本發(fā)明涉及一種檢測EGFRvⅢ的免疫組化抗體試劑及檢測方法，屬于腫瘤標(biāo)志臨床應(yīng)用與研究領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)分子量為170kD，屬于受體酪氨酸激酶的Eb r B家族，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成，其正?；罨山閷?dǎo)細(xì)胞的生長、增殖、分化、黏附以及移動等活動。許多上皮源性腫瘤與EGFR活性增加或異常有關(guān)。EGFR通常在人類不同腫瘤中過表達(dá)，而且EGFR的過表達(dá)與某些腫瘤的惡性程度相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中，EGFR蛋白的表達(dá)不是很穩(wěn)定，常常出現(xiàn)基因的擴(kuò)增和重排，導(dǎo)致基因突變使得腫瘤細(xì)胞表面的抗原表型發(fā)生調(diào)變。現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)EGFR存在3種胞外型突變體,即EGFRvⅠ、EGFRvⅡ和EGFRvⅢ,與這些突變的受體結(jié)合后的EGFR信號通路通常異常激活,引起細(xì)胞異常增殖。其中EGFRvⅢ是人類腫瘤中最為常見的突變形式。

EGFRvⅢ與EGFR完整結(jié)構(gòu)比較，EGFRvⅢ分子量為130kD，26個(gè)外顯子中第2～7個(gè)外顯子被刪除，導(dǎo)致801個(gè)堿基對缺失，其刪除端由一個(gè)新的甘氨酸密碼子(GGT)連接，翻譯成蛋白質(zhì)后，胞外區(qū)6～273氨基酸被一個(gè)甘氨酸殘基替代。喪失了胞外配體結(jié)合部位的EGFRvⅢ可在沒有配體結(jié)合的情況下組成性激活酪氨酸激酶，產(chǎn)生自體磷酸化，誘發(fā)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起級聯(lián)反應(yīng)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。

迄今為止，EGFRvⅢ尚未在正常組織中檢出，被視為惡性腫瘤特異性表達(dá)的EGFR突變體，在腦膠質(zhì)瘤(陽性率30～50％)、肺癌(陽性率39％)、乳腺癌(陽性率20～36％)、卵巢癌(陽性率75％)、頭頸部癌(陽性率42％)、結(jié)腸癌(陽性率34％)、前列腺(陽性率100％)、肝癌(陽性率36.8％)、胃癌(陽性率35.2％))等均有發(fā)現(xiàn)。EGFRvⅢ只在腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)，而在正常組織細(xì)胞不表達(dá)，所以它是一種很好的腫瘤特異抗原，這使EGFRvⅢ成為一個(gè)很好的腫瘤治療的靶標(biāo)。EGFRvⅢ與腫瘤患者預(yù)后也有一定關(guān)系，腫瘤組織EGFRvⅢ的表達(dá)水平是判斷預(yù)后的獨(dú)立指征，EGFRvⅢ表達(dá)高者預(yù)后差。

如何準(zhǔn)確、快速的檢測出各腫瘤組織EGFRvⅢ的表達(dá)情況是靶向免疫治療的關(guān)鍵因素。目前，檢測EGFRvⅢ的表達(dá)情況主要采用的方法有直接測序法、實(shí)時(shí)定量PCR法及組織免疫組化法等方法。這些方法各有優(yōu)勢，但存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長、成本相對較大、特異性差等不足之處，尚有改進(jìn)的必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種檢測EGFRvⅢ的免疫組化抗體試劑，以及檢測方法。利用免疫組化法檢測EGFRvⅢ在腫瘤的表達(dá)，EGFRvⅢ蛋白的陽性染色定位主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿上，表現(xiàn)為棕黃色顆粒；結(jié)果采用半定量積分法，每張切片由2位閱片者在盲態(tài)情況下判讀，此結(jié)果可以作為臨床醫(yī)生的診斷依據(jù)之一，為臨床腫瘤的診斷起預(yù)后判斷的作用，幫助臨床腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及療效評估。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種檢測EGFRvⅢ的免疫組化抗體試劑，包括抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體(抗體原液)和抗體稀釋液；所述抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體，其制備方法記載在文獻(xiàn)Oncotarget.2016 Dec 22.doi:10.18632/oncotarget.14088.中；所述抗體稀釋液，主要成分為Tris緩沖液(pH 7.2)，并含有NaN3和蛋白質(zhì)，由博士德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，其商品貨號為AR1016，商品名稱抗體稀釋液。

