一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條及其制備方法和應(yīng)用與流程
本發(fā)明涉及利用免疫層析技術(shù)檢測植物病毒技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
馬鈴薯是我國應(yīng)用價(jià)值較高的經(jīng)濟(jì)作物，己被列為我國7大作物之一，也是中國西部最重要的作物品種和主要的支柱型產(chǎn)業(yè)，發(fā)展勢頭良好，但目前我國馬鈴薯單產(chǎn)卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家，馬鈴薯病毒是造成馬鈴薯產(chǎn)量低、質(zhì)量差的主要原因。在中國的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)如早孕、乙肝、寄生蟲、性病的檢驗(yàn)和動(dòng)物疫病的檢驗(yàn)如禽病診斷、家畜疫病、小鼠肝炎病毒、豬旋毛蟲病、犬病病毒的診斷中有免疫層析試紙條的應(yīng)用；在煙草、南瓜、萵苣、黃瓜花葉病毒、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒、煙草脈帶病毒、柑橘潰瘍病菌、葫蘆科病毒、萵苣叢枝植原體的檢測中已有免疫層析試紙條的應(yīng)用，但在馬鈴薯作物中還沒有田間快速檢測試紙條的應(yīng)用。
常規(guī)的檢測馬鈴薯病毒的技術(shù)是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，該方法需要專門的技術(shù)人員在專門的實(shí)驗(yàn)室利用專門的設(shè)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，操作過程繁瑣，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長：1.5-2天。不能現(xiàn)場取樣，現(xiàn)場出結(jié)果。目前生產(chǎn)上普遍采用馬鈴薯脫毒種薯來防治病毒病的危害，為確保馬鈴薯原原種、原種的脫毒質(zhì)量，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效的馬鈴薯病毒類病毒檢測技術(shù)是馬鈴薯種薯生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。
通過檢索發(fā)現(xiàn)如下與本專利相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)：
1、公開號為CN 103757138B的專利公開了一種云南馬鈴薯主栽品種麗薯6號、云薯401、宣薯2號病株中馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒4種病毒的檢測方法。本發(fā)明通過對云南馬鈴薯主栽品種麗薯6號、云薯401、宣薯2號病株中馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒和馬鈴薯卷葉病毒4種特異性混合抗體誘捕病樣中病毒，不必提取樣品總RNA進(jìn)行隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄和特異性病毒引物復(fù)合PCR反應(yīng)。本方法將快速、特異的免疫沉淀與靈敏的復(fù)合RT-PCR結(jié)合，同時(shí)設(shè)置健康馬鈴薯隨機(jī)引物cDNA產(chǎn)物相應(yīng)病毒PCR特異片段陽性質(zhì)粒作為陰、陽性對照，從而快速、準(zhǔn)確、靈敏的應(yīng)用于檢測田間馬鈴薯植株樣品、抗病毒材料及田間環(huán)境疑似侵染源等方面。
2、公開號為CN 103757138B的專利涉及兩步法雙重RT一PCR同步檢測馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯卷葉病毒，三重RT一PCR同步檢測馬鈴薯X病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯S病毒的方法及檢測試劑盒，是專門針對馬鈴薯產(chǎn)業(yè)影響較大的5種馬鈴薯病毒而建立的一種同步檢測2或3種病毒的快速方法，檢測時(shí)間僅用4h，且靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠。該方法克服了現(xiàn)有對馬鈴薯病毒病依據(jù)癥狀學(xué)的常規(guī)診斷方法誤判率較高、血清學(xué)方法難以檢測休眠馬鈴薯中的病毒及病毒含量較少的韌皮部病毒—馬鈴薯卷葉病毒等缺點(diǎn);該方法適用于馬鈴薯種苗、種薯多種病毒病的早期診斷，對馬鈴薯種薯質(zhì)量監(jiān)測和病毒病預(yù)防有著重要的作用。
通過對比，本專利申請與上述專利公開文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有方法的不足，將馬鈴薯病毒快速檢測試紙條應(yīng)用到馬鈴薯病毒檢測中，可實(shí)現(xiàn)對樣品中馬鈴薯病毒高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確性、高穩(wěn)定性的檢測，快速檢測出馬鈴薯病毒病的發(fā)生情況，為馬鈴薯脫毒薯種薯級別的定級和馬鈴薯病毒的防控提供理論依據(jù)。
本發(fā)明的目的之一在于提供一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條，是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條，包括樣品墊1、金標(biāo)墊 2、NC膜3、檢測線T線4、質(zhì)控線C線5、吸水墊6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部貼合有NC膜3，所述NC膜3上部兩端分別搭接有金標(biāo)墊2和吸水墊6，所述金標(biāo)墊2上部搭接有樣品墊1，所述檢測線T線4設(shè)置在靠近樣品墊1的NC膜3表面上，所述質(zhì)控線C線5設(shè)置在靠近吸水墊6的NC膜3上，所述檢測線T線4上包被有馬鈴薯病毒兔多克隆抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液劃膜濃度為0.5-1.5μL/cm，所述用來進(jìn)行劃膜的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液的濃度為0.5-1.5mg/mL；所述質(zhì)控線C線5上包被有馬鈴薯病毒羊抗兔抗體，所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液劃膜濃度為0.5-1.5μL/cm，所述用來進(jìn)行劃膜的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液的濃度為0.5-1.5mg/mL；所述的金標(biāo)墊2上結(jié)合有馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物溶液噴涂濃度為4-6μL/cm。
而且，馬鈴薯病毒快速檢測試紙條外部還設(shè)有卡殼8，所述卡殼8上部表面與樣品墊1對應(yīng)的位置上設(shè)有加樣孔9，所述卡殼8上部表面與所述NC膜3對應(yīng)的位置上設(shè)有觀察槽10。
而且，所述金標(biāo)墊 2與樣品墊1搭接的長度為2-3mm。
而且，所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體、包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，可以是以下組合中的任意一種：
組合1：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVX羊抗兔抗體，包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVX兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVX膠體金標(biāo)記物；
組合2：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVYNTN羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVYNTN兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVYNTN膠體金標(biāo)記物；
組合3：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVYo羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVYo兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVYo膠體金標(biāo)記物；
組合4：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PLRV羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PLRV兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PLRV膠體金標(biāo)記物；
組合5：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVS羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVS兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVS膠體金標(biāo)記物；
組合6：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVM羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVM兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVM膠體金標(biāo)記物；
