥10 h制得CeO2-CuO納米棒；
（3）Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs的制備
將制得的CeO2-CuO納米棒加入到50 mL無水乙醇中，并加入1 mL三氨丙基三乙氧基硅烷70 °C下加熱2 h，通過離心分離得到氨基化CeO2-CuO，將氨基化CeO2-CuO加入Au NPs洗滌干燥即得Au納米顆粒雜化氨基化CeO2-CuO納米棒CeO2-CuO-NH2-Au NPs。
實(shí)施例7 Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th的制備
（1）Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒的制備
將1 mg硝酸銀、0.6 mL 20 mg/mL氯金酸及0.5640 g PDDA同時(shí)加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C條件下反應(yīng)80 h，將產(chǎn)物離心分離并用超純水洗滌即得Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒；
（2）Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th的制備
將0.5 mL 1.0 mg/mL Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒樣品溶于1.0 mL超純水中，并加入0.1 mL的玉米赤霉烯酮抗體anti-ZEN和硫堇，4 °C下振蕩1 h，得到的產(chǎn)物14500 rpm離心分離，固體重新分散在蒸餾水中即為Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th。
實(shí)施例8 Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th的制備
（1）Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒的制備
將140 mg硝酸銀、0.6 mL 20 mg/mL氯金酸及0.5640 g PDDA同時(shí)加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C條件下反應(yīng)80 h，將產(chǎn)物離心分離并用超純水洗滌即得Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒；
（2）Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th的制備
將0.5 mL 1.0 mg/mLAu@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒樣品溶于1.0 mL超純水中，并加入0.1 mL的玉米赤霉烯酮抗體anti-ZEN和硫堇，4 °C下振蕩3 h，得到的產(chǎn)物14500 rpm離心分離，固體重新分散在蒸餾水中即為Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th。
實(shí)施例9 Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th的制備
（1）Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒的制備
將200 mg硝酸銀、0.6 mL 20 mg/mL氯金酸及0.5640 g PDDA同時(shí)加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C條件下反應(yīng)80 h，將產(chǎn)物離心分離并用超純水洗滌即得Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒；
（2）Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th的制備
將0.5 mL 1.0 mg/mLAu@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒樣品溶于1.0 mL超純水中，并加入0.1 mL的玉米赤霉烯酮抗體anti-ZEN和硫堇，4 °C下振蕩5 h，得到的產(chǎn)物14500 rpm離心分離，固體重新分散在蒸餾水中即為Au@Ag異質(zhì)結(jié)納米棒負(fù)載硫堇的二抗標(biāo)記物Au@Ag@Ab2@Th。
實(shí)施例10 玉米赤霉烯酮的檢測
（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的含有濃度為4 mmol/L鐵氰化鉀和10-2 mmol/L硝酸鉀溶液中進(jìn)行測試；
（2）用方波伏安法對玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，其電壓測試范圍為0V ~ 0.6V；
（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，通過記錄玉米赤霉烯酮加入前后的傳感器的峰電流值的變化，繪制工作曲線。
實(shí)施例11 玉米赤霉烯酮的檢測
（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的含有濃度為5 mmol/L鐵氰化鉀和1 mmol/L硝酸鉀溶液中進(jìn)行測試；
（2）用方波伏安法對玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，其電壓測試范圍為0V ~ 0.6V；
（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，通過記錄玉米赤霉烯酮加入前后的傳感器的峰電流值的變化，繪制工作曲線。
實(shí)施例12 玉米赤霉烯酮的檢測
（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的免疫傳感器為工作電極，在10 mL的含有濃度為6 mmol/L鐵氰化鉀和10 mmol/L硝酸鉀溶液中進(jìn)行測試；
（2）用方波伏安法對玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，其電壓測試范圍為0V ~ 0.6V；
（3）當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，通過記錄玉米赤霉烯酮加入前后的傳感器的峰電流值的變化，繪制工作曲線。