進(jìn)一步地，所述抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體(抗體原液)與抗體稀釋液的體積比為1:1～5000，優(yōu)選1:1000～1:4000。

一種檢測EGFRvⅢ的方法(免疫組化法)，為：利用上述檢測EGFRvⅢ的免疫組化抗體試劑，通過免疫組化方法檢測待檢測標(biāo)本組織(為手術(shù)或穿刺的腫瘤組織經(jīng)處理后得到)中的EGFRvⅢ的表達(dá)情況，檢測結(jié)果可以作為臨床醫(yī)生的診斷依據(jù)之一，為臨床腫瘤的診斷起預(yù)后判斷的作用，幫助臨床腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及療效評估(具體實(shí)施治療方案還需再參考患者的臨床表現(xiàn)情況)。

進(jìn)一步地，所述檢測結(jié)果為EGFRvⅢ的表達(dá)值，是通過以下免疫組化的評分方法得出的：EGFRvⅢ的表達(dá)值＝細(xì)胞膜染色強(qiáng)度分值×細(xì)胞膜染色分值+細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度分值×細(xì)胞質(zhì)染色分值。所述細(xì)胞膜染色強(qiáng)度分值為在細(xì)胞膜上染色強(qiáng)度的分值，所述細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度分值為在細(xì)胞質(zhì)上染色強(qiáng)度的分值；所述染色強(qiáng)度的分值打分依據(jù)為：未染色＝0，弱染色＝1，中等染色＝2，強(qiáng)染色＝3。所述細(xì)胞膜染色分值的打分依據(jù)為：細(xì)胞膜染色細(xì)胞數(shù)0％～5％對應(yīng)的分值為0；細(xì)胞膜染色細(xì)胞數(shù)6％～25％對應(yīng)的分值為1；細(xì)胞膜染色細(xì)胞數(shù)26％～50％對應(yīng)的分值為2；細(xì)胞膜染色細(xì)胞數(shù)51％～100％對應(yīng)的分值為3。所述細(xì)胞質(zhì)分值的打分依據(jù)為：為細(xì)胞質(zhì)染色細(xì)胞數(shù)0％～5％對應(yīng)的分值為0；細(xì)胞質(zhì)染色細(xì)胞數(shù)6％～25％對應(yīng)的分值為1；細(xì)胞質(zhì)染色細(xì)胞數(shù)26％～50％對應(yīng)的分值為2；細(xì)胞質(zhì)染色細(xì)胞數(shù)51％～100％對應(yīng)的分值為3。當(dāng)EGFRvⅢ的表達(dá)值在4分以上時(shí)，判斷為“EGFRvⅢ表達(dá)為陽性”，當(dāng)EGFRvⅢ的表達(dá)值小于4分時(shí)，判斷為“EGFRvⅢ表達(dá)為陰性”(未染色、弱染色、中等染色、強(qiáng)染色的判斷，細(xì)胞膜染色細(xì)胞數(shù)的判斷，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的常規(guī)實(shí)驗(yàn)技能)。