組合7：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVA羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVA兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVA膠體金標(biāo)記物；
組合8：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是番茄黑環(huán)病毒膠體金標(biāo)記物。
本發(fā)明的目的之二是提供一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：金標(biāo)墊2的制備：
1) 馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物的制備：
用膠體金溶液標(biāo)記馬鈴薯病毒兔多克隆抗體，馬鈴薯病毒兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL；
復(fù)溶液配方：PH8.0-8.8，8-12%蔗糖，3-6%海藻糖，0.5-2%牛血清白蛋白，溶劑為0.1-0.2moL/L的 Tris-HcL溶液；
膠體金溶液的制備：取297-300 mL超純水于圓底燒瓶中，加入2-4 mL濃度為1-2%氯金酸溶液，混勻；將圓底燒瓶置于恒溫器中，加入干凈攪拌子，低速攪拌并加熱沸騰；一次性加入2-4mL、1-2%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸；時(shí)刻觀察溶液顏色變化，由淺黃色→黑色→紫色→紫紅色，當(dāng)變?yōu)榫萍t色時(shí)，繼續(xù)煮沸4-6min后，停止加熱，冷卻至室溫；超純水做空白對照，掃描膠體金溶液在500-550nm 之間的吸收值，如果吸收峰值在515-525nm出現(xiàn)，則制備的膠體金溶液合格；制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，液面出現(xiàn)油狀物和大量黑色顆粒狀沉淀物雜質(zhì)時(shí)棄用；最佳膠體金的顏色是紅色，形狀是圓形；
馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物的制備工藝：取2支離心管，加入1-2mL 膠體金溶液，加入3-5μL 0.1mol/L 的K2CO3，再加入4-6uL馬鈴薯病毒兔多克隆抗體，靜置25-35min，再加入80-120μL 封閉劑，靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ，棄上清，加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀，在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ，吸取上清液，保存?zhèn)溆茫?/p>
2) 金標(biāo)墊2與馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物的結(jié)合：選用玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊的支撐材料，將步驟1)制備的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，用三維大平臺(tái)噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物的最佳噴涂濃度為4-6μL /cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥時(shí)間2-4h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃ 熱合封口，保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟2：NC膜3的制備：
檢測線T線和質(zhì)控線C線的制備：用緩沖液稀釋待包被馬鈴薯病毒兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將馬鈴薯病毒兔多隆抗體劃膜到距離金標(biāo)墊1-2cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成檢測線T線；用緩沖液稀釋待包被馬鈴薯病毒羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將馬鈴薯病毒羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控線C線；檢測線T線和質(zhì)控線C線距離4-6mm；將劃有檢測線T線和質(zhì)控線C線的NC膜3 置于35-40℃條件下烘干，封裝備用；
緩沖液：緩沖液的作用是提供一定pH和離子強(qiáng)度使馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和馬鈴薯病毒羊抗兔抗體牢固包被于NC膜3上，緩沖液的pH值為7.0~7.4；
步驟3：樣品墊1的制備：
選用玻璃纖維膜做為制備樣品墊1的材料，玻璃纖維膜經(jīng)處理后方可使用；
玻璃纖維膜的處理步驟：戴手套，將玻璃纖維膜放入處理液中，完全浸泡，浸泡5-15min,后取出脫水3-5min，平置在篩網(wǎng)上，放入35-40℃干燥箱，烘干至濕度恒定在20-30%，將烘干后的玻璃纖維膜裝入鋁箔袋熱封保存；
處理液的配方：PH7.8-8.0磷酸緩沖液，0.5-1.5%S9表面活性劑溶液，0.4-0.5%吐溫20，0.5-1.5%牛血清白蛋白，0.1-0.3%聚乙烯吡咯烷酮溶液，溶劑為水；
步驟4：試紙條的組裝：
把步驟1 ~ 3所制作完成材料，根據(jù)PVC底板7的規(guī)格切割成一定的長度和寬度，粘貼PVC底板7上并安裝在卡殼8里；
試紙條的組裝步驟：
1）將NC膜3粘貼在PVC底板7上；
2）將金標(biāo)墊2搭接在NC膜3一端的上方，搭接長度為1-2mm；
3）將吸水墊6搭接在NC膜3另一端的上方，搭接長度為2-3mm；
4）將樣品墊1搭接在金標(biāo)墊2的上方，搭接長度為2-3mm；
5）在斬切機(jī)中將粘貼好的PVC底板7剪切成條；
6）剪切成條后裝殼并和干燥劑一并裝入鋁箔袋，密封后貼上標(biāo)簽。
而且，在馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物制備方法步驟中，加入的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體可以是PVX兔多克隆抗體、PVYNTN兔多克隆抗體、PVYo兔多克隆抗體、PLRV兔多克隆抗體、PVS兔多克隆抗體、PVM兔多克隆抗體、PVA兔多克隆抗體或番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體中的一種；
如果在馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物制備方法步驟中，加入的是PVX兔多克隆抗體，可制備成PVX膠體金標(biāo)記物；如果加入的是PVYNTN兔多克隆抗體，可制備成PVYNTN膠體金標(biāo)記物；如果加入的是PVYo兔多克隆抗體，可制備成PVYo膠體金標(biāo)記物；如果加入的是PLRV兔多克隆抗體，可制備成PLRV膠體金標(biāo)記物;如果加入的是PVS兔多克隆抗體，可制備成PVS膠體金標(biāo)記物；如果加入的是PVM兔多克隆抗體，可制備成PVM膠體金標(biāo)記物；如果加入的是PVA兔多克隆抗體，可制備成PVA膠體金標(biāo)記物；如果加入的是番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體，可制備成番茄黑環(huán)病毒膠體金標(biāo)記物；除了加入馬鈴薯病毒兔多克隆抗體種類不同外，其他制備工藝參數(shù)都一致。
而且，所述馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和馬鈴薯鈴薯病毒羊抗兔抗體的制備方法具體為：
馬鈴薯病毒兔多克隆抗體的制備：取1-2mL馬鈴薯病毒兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀馬鈴薯病毒抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀馬鈴薯病毒抗體,然后用磷酸緩沖液溶解馬鈴薯病毒抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得馬鈴薯病毒兔多克隆抗體；
馬鈴薯病毒羊抗兔抗體的制備：取1-2mL馬鈴薯病毒羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀病毒；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀馬鈴薯病毒抗體,然后用磷酸緩沖液溶解馬鈴薯病毒抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得馬鈴薯病毒羊抗兔抗體。
馬鈴薯病毒兔抗血清制備方法：取1-2ml馬鈴薯病毒,通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,總共注射三次；第三次注射一周后,通過耳靜脈采血,即得到馬鈴薯病毒的抗血清。
馬鈴薯病毒羊抗兔抗血清制備方法：取1-2ml馬鈴薯病毒免血清抗體，通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血，即得到羊抗兔抗血清；
而且，所述馬鈴薯病毒羊抗兔抗體和馬鈴薯病毒兔多克隆抗體可以選擇以下組合中的任意一種組合進(jìn)行制備；
組合1： PVX羊抗兔抗體，PVX兔多克隆抗體；
組合2： PVYo羊抗兔抗體， PVYo兔多克隆抗體；
組合3： PVYNTN羊抗兔抗體，PVYNTN兔多克隆抗體；
組合4： PLRV羊抗兔抗體，PLRV兔多克隆抗體；
組合5： PVS羊抗兔抗體， PVS兔多克隆抗體；
組合6： PVM羊抗兔抗體， PVM兔多克隆抗體
組合7： PVA羊抗兔抗體， PVA兔多克隆抗體；
組合8：番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體，番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體；
而且，步驟2：NC膜3的制備中：用來劃膜質(zhì)控線C線的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體和用來劃膜檢測線T線的馬鈴薯病毒兔多隆抗體可以選擇以下組合中的任意一種：
組合1： PVX羊抗兔抗體，PVX兔多克隆抗體；
組合2： PVYo羊抗兔抗體， PVYo兔多克隆抗體；
組合3： PVYNTN羊抗兔抗體，PVYNTN兔多克隆抗體；
組合4： PLRV羊抗兔抗體，PLRV兔多克隆抗體；
組合5： PVS羊抗兔抗體， PVS兔多克隆抗體；
組合6： PVM羊抗兔抗體， PVM兔多克隆抗體；
組合7： PVA羊抗兔抗體， PVA兔多克隆抗體；
組合8：番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體，番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體；
本發(fā)明的目的之三在于提供一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的應(yīng)用方法，是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種馬鈴薯快速檢測試紙條的應(yīng)用對待檢馬鈴薯樣品進(jìn)行檢測，具體檢測步驟為：
(1) 樣品處理：取馬鈴薯葉片，按葉片重量g和緩沖液體積V的比為1:8-1:10的比例加入磷酸鹽緩沖液，研磨出綠色汁液，磷酸鹽緩沖液的PH為7.4-7.8；
(2) 把上述處理過的樣品滴加到馬鈴薯快速檢測試紙條的樣品墊上，靜置0.5~3分鐘，觀察檢測線T線和質(zhì)控線C線；
(3) 結(jié)果判讀：檢測線T線和質(zhì)控線C線均顯現(xiàn)紫紅色為陽性；檢測線T線不顯現(xiàn)紫紅色，質(zhì)控線C線顯現(xiàn)紫紅色，結(jié)果為陰性；檢測線T線和質(zhì)控線C線均不顯現(xiàn)紫紅色或其他現(xiàn)象，提示試紙條失效。
本發(fā)明中：PVX代表馬鈴薯X病毒， PVYNTN代表馬鈴薯Y病毒的NTN株系，PVYo代表馬鈴薯Y病毒的O株系，PLRV代表馬鈴薯卷葉病毒，PVS代表馬鈴薯S病毒，PVM代表馬鈴薯M病毒，PVA代表馬鈴薯A病毒。
本發(fā)明的檢測原理： 選用膠體金標(biāo)記馬鈴薯病毒兔多克隆抗體制得馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，噴涂在金標(biāo)墊上；在檢測線T線上包被能與目的物蛋白復(fù)合物發(fā)生免疫反應(yīng)的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體，在質(zhì)控線C線上包被馬鈴薯病毒羊抗兔抗體，作為指示線。當(dāng)把待檢樣品加樣到樣品墊上后，樣品中馬鈴薯病毒蛋白與金標(biāo)墊上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物形成免疫復(fù)合物，由于毛細(xì)管效應(yīng)，該復(fù)合物向吸水墊方向泳動(dòng)，此復(fù)合物與包被在檢測線T線上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物、抗原（抗原是指馬鈴薯病毒）、馬鈴薯病毒兔多克隆抗體三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測線T線上，逐漸富集形成較深的紫紅色線；由于毛細(xì)效應(yīng)繼續(xù)泳動(dòng)向前，馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物與包被在質(zhì)控線C線上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線C線上形成較深的紫紅色線，多余的未結(jié)合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線T線和質(zhì)控線C線都出現(xiàn)紫紅色線的判為陽性結(jié)果；若樣品中不含有馬鈴薯病毒，馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物到達(dá)檢測線T線時(shí)，不與包被在檢測線T線上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，因此在檢測線T線處沒有出現(xiàn)顯色線，而馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物繼續(xù)向前泳動(dòng)與包被在質(zhì)控線C線上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體發(fā)生特異的免疫反應(yīng)而被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成紫紅色線，因此僅在質(zhì)控上出現(xiàn)紫紅線判為陰性結(jié)果。檢測線T線和質(zhì)控線C線均不顯現(xiàn)紫紅色線或出現(xiàn)其他現(xiàn)象，提示試紙條失效，檢測失敗。
本發(fā)明的有益效果：
（1）本發(fā)明首次將免疫層析技術(shù)應(yīng)用于馬鈴薯病毒病檢測，實(shí)現(xiàn)了高特異性、高靈敏的檢測性能。
（1）本發(fā)明使用方便、適用性強(qiáng)：無需實(shí)驗(yàn)室、不需要任何特殊儀器、無需專業(yè)人員操作培訓(xùn)、田間地頭、馬鈴薯貯藏窖、海關(guān)等任何有馬鈴薯的地方即可測試，每個(gè)馬鈴薯種植者均會(huì)使用。
（2）本發(fā)明檢測時(shí)間短，僅需0.5—3分鐘即可得出檢測結(jié)果。
（3）本發(fā)明靈敏度高：一片馬鈴薯葉子樣品即可用于檢測，試紙條檢測馬鈴薯樣品的馬鈴薯病毒最低檢測濃度為1ng/mL。
（4）本發(fā)明準(zhǔn)確性高：該試紙條檢測馬鈴薯樣品的準(zhǔn)確率與雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法的準(zhǔn)確率完全吻合，符合率達(dá)100%。
（5）本發(fā)明特異性強(qiáng)：馬鈴薯一病毒的試紙條僅該種病毒陽性材料檢測線及質(zhì)控線均出現(xiàn)明顯條帶，其他陽性材料僅質(zhì)控線出現(xiàn)紫紅色線，檢測線未出現(xiàn)紫紅色線；馬鈴薯病毒的檢測試紙條，對健康植株和緩沖液對照的檢測結(jié)果，僅C線出現(xiàn)紫紅色線，T線未出現(xiàn)紫紅色線色，結(jié)果是陰性，因此本試紙條具有特異性。
（6）本發(fā)明穩(wěn)定性強(qiáng)：將試紙條放在內(nèi)放干燥劑的密封鋁箔袋中，室溫和37℃下保存長時(shí)間后顏色略減弱，其他不同溫度、不同時(shí)間的測試結(jié)果無明顯變化，說明在適當(dāng)條件下保存，本試紙條具有較好的穩(wěn)定性。
（7）本發(fā)明檢測成本低；對溫度無特殊需求，無須冷凍，儲(chǔ)存運(yùn)輸方便，室溫可保存24個(gè)月。
附圖說明
圖1本發(fā)明主視圖（未畫卡殼）；
圖2為圖1左視圖；
圖3本發(fā)明卡殼結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4中為陽性結(jié)果示意圖；
圖5中為陰性結(jié)果示意圖；
圖6中為試紙條失效示意圖。
圖中：1樣品墊，2金標(biāo)墊，3NC膜，4檢測線T線，5質(zhì)控線C線，6吸水墊，7PVC底板，8卡殼，9加樣孔，10觀察槽。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
下述實(shí)施實(shí)例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條，如圖1、圖2所示，包括樣品墊1、金標(biāo)墊 2、NC膜3、檢測線T線4、質(zhì)控線C線5、吸水墊6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部貼合有NC膜3，所述NC膜3上部兩端分別搭接有金標(biāo)墊2和吸水墊6，所述金標(biāo)墊2上部搭接有樣品墊1，所述檢測線T線4設(shè)置在靠近樣品墊1的NC膜3表面上，所述質(zhì)控線C線5設(shè)置在靠近吸水墊6的NC膜3上，所述檢測線T線4上包被有馬鈴薯病毒兔多克隆抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液劃膜濃度為0.5μL/cm，所述用來進(jìn)行劃膜的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液的濃度為0.5mg/mL；所述質(zhì)控線C線5上包被有馬鈴薯病毒羊抗兔抗體，所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液劃膜濃度為0.5μL/cm，所述用來進(jìn)行劃膜的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液的濃度為0.5mg/mL；所述的金標(biāo)墊2上結(jié)合有馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物溶液噴涂濃度為4μL/cm。
本實(shí)施例中，如圖3所示，馬鈴薯病毒快速檢測試紙條外部還設(shè)有卡殼8，所述卡殼8上部表面與樣品墊1對應(yīng)的位置上設(shè)有加樣孔9，所述卡殼8上部表面與所述NC膜3對應(yīng)的位置上設(shè)有觀察槽10。