所述抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體是由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部研制開發(fā)(本申請的申請人與其合作，參與研制開發(fā)；該抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體，相關(guān)內(nèi)容已經(jīng)發(fā)表文章，其文獻(xiàn)信息為：Oncotarget.2016Dec 22.doi:10.18632/oncotarget.14088.，分子量為150KD，為IgG2a亞型。該抗體是抗人EGFRvⅢ蛋白的小鼠單克隆抗體，可與組織細(xì)胞上的EGFRvⅢ抗原特異性結(jié)合，并與酶標(biāo)羊抗小鼠免疫球蛋白聚合物識別并結(jié)合，通過免疫組織化學(xué)染色，使組織切片中抗原位點(diǎn)上出現(xiàn)黃色或棕黃色著色，使用光學(xué)顯微鏡可觀察組織片中EGFRvⅢ的表達(dá)情況。

本發(fā)明在抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體的基礎(chǔ)上，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)篩選得到了效果最佳的抗體稀釋液(研制出抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體后并不意味著其可以直接作為抗體試劑工作液進(jìn)行應(yīng)用，合適的抗體稀釋液也是優(yōu)質(zhì)的免疫組化產(chǎn)品的關(guān)鍵)，開發(fā)出了EGFRvⅢ免疫組化抗體試劑工作液，其與野生型EGFR無交叉反應(yīng)，具有特異性強(qiáng)、敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，為EGFRvⅢ的靶向治療提供了良好的前提和基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1：抗體與不同抗體稀釋液組合成工作液后免疫組化檢測結(jié)果示意圖，其中，a：博士德(AR1016)；b：北京中衫金橋(ZLI-9028)；c：福州邁新(ABD-0030)；d：丹麥Dako(K8007)。圖中央下部的字為：F98_EGFRvⅢ。

圖2：腦膠質(zhì)瘤的免疫組化切片，其中，1：星形細(xì)胞瘤Ⅱ級；2：少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅱ級；3：間變性星形細(xì)胞瘤Ⅲ級；4：間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅲ級；5：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。

圖3：不同惡性級別的腦膠質(zhì)瘤中EGFRvⅢ表達(dá)情況，其中，A：EGFRvⅢ表達(dá)與組織學(xué)類型；B：EGFRvⅢ表達(dá)與WHO分級。

圖4：EGFRvⅢ與ATRX，MIB1，IDH1R132，突變P53在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)的相關(guān)性。

圖5：抗EGFRvⅢ單克隆抗體的western-blot圖，其中，從左至右的條帶分別代表F98、F98_EGFR、F98_EGFRvIII、U251、U251_EGFRvIII。

圖6：EGFR和EGFRvⅢRT-PCR跑膠及測序分析，其中，1:F98；2:F98_EGFR；3:F98_EGFRvIII；4:U251；5:U251_EGFRvIII。

圖7：現(xiàn)有的靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗體的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

圖8：抗EGFRvⅢ的單克隆抗體的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測方法等。

實(shí)施例1抗體稀釋液的篩選

免疫組化試驗(yàn)步驟：組織片在60℃烤箱烤40分鐘后，在二甲苯中浸泡10分鐘，從而去除石蠟，然后通過在100％乙醇內(nèi)浸泡2分鐘兩次，然后在95％的乙醇溶液內(nèi)浸泡2分鐘兩次，在85％的乙醇溶液內(nèi)浸泡2分鐘和在75％的乙醇溶液內(nèi)浸泡2分鐘，進(jìn)行水化，最后用蒸餾水洗滌2分鐘，共計(jì)5次。

在高壓鍋內(nèi)加入膜抗原修復(fù)液(225ml雙蒸水:4.5ml檸檬酸:20.5ml檸檬酸三鈉)，高壓鍋開蓋在電磁爐上將組織抗原修復(fù)液加熱至沸騰，將切片全部浸沒入修復(fù)液中，蓋上鍋蓋，高壓2分后將高壓鍋離火自然冷卻至室溫后取出切片，PBS溶液清洗5次，每次2分鐘。通過新鮮配置過氧化物酶阻斷液(30％H₂O₂:雙蒸水＝1:9)37℃烘箱孵育30分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS溶液清洗5次，每次2分鐘。小心甩掉并拭去組織上及周圍過多的液體，在免疫組化筆圈定的組織區(qū)域內(nèi)加100ul5％山羊血清37℃孵育30分鐘，以封閉非特異性抗原。

勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育1～2小時(shí)或4℃過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2分鐘，共5次。滴加適量辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液Dako K5007，37℃孵育30分鐘。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2分鐘，共5次。經(jīng)顯色劑顯色1～2分鐘，鏡下觀察適時(shí)終止顯色，蘇木素染核1分鐘，自來水沖洗多余的蘇木素后，再經(jīng)脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察并拍片。

所述一抗工作液由一抗(實(shí)施例7制備，濃度5.3μg/μl)和抗體稀釋液組成，二者體積比1:2000。

所用一抗是由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部研制開發(fā)的(本申請的申請人與其合作，參與研制開發(fā)；該抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體，相關(guān)內(nèi)容已經(jīng)發(fā)表文章，其文獻(xiàn)信息為：Oncotarget.2016Dec 22.doi:10.18632/oncotarget.14088.，分子量為150KD，為IgG2a亞型。

本實(shí)施例考察了四種抗體稀釋液，分別為：北京中衫金橋(ZLI-9028)、福州邁新(ABD-0030)、博士德(AR1016)、丹麥Dako(K8007)。

顯微鏡拍片結(jié)果如圖1所示，由圖可見，由博士德(AR1016)組合的抗體工作液，背景干凈，染色清晰，特異性強(qiáng)，敏感度高，而其他三種抗體稀釋液組合的抗體工作液均顯現(xiàn)出交叉反應(yīng)。因此，博士德(AR1016)是最適合抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體的抗體稀釋液。

F98_EGFRvⅢ和F98細(xì)胞分別是EGFRvⅢ蛋白表達(dá)陽性和陰性的褐鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

實(shí)施例2通過免疫組化的方法獲得可供讀取的病理片

首先將手術(shù)或者穿刺獲得的腫瘤標(biāo)本固定在10％福爾馬林中，接著用梯度濃度的乙醇進(jìn)行充分脫水，脫水后的組織再經(jīng)二甲苯透明和石蠟透蠟，之后用石蠟包埋，待蠟塊凝固后，切成3μm厚的片子。免疫組化試驗(yàn)步驟可按實(shí)施例1執(zhí)行。

計(jì)算組織病理片中的EGFRvⅢ的表達(dá)值。

EGFRvⅢ的表達(dá)值＝細(xì)胞膜染色強(qiáng)度分值×細(xì)胞膜染色分值+細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度分值×細(xì)胞質(zhì)染色分值。所述細(xì)胞膜染色強(qiáng)度分值為在細(xì)胞膜上染色強(qiáng)度的分值，所述細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度分值為在細(xì)胞質(zhì)上染色強(qiáng)度的分值；所述染色強(qiáng)度的分值打分依據(jù)為：未染色＝0，弱染色＝1，中等染色＝2，強(qiáng)染色＝3。所述細(xì)胞膜染色分值的打分依據(jù)為：細(xì)胞膜染色細(xì)胞數(shù)0％～5％對應(yīng)的分值為0；細(xì)胞膜染色細(xì)胞數(shù)6％～25％對應(yīng)的分值為1；細(xì)胞膜染色細(xì)胞數(shù)26％～50％對應(yīng)的分值為2；細(xì)胞膜染色細(xì)胞數(shù)51％～100％對應(yīng)的分值為3。所述細(xì)胞質(zhì)分值的打分依據(jù)為：為細(xì)胞質(zhì)染色細(xì)胞數(shù)0％～5％對應(yīng)的分值為0；細(xì)胞質(zhì)染色細(xì)胞數(shù)6％～25％對應(yīng)的分值為1；細(xì)胞質(zhì)染色細(xì)胞數(shù)26％～50％對應(yīng)的分值為2；細(xì)胞質(zhì)染色細(xì)胞數(shù)51％～100％對應(yīng)的分值為3。當(dāng)EGFRvⅢ的表達(dá)值在4分以上時(shí)，判斷為“EGFRvⅢ表達(dá)為陽性”，當(dāng)EGFRvⅢ的表達(dá)值小于4分時(shí)，判斷為“EGFRvⅢ表達(dá)為陰性”。