本實(shí)施例中，所述NC膜3與金標(biāo)墊 2搭接的長度為1mm，所述NC膜3與吸水墊6 搭接的長度為2mm，所述金標(biāo)墊 2與樣品墊1 搭接的長度為2mm。
本實(shí)施例中，所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體、包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和包被在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，可以是以下組合中的任意一種：
組合1：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVX羊抗兔抗體，包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVX兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVX膠體金標(biāo)記物；
組合2：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVYo羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVYo兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVYo膠體金標(biāo)記物；
組和3： 所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVYNTN羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVYNTN兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVYNTN膠體金標(biāo)記物；
組合4：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PLRV羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PLRV兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PLRV膠體金標(biāo)記物；
組合5：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVS羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVS兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVS膠體金標(biāo)記物；
組合6：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVM羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVM兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊(2)上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVM膠體金標(biāo)記物；
組合7：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是PVA羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是PVA兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是PVA膠體金標(biāo)記物；
組合8：所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體是番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體是番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物是番茄黑環(huán)病毒膠體金標(biāo)記物。
實(shí)施例2
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條，如圖1、圖2所示，包括樣品墊1、金標(biāo)墊 2、NC膜3、檢測線T線4、質(zhì)控線C線5、吸水墊6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部貼合有NC膜3，所述NC膜3上部兩端分別搭接有金標(biāo)墊2和吸水墊6，所述金標(biāo)墊2上部搭接有樣品墊1，所述檢測線T線4設(shè)置在靠近樣品墊1的NC膜3表面上，所述質(zhì)控線C線5設(shè)置在靠近吸水墊6的NC膜3上，所述檢測線T線4上包被有馬鈴薯病毒兔多克隆抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液劃膜濃度為1μL/cm，所述用來進(jìn)行劃膜的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液的濃度為1mg/mL；所述質(zhì)控線C線5上包被有馬鈴薯病毒羊抗兔抗體，所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液劃膜濃度為1μL/cm，所述用來進(jìn)行劃膜的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液的濃度為1mg/mL；所述的金標(biāo)墊2上結(jié)合有馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物溶液噴涂濃度為5μL/cm。
本實(shí)施例中，如圖3所示，馬鈴薯病毒快速檢測試紙條外部還設(shè)有卡殼8，所述卡殼8上部表面與樣品墊1對應(yīng)的位置上設(shè)有加樣孔9，所述卡殼8上部表面與所述NC膜3對應(yīng)的位置上設(shè)有觀察槽10。
本實(shí)施例中，所述NC膜3與金標(biāo)墊 2搭接的長度為1.5mm，所述NC膜3與吸水墊6 搭接的長度為2.5mm，所述金標(biāo)墊 2與樣品墊1 搭接的長度為2.5mm。
本實(shí)施例中，所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體、包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和包被在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，可以是實(shí)施例1中8種組合中的任意一種。
實(shí)施例3
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條，如圖1、圖2所示，包括樣品墊1、金標(biāo)墊 2、NC膜3、檢測線T線4、質(zhì)控線C線5、吸水墊6和PVC底板7，所述PVC底板7的上部貼合有NC膜3，所述NC膜3上部兩端分別搭接有金標(biāo)墊2和吸水墊6，所述金標(biāo)墊2上部搭接有樣品墊1，所述檢測線T線4設(shè)置在靠近樣品墊1的NC膜3表面上，所述質(zhì)控線C線5設(shè)置在靠近吸水墊6的NC膜3上，所述檢測線T線4上包被有馬鈴薯病毒兔多克隆抗體，所述包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液劃膜濃度為1.5μL/cm，所述用來進(jìn)行劃膜的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體溶液的濃度為1.5mg/mL；所述質(zhì)控線C線5上包被有馬鈴薯病毒羊抗兔抗體，所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液劃膜濃度為1.5μL/cm，所述用來進(jìn)行劃膜的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體溶液的濃度為1.5mg/mL；所述的金標(biāo)墊2上結(jié)合有馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，所述結(jié)合在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物溶液噴涂濃度為6μL/cm。
本實(shí)施例中，如圖3所示，馬鈴薯病毒快速檢測試紙條外部還設(shè)有卡殼8，所述卡殼8上部表面與樣品墊1對應(yīng)的位置上設(shè)有加樣孔9，所述卡殼8上部表面與所述NC膜3對應(yīng)的位置上設(shè)有觀察槽10。
本實(shí)施例中，所述NC膜3與金標(biāo)墊 2搭接的長度為2mm，所述NC膜3與吸水墊6 搭接的長度為3mm，所述金標(biāo)墊 2與樣品墊1 搭接的長度為3mm。
本實(shí)施例中，所述包被在質(zhì)控線C線5上的馬鈴薯病毒羊抗兔抗體、包被在檢測線T線4上的馬鈴薯病毒兔多克隆抗體和包被在金標(biāo)墊2上的馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物，可以是實(shí)施例1中8種組合中的任意一種。
實(shí)施例4
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：金標(biāo)墊2的制備：
1) PVX膠體金標(biāo)記物的制備：
用膠體金溶液標(biāo)記PVX兔多克隆抗體，PVX兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL；
復(fù)溶液配方：PH8.0-8.8，8-12%蔗糖，3-6%海藻糖，0.5-2%牛血清白蛋白，溶劑為0.1-0.2mol/L的 Tris-Hcl溶液；