經(jīng)計(jì)算，本實(shí)施例中，EGFRvⅢ的表達(dá)值為≥4，確定患者EGFRvⅢ表達(dá)為陽性。本發(fā)明EGFRvⅢ定位清晰，EGFRvⅢ只在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿上檢測出陽性表達(dá)，并且本發(fā)明中使用抗EGFRvⅢ單克隆抗體效價(jià)高，具有靈敏度高，特異性好的特點(diǎn)。

為了進(jìn)一步確立本研究建立檢測方法的診斷價(jià)值，在臨床上進(jìn)行驗(yàn)證。

實(shí)施例3診斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

收集北京三博腦科醫(yī)院自2011年～2016年手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本99例，其中男性53例，女性46例，年齡17～69歲，中位年齡43歲?；颊咝g(shù)前均未行放化療等任何治療，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診的石蠟包埋病理組織標(biāo)本，其中星形細(xì)胞瘤II級、間變性星形細(xì)胞瘤Ⅲ級、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤II級和間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤Ⅲ級均20例,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤19例(組織切片如圖2所示)。通過免疫組化常規(guī)方法使用實(shí)施例1中的抗體工作液(抗體稀釋液為博士德(AR1016))檢測患者腫瘤標(biāo)本的EGFRvⅢ，結(jié)果如表1、圖3所示，根據(jù)公式計(jì)算出每個(gè)病理片中EGFRvⅢ的表達(dá)值(見實(shí)施例2)。

以EGFRvⅢ的表達(dá)值在4分及4分以上確定為患者EGFRvⅢ表達(dá)為陽性，當(dāng)EGFRvⅢ的表達(dá)值小于4(不包含4)，表示患者的EGFRvⅢ表達(dá)為陰性。根據(jù)表1和圖3所示：99例腦膠質(zhì)瘤EGFR陽性率為(54)54％，其中星形II級和少突II級陽性率占40％(16/40)。星形Ⅲ級和少突Ⅲ級陽性率占55％(22/40)。膠母細(xì)胞瘤陽性率占80％(16/20)。相似的，患者表達(dá)EGFRvⅢ占總數(shù)的34(34％)，其中星形II級和少突II級陽性率占22.5％(9/40)。星形Ⅲ級和少突Ⅲ級陽性率占30％(12/40)。膠母細(xì)胞瘤陽性率占65％(13/20)。由此可見，EGFR高表達(dá)患者中，EGFRvⅢ陽性表達(dá)占62.96％。且EGFR和EGFRvⅢ陽性著色部位主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。患者腦膠質(zhì)瘤的惡性級別與EGFR及EGFRvⅢ的陽性率呈正相關(guān)(both P<0.01)。

為了闡明EGFRvⅢ在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的臨床意義，我們比較EGFRvⅢ表達(dá)與臨床病理特征，包括年齡，性別，組織學(xué)類型，WHO級別，TP53突變，MIB1表達(dá)，IDH1R132突變狀態(tài)和ATRX表達(dá)(表2)。EGFRvⅢ表達(dá)與組織學(xué)類型(P<0.001，圖3A)和WHO分級(P＝0.001，圖3B)呈正相關(guān)。此外，TP53突變狀態(tài)，ATRX表達(dá)和MIB1表達(dá)被報(bào)告為膠質(zhì)瘤患者的不利的預(yù)后指標(biāo)。我們的結(jié)果還表明EGFRvⅢ表達(dá)與這些指標(biāo)正相關(guān)(所有P<0.05，表32，圖4)。IDH1R132突變在低級膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性成膠質(zhì)細(xì)胞中是常見的，并且具有該突變的試劑具有更長的存活時(shí)間。本發(fā)明證實(shí)所有腦膠質(zhì)瘤均為原發(fā)性腫瘤且IDH1R132突變?yōu)殛幮?。EGFRvⅢ表達(dá)與IDH1R132突變狀態(tài)負(fù)相關(guān)(P＝0.031)。這些結(jié)果表明EGFRvⅢ趨向是侵略性人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤的不利因素。

表1 EGFR和EGFRvⅢ在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

表2腦膠質(zhì)瘤患者EGFRvⅢ表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

實(shí)施例4抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體的western-blot鑒定

提取各細(xì)胞總蛋白，Bradford法定量。上樣后10％SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下用5％的脫脂奶粉封閉2h后滴加相應(yīng)一抗4℃過夜，洗膜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫2h,漂洗后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，攝像。實(shí)驗(yàn)過程中使用能夠同時(shí)識別EGFR和EGFRvⅢ蛋白的EGFR抗體和只識別EGFRvⅢ蛋白的EGFRvⅢ抗體。此實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠糜阼b定細(xì)胞系F98、F98_EGFR、F98_EGFRvⅢ、U251和U251_EGFRvⅢ中的EGFRvⅢ蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。

結(jié)果如圖5所示，本發(fā)明的單克隆抗體western-blot鑒定結(jié)果，通過western-blot鑒定，單克隆抗體特異性地與EGFRvⅢ蛋白結(jié)合，且與野生型EGFR無交叉反應(yīng)。其中，M是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)。F98_EGFRvⅢ、F98_EGFR和F98三種細(xì)胞分別是EGFRvⅢ蛋白表達(dá)陽性、陰性和陰性的褐鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。U251是表達(dá)野生型EGFR陽性，U251_EGFRvⅢ是表達(dá)EGFRvⅢ蛋白陽性的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，均購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心，穩(wěn)轉(zhuǎn)U251_EGFRvⅢ細(xì)胞。

實(shí)施例5反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及DNA測序分析

RT-PCR反應(yīng)可以更好驗(yàn)證wild-typ EGFR和EGFRvⅢ的表達(dá)。Total-RNA從細(xì)胞提取后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR-system擴(kuò)增目的片段。用于RT-PCR反應(yīng)的EGFR和EGFRvⅢ引物序列為同一序列：(Forward)5'-CTT CGG GGA GCA GCG ATG CGA C-3'和(Reverse)5'-ACC AAT ACC TAT TCC GTT ACA C-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃1min；95℃15s、60℃15s、72℃30s、72℃7min、4℃∞,共40個(gè)循環(huán)。同時(shí)Gapdh作為內(nèi)參。待反應(yīng)結(jié)束后2％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測序驗(yàn)證。每個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，經(jīng)測序圖比較，判斷對應(yīng)樣本是否發(fā)生基因突變，并且排除是基因多態(tài)性的情況。

結(jié)果如圖6所示，本發(fā)明的RT-PCR跑膠結(jié)果顯示：F98_EGFR和U251細(xì)胞均檢測到EGFR基因表達(dá)(1044bp)，F(xiàn)98_npEGFRvⅢ細(xì)胞檢測到EGFRvⅢ基因表達(dá)(243bp),而U251_EGFRvⅢ細(xì)胞同時(shí)表達(dá)EGFR(1044bp)和EGFRvⅢ(243bp)基因。正常F98細(xì)胞系未檢測到任何基因表達(dá)。測序圖譜也可以清楚的觀察到突變型EGFRvⅢ的突變位點(diǎn)。