膠體金溶液的制備：取297-300 mL超純水于圓底燒瓶中，加入2-4 mL濃度為1-2%氯金酸溶液，混勻；將圓底燒瓶置于恒溫器中，加入干凈攪拌子，低速攪拌并加熱沸騰；一次性加入2-4mL、1-2%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸；時(shí)刻觀察溶液顏色變化，由淺黃色→黑色→紫色→紫紅色，當(dāng)變?yōu)榫萍t色時(shí)，繼續(xù)煮沸4-6min后，停止加熱，冷卻至室溫；超純水做空白對照，掃描膠體金溶液在500-550nm 之間的吸收值，如果吸收峰值在515-525nm出現(xiàn)，則制備的膠體金溶液合格；制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，液面出現(xiàn)油狀物和大量黑色顆粒狀沉淀物雜質(zhì)時(shí)棄用；最佳膠體金的顏色是紅色，形狀是圓形；
PVX膠體金標(biāo)記物的制備工藝：取2支離心管，加入1-2mL 膠體金溶液，加入3-5μL 0.1mol/L 的K2CO3，再加入4-6μLPVX兔多克隆抗體，靜置25-35min，再加入80-120μl 封閉劑，靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ，棄上清，加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀，在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ，吸取上清液，保存?zhèn)溆茫?/p>
2) 金標(biāo)墊2與PVX膠體金標(biāo)記物的結(jié)合：選用玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊的支撐材料，將步驟1)制備的PVX膠體金標(biāo)記物，用三維大平臺(tái)噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂膠體金標(biāo)記物的噴涂濃度為4-6μL /cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥時(shí)間2-4h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃ 熱合封口，保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟2：NC膜3的制備：
檢測線T線和質(zhì)控線C線的制備：用緩沖液稀釋待包被PVX兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVX兔多隆抗體劃膜到距離金標(biāo)墊1-2cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成檢測線T線；用緩沖液稀釋待包被PVX羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVX羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控線C線；檢測線T線和質(zhì)控線C線距離4-6mm；將劃有檢測線T線和質(zhì)控線C線的NC膜3)置于35-40℃條件下烘干，封裝備用；
緩沖液：緩沖液的作用是提供一定pH和離子強(qiáng)度使PVX兔多克隆抗體和PVX羊抗兔抗體牢固包被于NC膜上，緩沖液的pH值為7.0~7.4；
步驟3：樣品墊1的制備：
選用玻璃纖維膜做為制備樣品墊1的材料，玻璃纖維膜經(jīng)處理后方可使用；
玻璃纖維膜的處理步驟：戴手套，將玻璃纖維膜放入處理液中，完全浸泡，浸泡5-15min,后取出脫水3-5min，平置在篩網(wǎng)上，放入35-40℃干燥箱，烘干至濕度恒定在20-30左右，將烘干后的玻璃纖維膜裝入鋁箔袋熱封保存；
處理液的配方：PH7.8-8.0磷酸緩沖液，0.5-1.5%S9表面活性劑溶液，0.4-0.5%吐溫20，0.5-1.5%牛血清白蛋白，0.1-0.3%聚乙烯吡咯烷酮溶液，溶劑為水；
步驟4：試紙條的組裝
把步驟1 ~ 3所制作完成材料，根據(jù)PVC底板7的規(guī)格切割成一定的長度和寬度，粘貼PVC底板7上并安裝在卡殼8里；
試紙條的組裝步驟：
1）將NC膜3粘貼在PVC底板7上；
2）將金標(biāo)墊2搭接在NC膜3一端的上方，搭接長度為1-2mm；
3）將吸水墊6搭接在NC膜3另一端的上方，搭接長度為2-3mm；
4）將樣品墊1搭接在金標(biāo)墊2的上方，搭接長度為2-3mm；
5）在斬切機(jī)中將粘貼好的PVC底板7剪切成條；
6）剪切成條后裝殼并和干燥劑一并裝入鋁箔袋，密封后貼上標(biāo)簽。
本實(shí)施例中，所述PVX兔多克隆抗體和PVX羊抗兔抗體的制備方法具體為：
PVX多克隆抗體的制備：取1-2mLPVX兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVX抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVX抗體,再用磷酸緩沖液溶解PVX抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVX兔多克隆抗體。
PVX羊抗兔抗體的制備：取1-2mLPVX羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVX抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVX抗體,然后用磷酸緩沖液溶解PVX抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVX羊抗兔抗體。
PVX兔抗血清的制備方法：取2mLPVX,通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血,即得到PVX的抗血清。
PVX羊抗兔抗血清的制備方法：取2mLPVX兔血清抗體，通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血，即得到PVX羊抗兔抗血清。
實(shí)施例5
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：金標(biāo)墊2的制備：
1) PVYo膠體金標(biāo)記物的制備：
用膠體金溶液標(biāo)記PVYo兔多克隆抗體，PVYo兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL；
復(fù)溶液配方和膠體金溶液的制備同實(shí)施例4；
PVYo膠體金標(biāo)記物的制備工藝：取2支離心管，加入1-2mL 膠體金溶液，加入3-5μL 0.1mol/L 的K2CO3，再加入4-6μLPVYo兔多克隆抗體，靜置25-35min，再加入80-120μL 封閉劑，靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ，棄上清，加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀，在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ，吸取上清液，保存?zhèn)溆茫?/p>
2) 金標(biāo)墊2與PVYo膠體金標(biāo)記物的結(jié)合：選用玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊的支撐材料，將步驟1)制備的PVYo膠體金標(biāo)記物，用三維大平臺(tái)噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂PVYo膠體金標(biāo)記物的最佳噴涂濃度為4-6μL /cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥時(shí)間2-4h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃ 熱合封口，保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟2：NC膜3的制備：
檢測線T線和質(zhì)控線C線的制備：用緩沖液稀釋待包被PVYo兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVYo兔多隆抗體劃膜到距離金標(biāo)墊1-2cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成檢測線T線；用緩沖液稀釋待包被PVYo羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVYo羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控線C線；檢測線T線和質(zhì)控線C線距離4-6mm；將劃有檢測線T線和質(zhì)控線C線的NC膜3置于35-40℃條件下烘干，封裝備用；
步驟3：樣品墊1的制備：同實(shí)施例4
步驟4：試紙條的組裝：同實(shí)施例4
本實(shí)施例中，所述PVYo兔多克隆抗體和PVYo羊抗兔抗體的制備方法具體為：
PVYo多克隆抗體的制備：取1-2mLPVYo兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVYo抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVYo抗體,再用磷酸緩沖液溶解PVYo抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVYo兔多克隆抗體；
PVYo羊抗兔抗體的制備：取1-2mLPVYo羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVYo抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVYo抗體,然后用磷酸緩沖液溶解PVYo抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVYo羊抗兔抗體；
PVYo兔抗血清的制備方法：取2mLPVYo,通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血,即得到PVYo的抗血清；
PVYo羊抗兔抗血清的制備方法：取2mLPVYo兔血清抗體，通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血，即得到PVYo羊抗兔抗血清。
實(shí)施例6
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：金標(biāo)墊2的制備：
1)PVYNTN膠體金標(biāo)記物的制備：
用膠體金溶液標(biāo)記PVYNTN兔多克隆抗體，PVYNTN兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL；
復(fù)溶液配方和膠體金溶液的制備同實(shí)施例4；
PVYNTN膠體金標(biāo)記物的制備工藝：取2支離心管，加入1-2mL 膠體金溶液，加入3-5μL 0.1mol/L 的K2CO3，再加入4-6μL PVYNTN兔多克隆抗體，25-35min，再加入80-120μL 封閉劑，靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ，棄上清，加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀，在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ，吸取上清液，保存?zhèn)溆茫?/p>
2) 金標(biāo)墊2與PVYNTN膠體金標(biāo)記物的結(jié)合：選用玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊的支撐材料，將步驟1)制備的PVYNTN膠體金標(biāo)記物，用三維大平臺(tái)噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂PVYNTN膠體金標(biāo)記物的最佳噴涂濃度為4-6μL /cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥時(shí)間2-4h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃ 熱合封口，保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟2：NC膜3的制備：
檢測線T線和質(zhì)控線C線的制備：用緩沖液稀釋待包被PVYNTN兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVYNTN兔多隆抗體劃膜到距離金標(biāo)墊1-2cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成檢測線T線；用緩沖液稀釋待包被PVYNTN羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVYNTN羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控線C線；檢測線T線和質(zhì)控線C線距離4-6mm；將劃有檢測線T線和質(zhì)控線C線的NC膜3置于35-40℃條件下烘干，封裝備用；
步驟3：樣品墊1的制備：同實(shí)施例4
步驟4：試紙條的組裝：同實(shí)施例4
本實(shí)施例中，所述PVYNTN兔多克隆抗體和PVYNTN羊抗兔抗體的制備方法具體為：
PVYNTN多克隆抗體的制備：取1-2mL PVYNTN兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVYNTN抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVYNTN抗體,再用磷酸緩沖液溶解PVYNTN抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVYNTN兔多克隆抗體；
PVYNTN羊抗兔抗體的制備：取1-2mL PVYNTN羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVYNTN抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVYNTN抗體,然后用磷酸緩沖液溶解PVYNTN抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVYNTN羊抗兔抗體；
PVYNTN兔抗血清的制備方法：取2mLPVYNTN,通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血,即得到PVYNTN的抗血清；
PVYNTN羊抗兔抗血清的制備方法：取2mLPVYNTN兔血清抗體，通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血，即得到PVYNTN羊抗兔抗血清。
實(shí)施例7
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：金標(biāo)墊2的制備：
1)PLRV膠體金標(biāo)記物的制備：
用膠體金溶液標(biāo)記PLRV兔多克隆抗體，PLRV兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL；
復(fù)溶液配方和膠體金溶液的制備同實(shí)施例4；
PLRV膠體金標(biāo)記物的制備工藝：取2支離心管，加入1-2mL 膠體金溶液，加入3-5μL 0.1mol/L 的K2CO3，再加入4-6μL PLRV兔多克隆抗體，靜置25-35min，再加入80-120μL 封閉劑，靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ，棄上清，加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀，在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ，吸取上清液，保存?zhèn)溆茫?/p>
2) 金標(biāo)墊2與PLRV膠體金標(biāo)記物的結(jié)合：選用玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊的支撐材料，將步驟1)制備的PLRV膠體金標(biāo)記物，用三維大平臺(tái)噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂PLRV膠體金標(biāo)記物的最佳噴涂濃度為4-6μL /cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥時(shí)間2-4h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃ 熱合封口，保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟2：NC膜3的制備：
檢測線T線和質(zhì)控線C線的制備：用緩沖液稀釋待包被PLRV兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PLRV兔多隆抗體劃膜到距離金標(biāo)墊1-2cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成檢測線T線；用緩沖液稀釋待包被PLRV羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PLRV羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控線C線；檢測線T線和質(zhì)控線C線距離4-6mm；將劃有檢測線T線和質(zhì)控線C線的NC膜3置于35-40℃條件下烘干，封裝備用；
步驟3：樣品墊1的制備：同實(shí)施例4
步驟4：試紙條的組裝：同實(shí)施例4
本實(shí)施例中，所述PLRV兔多克隆抗體和PLRV羊抗兔抗體的制備方法具體為：
PLRV多克隆抗體的制備：取1-2mL PLRV兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PLRV抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PLRV抗體,再用磷酸緩沖液溶解PLRV抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PLRV兔多克隆抗體；
PLRV羊抗兔抗體的制備：取1-2mL PLRV羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PLRV抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PLRV抗體,然后用磷酸緩沖液溶解PLRV抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PLRV羊抗兔抗體；
PLRV兔抗血清的制備方法：取2mLPLRV,通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血,即得到PLRV的抗血清；
PLRV羊抗兔抗血清的制備方法：取2mLPLRV兔血清抗體，通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血，即得到PLRV羊抗兔抗血清。
實(shí)施例8
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：金標(biāo)墊2的制備：
1)PVS膠體金標(biāo)記物的制備：
用膠體金溶液標(biāo)記PVS兔多克隆抗體，PVS兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL；
復(fù)溶液配方和膠體金溶液的制備同實(shí)施例4；
PVS膠體金標(biāo)記物的制備工藝：取2支離心管，加入1-2mL 膠體金溶液，加入3-5μl 0.1mol/L 的K2CO3，再加入4-6μL PVS兔多克隆抗體，置25-35min，再加入80-120μL 封閉劑，靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ，棄上清，加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀，在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ，吸取上清液，保存?zhèn)溆茫?/p>