實(shí)施例6抗EGFRvⅢ的單克隆抗體與現(xiàn)有的EGFRvⅢ的兔源多克隆抗體的免疫熒光實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)有的靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗體的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，本發(fā)明中抗EGFRvⅢ的單克隆抗體的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。市場上的靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗體的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，該靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗體的特異性較差，該靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗體除能夠結(jié)合EGFRvⅢ外，亦能結(jié)合野生型F98EGFR。該靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗體與野生型F98EGFR存在交叉反應(yīng)。本發(fā)明的抗EGFRvⅢ的單克隆抗體具有良好的靶標(biāo)特異性，其只與EGFRvⅢ結(jié)合，且不和野生型F98EGFR結(jié)合，該抗EGFRvⅢ的單克隆抗體與野生型F98EGFR無交叉反應(yīng)。因此，本發(fā)明中使用的抗EGFRvⅢ的單克隆抗體的特異性好，可以很好的特異性的與EGFRvⅢ結(jié)合。

實(shí)施例7抗EGFR突變體Ⅲ單克隆抗體的制備(記載在文獻(xiàn)Oncotarget.2016Dec 22.doi:10.18632/oncotarget.14088.中)

(一)雜交瘤細(xì)胞系的建立

步驟一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：

1、免疫原：以EGFRvⅢ為靶目標(biāo)，采用化學(xué)合成的方式制備三條氨基酸多肽，其中三條氨基酸多肽的序列分別為LEEKKGNYVVTDHC；EKKGNYVVTDHC；KKGNYVVTDHC。每條氨基酸多肽的純度要求大于90％，三條多肽與KLH偶聯(lián)制備成免疫原。

2、培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司；HAT、HT選擇培養(yǎng)基、降植烷購于sigma公司。

3、實(shí)驗(yàn)動物：三只Balb/c小鼠分別編號為：1#、2#、3#，均為8-12周齡，雌性，SPF級動物培養(yǎng)。

4、其他材料：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑購于Sigma公司；PEG4000購于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗體購于Jackson Immune公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

步驟二、動物免疫

1)基礎(chǔ)免疫：將抗原與福氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，分點(diǎn)皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量為80-120μg，較佳的為100μg。

2)加強(qiáng)免疫：加強(qiáng)免疫采用抗原與福氏不完全佐劑的乳化液。在進(jìn)行細(xì)胞融合前3天，經(jīng)腹腔注射含100-200ug抗原的生理鹽水溶液，較佳的為150ug抗原的生理鹽水溶液。

3)尾血檢測：取免疫小鼠的尾血進(jìn)行間接ELISA法檢測。間接ELISA法的操作步驟如下：各取三條多肽100ng的包板，以三只免疫后的小鼠的尾血作為一抗進(jìn)行孵育，之后每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG 100μl，最后測定450nm OD值。

結(jié)果：以2#免疫小鼠的尾血作為一抗對所有的三條多肽反應(yīng)的450nm OD讀值為最高。因此選用2#免疫小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的制備。

步驟三、雜交瘤細(xì)胞的制備

按常規(guī)方法收集小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按20:1至5：1的比例以400-600g/L的PEG4000進(jìn)行融合。小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的比例，較佳的為10:1，PEG4000較佳的濃度為500g/L。用HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，融合后10～15天，取上清采用間接ELISA法篩選分泌抗抗原的雜交瘤細(xì)胞株。對所得陽性克隆雜交瘤細(xì)胞株采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。間接ELISA法的操作步驟如下：各取三條多肽100ng的包板，用免疫小鼠尾血1:2000作為陽性對照，無克隆生長的培養(yǎng)基上清和正常小鼠血清作為陰性對照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG 100μl，最后測定450nm OD值。凡OD₄₅₀值大于陰性對照2倍以上者，即可初步判定為陽性克隆。

步驟四、雜交瘤細(xì)胞系的建立

重復(fù)步驟2，進(jìn)行2次細(xì)胞融合，經(jīng)過4次亞克隆和間接ELISA篩選，得到4株穩(wěn)定分泌抗EGFR突變體Ⅲ(EGFRvⅢ)的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，四株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的編號分別：4G1、4D12、7C7、1G8。

步驟五、應(yīng)用上述雜交瘤細(xì)胞系所得單抗的效價(jià)檢測

1)細(xì)胞培養(yǎng)液上清效價(jià)測定：間接ELISA法檢測上述雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為：1：50000～1：100000。其中以4G1的信號最強(qiáng)。