2) 金標(biāo)墊2與PVS膠體金標(biāo)記物的結(jié)合：選用玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊的支撐材料，將步驟1)制備的PVS膠體金標(biāo)記物，用三維大平臺(tái)噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂PVS膠體金標(biāo)記物的最佳噴涂濃度為4-6μL /cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥時(shí)間2-4h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃ 熱合封口，保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟2：NC膜3的制備：
檢測線T線和質(zhì)控線C線的制備：用緩沖液稀釋待包被PVS兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVS兔多隆抗體劃膜到距離金標(biāo)墊1-2cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成檢測線T線；用緩沖液稀釋待包被PVS羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVS羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控線C線；檢測線T線和質(zhì)控線C線距離4-6mm；將劃有檢測線T線和質(zhì)控線C線的NC膜3 置于35-40℃條件下烘干，封裝備用；
步驟3：樣品墊1的制備：同實(shí)施例4
步驟4：試紙條的組裝：同實(shí)施例4
本實(shí)施例中，所述PVS兔多克隆抗體和PVS羊抗兔抗體的制備方法具體為：
PVS多克隆抗體的制備：取1-2mL PVS兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVS抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVS抗體,再用磷酸緩沖液溶解PVS抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVS兔多克隆抗體；
PVS羊抗兔抗體的制備：取1-2mL PVS羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVS抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVS抗體,然后用磷酸緩沖液溶解PVS抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVS羊抗兔抗體；
PVS兔抗血清的制備方法：取2mLPVS,通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血,即得到PVS的抗血清；
PVS羊抗兔抗血清的制備方法：取2mLPVS兔血清抗體，通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血，即得到PVS羊抗兔抗血清。
實(shí)施例9
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：金標(biāo)墊2的制備：
1)PVM膠體金標(biāo)記物的制備：
用膠體金溶液標(biāo)記PVM兔多克隆抗體，PVM兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL；
復(fù)溶液配方和膠體金溶液的制備同實(shí)施例4；
PVM膠體金標(biāo)記物的制備工藝：取2支離心管，加入1-2mL 膠體金溶液，加入3-5μL 0.1mol/L 的K2CO3，再加入4-6μLPVM兔多克隆抗體，置25-35min，再加入80-120μL 封閉劑，靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ，棄上清，加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀，在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ，吸取上清液，保存?zhèn)溆茫?/p>
2) 金標(biāo)墊2與PVM膠體金標(biāo)記物的結(jié)合：選用玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊的支撐材料，將步驟1)制備的PVM膠體金標(biāo)記物，用三維大平臺(tái)噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂PVM膠體金標(biāo)記物的最佳噴涂濃度為4-6μL /cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥時(shí)間2-4h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃ 熱合封口，保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟2：NC膜3的制備：
檢測線T線和質(zhì)控線C線的制備：用緩沖液稀釋待包被PVM兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVM兔多隆抗體劃膜到距離金標(biāo)墊1-2cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成檢測線T線；用緩沖液稀釋待包被PVM羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVM羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控線C線；檢測線T線和質(zhì)控線C線距離4-6mm；將劃有檢測線T線和質(zhì)控線C線的NC膜3 置于35-40℃條件下烘干，封裝備用；
步驟3：樣品墊1的制備：同實(shí)施例4
步驟4：試紙條的組裝：同實(shí)施例4
本實(shí)施例中，所述PVM兔多克隆抗體和PVM羊抗兔抗體的制備方法具體為：
PVM多克隆抗體的制備：取1-2mL PVM兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVM抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVM抗體,再用磷酸緩沖液溶解PVM抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVM兔多克隆抗體；
PVM羊抗兔抗體的制備：取1-2mL PVM羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVM抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVM抗體,然后用磷酸緩沖液溶解PVM抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVM羊抗兔抗體；
PVM兔抗血清的制備方法：取2mLPVM,通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血,即得到PVM的抗血清；
PVM羊抗兔抗血清的制備方法：取2mLPVM兔血清抗體，通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血，即得到PVM羊抗兔抗血清。
實(shí)施例10
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：金標(biāo)墊2的制備：
1)PVA膠體金標(biāo)記物的制備：
用膠體金溶液標(biāo)記PVA兔多克隆抗體，PVA兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL；
復(fù)溶液配方和膠體金溶液的制備同實(shí)施例4；
PVA膠體金標(biāo)記物的制備工藝：取2支離心管，加入1-2mL 膠體金溶液，加入3-5μL 0.1mol/L 的K2CO3，再加入4-6μL PVA兔多克隆抗體，置25-35min，再加入80-120μL 封閉劑，靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ，棄上清，加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀，在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ，吸取上清液，保存?zhèn)溆茫?/p>
2) 金標(biāo)墊2與PVA膠體金標(biāo)記物的結(jié)合：選用玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊的支撐材料，將步驟1)制備的PVA膠體金標(biāo)記物，用三維大平臺(tái)噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂PVA膠體金標(biāo)記物的最佳噴涂濃度為4-6μL /cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥時(shí)間2-4h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃ 熱合封口，保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟2：NC膜3的制備：