2)小鼠腹水效價(jià)測定：間接ELISA法檢測上述雜交瘤細(xì)胞制備的腹水效價(jià)為：1：500000～1：1000000。其中以4G1的信號最強(qiáng)。

步驟六、雜交瘤細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)

將上述雜交瘤細(xì)胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，培養(yǎng)到10代后，雜交瘤細(xì)胞系仍然能夠生長良好、穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)液上清效價(jià)仍然可以達(dá)到1:10000以上。本發(fā)明所得雜交瘤細(xì)胞系能夠穩(wěn)定傳代，可以持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗EGFRvⅢ的單克隆抗體。

獲得產(chǎn)生所需的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞后，將一部分雜交瘤細(xì)胞保存。保存方法如下：準(zhǔn)備材料，細(xì)胞：取對數(shù)生長期的細(xì)胞；10％二甲基亞砜保護(hù)液(二甲基亞砜能損壞濾器，而又被高壓所破壞，所以不能過濾或高壓消毒。其本身就是毒品，無菌)：含10％二甲基亞砜、20％滅活胎牛血清，70％RPMI-1640液；20％FBS-1640培養(yǎng)液：含青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml；滅菌的2ml安瓶等。

2、操作方法，(1)去掉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的舊的培養(yǎng)液，加入10％FBS-1640液，使細(xì)胞懸浮。(2)1000rpm/min離心10min，去上清。細(xì)胞沉淀用10％二甲基亞砜保護(hù)液制成懸液，使成1.0×10⁷細(xì)胞/ml。(3)取樣，臺盼蘭染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞，應(yīng)在95％以上。(4)用注射器將細(xì)胞分裝安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。(5)放4℃×2h。(6)放液氮罐氣態(tài)部分(-70℃)15h。(7)轉(zhuǎn)入液氮部分。

(二)抗EGFRvⅢ的單克隆抗體的制備

選擇成年BALB/c小鼠，腹腔接種降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接種編號為4G1的雜交瘤細(xì)胞，每只小鼠1×10⁶～2×10⁶個(gè)。間隔5天后，待腹部明顯膨大，以手觸摸時(shí)，皮膚有緊張感，即可用9號針頭采集腹水。

將腹水離心(13000rpm/min 30分鐘)，除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G-Sepharose CL-4B進(jìn)行純化，上柱液為20mM的PBS緩沖液，柱層析洗脫液為：pH＝2.7，20mM的甘氨酸緩沖液，得到抗EGFRvⅢ的單克隆抗體原液(濃度5.3μg/μl)。

附：部分縮略語、英文和關(guān)鍵術(shù)語定義：

EGFR：epidermal growth factor receptor。

EGFRvⅢ：epidermal growth factor receptor variantⅢ。

PBS：磷酸鹽緩沖液。

術(shù)語“免疫組化”指的是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對其進(jìn)行定位、半定量研究。

術(shù)語“轉(zhuǎn)移”指的是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位侵入淋巴管、血管或其它器官，形成于原發(fā)部位腫瘤相同類型的腫瘤，這個(gè)過程稱為轉(zhuǎn)移。

術(shù)語“穿刺”指的是就是借助空心針這一器械，對器官的可疑病灶(如：腫塊、增厚區(qū)域、鈣化灶等)穿刺取出部分組織進(jìn)行檢查。

術(shù)語：“腫瘤”指的是機(jī)體在各種因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學(xué)界一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。

術(shù)語“患者”指的是經(jīng)過根除性腫瘤切除術(shù)或者部分根除性腫瘤切除術(shù)的病人。

術(shù)語“腫瘤標(biāo)本”指的是通過手術(shù)或穿刺獲得的乳腺腫瘤組織，該組織接著進(jìn)行固定、脫水、透明與浸蠟、石蠟包埋和再經(jīng)石蠟切片獲得用于免疫組化檢測的腫瘤標(biāo)本組織。