檢測線T線和質(zhì)控線C線的制備：用緩沖液稀釋待包被PVA兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVA兔多隆抗體劃膜到距離金標(biāo)墊1-2cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成檢測線T線；用緩沖液稀釋待包被PVA羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將PVA羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控線C線；檢測線T線和質(zhì)控線C線距離4-6mm；將劃有檢測線T線和質(zhì)控線C線的NC膜3 置于35-40℃條件下烘干，封裝備用；
步驟3：樣品墊1的制備：同實(shí)施例4
步驟4：試紙條的組裝：同實(shí)施例4
本實(shí)施例中，所述PVA兔多克隆抗體和PVA抗羊兔抗體制備方法具體為：
PVA多克隆抗體的制備：取1-2mL PVA兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVA抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVA抗體,再用磷酸緩沖液溶解PVA抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVA兔多克隆抗體；
PVA羊抗兔抗體的制備：取1-2mL PVA羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀PVA抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀PVA抗體,然后用磷酸緩沖液溶解PVA抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得PVA羊抗兔抗體；
PVA兔抗血清的制備方法：取2mLPVA,通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血,即得到PVA的抗血清；
PVA羊抗兔抗血清的制備方法：取2mLPVA兔血清抗體，通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血，即得到PVA羊抗兔抗血清。
實(shí)施例11
一種馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：金標(biāo)墊2的制備：
1)番茄黑環(huán)病毒膠體金標(biāo)記物的制備：
用膠體金溶液標(biāo)記 番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體，番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體的濃度為0.5-1.5mg/mL；
復(fù)溶液配方和膠體金溶液的制備同實(shí)施例4；
番茄黑環(huán)病毒膠體金標(biāo)記物的制備工藝：取2支離心管，加入1-2mL 膠體金溶液，加入3-5μL 0.1mol/L 的K2CO3，再加入4-6μL番茄黑環(huán)病毒多克隆抗體，靜置25-35min，再加入80-120μL 封閉劑，靜置25-35min,在8000-10000rpm、4℃條件下離心25-35min ，棄上清，加入80-120μL復(fù)溶液懸浮沉淀，在400-600rpm、4℃條件下離心10-20min ，吸取上清液，保存?zhèn)溆茫?/p>
2) 金標(biāo)墊2與番茄黑環(huán)病毒膠體金標(biāo)記物的結(jié)合：選用玻璃纖維膜作為金標(biāo)墊的支撐材料，將步驟1)制備的番茄黑環(huán)病毒膠體金標(biāo)記物，用三維大平臺(tái)噴金劃膜儀噴涂在玻璃纖維膜上，在玻璃纖維膜上噴涂番茄黑環(huán)病毒膠體金標(biāo)記物的最佳噴涂濃度為4-6μL/cm，將噴好的玻璃纖維膜置于35-40℃ 干燥箱中，干燥時(shí)間2-4h，取出，放入鋁箔袋中，180-230℃ 熱合封口，保存?zhèn)溆茫?/p>
步驟2：NC膜3的制備：
檢測線T線和質(zhì)控線C線的制備：用緩沖液稀釋待包被番茄黑環(huán)病毒兔多隆抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將番茄黑環(huán)病毒兔多隆抗體劃膜到距離金標(biāo)墊1-2cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成檢測線T線；用緩沖液稀釋待包被番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體至0.5~1.5mg/mL濃度，用三維大平臺(tái)劃膜噴金儀將番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體劃膜到距離吸水墊2-3cm處NC膜上，以0.5~1.5μL/cm的劃膜濃度劃膜于NC膜上，構(gòu)成質(zhì)控線C線；檢測線T線和質(zhì)控線C線距離4-6mm；將劃有檢測線T線和質(zhì)控線C線的NC膜3 置于35-40℃條件下烘干，封裝備用；
步驟3：樣品墊1的制備：同實(shí)施例4
步驟4：試紙條的組裝：同實(shí)施例4
本實(shí)施例中，所述 番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體和番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體制備方法具體為：
番茄黑環(huán)病毒多克隆抗體的制備：取1-2mL番茄黑環(huán)病毒兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀番茄黑環(huán)病毒抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀番茄黑環(huán)病毒抗體,再用磷酸緩沖液溶解 番茄黑環(huán)病毒抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得番茄黑環(huán)病毒兔多克隆抗體；
番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體的制備：取1-2mL番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗血清,加入1-2mL磷酸緩沖液在振蕩器中振蕩,混勻后加入2-4mL飽和硫酸銨沉淀 番茄黑環(huán)病毒抗體；接著在8000-10000rpm,10-15min,4℃左右條件下離心，沉淀番茄黑環(huán)病毒抗體,然后用磷酸緩沖液溶解番茄黑環(huán)病毒抗體,然后通過PD-10coLum纖維柱過濾除掉多余的硫酸銨，即得番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗體；
番茄黑環(huán)病毒兔抗血清的制備方法：取2mL番茄黑環(huán)病毒,通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性兔子,每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血,即得到番茄黑環(huán)病毒的抗血清；
番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗血清的制備方法：取2mL番茄黑環(huán)病毒免血清抗體，通過皮下4點(diǎn)注射健康雄性山羊，每隔一周注射一次,總共注射三次;第三次注射一周后,通過耳靜脈采血，即得到番茄黑環(huán)病毒羊抗兔抗血清。
實(shí)施例12
一種馬鈴薯快速檢測試紙條的應(yīng)用，具體檢測步驟為：
(1) 樣品處理：取馬鈴薯葉片，按葉片重量g和緩沖液體積V的比為1:8-1:10的比例加入磷酸鹽緩沖液，研磨出綠色汁液，磷酸鹽緩沖液的PH為7.4-7.8；
(2) 把上述處理過的樣品滴加到馬鈴薯快速檢測試紙條的樣品墊上，靜置0.5~ 3分鐘，觀察檢測線T線和質(zhì)控線C線；
(3) 結(jié)果判讀：如圖4所示，檢測線T線和質(zhì)控線C線均顯現(xiàn)紫紅色為陽性；如圖5所示，檢測線T線不顯現(xiàn)紫紅色，質(zhì)控線C線顯現(xiàn)紫紅色，結(jié)果為陰性；如圖6所示，檢測線T線和質(zhì)控線C線均不顯現(xiàn)紫紅色或其他現(xiàn)象，提示試紙條失效。
實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
1、馬鈴薯病毒快速檢測試紙條靈敏度的測定
取檢測樣品，分別稀釋101倍、102 倍、103倍、104倍、105倍、106 倍、107倍、108倍。進(jìn)行靈敏度比較，將馬鈴薯病毒濃度設(shè)定為1ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、1000ng/mL、3000ng/mL，試紙條檢出馬鈴薯病毒的最小濃度為1ng/mL。馬鈴薯病毒包括PVX、PVYNTN 、PVYo、PLRV、PVS、PVM、PVA和番茄黑環(huán)病毒。
2、馬鈴薯病毒快速檢測試紙條穩(wěn)定性的測定
將試紙條用鋁箔袋密封，加入干燥劑，分別置于4℃、37℃、室溫條件下，其中置于4℃和室溫條件試紙條每隔7天取出3條，置于37℃的每天取出3條，分別檢測陰性樣本和陽性樣本。觀察檢測線T線和質(zhì)控線C線的有無、顏色深淺及金標(biāo)墊2上馬鈴薯病毒膠體金標(biāo)記物上的釋放程度。從試紙條測試結(jié)果來看，將試紙條放在內(nèi)放干燥劑的密封鋁箔袋中，室溫和37℃下保存長時(shí)間后顏色略減弱，其他不同溫度、不同時(shí)間的測試結(jié)果無明顯變化，說明在適當(dāng)條件下保存，本試紙條具有較好的穩(wěn)定性。馬鈴薯病毒包括PVX、PVYNTN 、PVYo、PLRV、PVS、PVM、PVA和番茄黑環(huán)病毒。
3、馬鈴薯病毒快速檢測試紙條特異性的測定
PVX的檢測試紙條經(jīng)過與PVX、PVS、PVA、PLRV、PVM 、PVYo 、PVYNTN病毒的陽性材料測試比較，僅PVX病毒陽性材料檢測線T線及質(zhì)控線C線均出現(xiàn)明顯紫紅色線，其他陽性材料僅質(zhì)控C線出現(xiàn)紫紅色線，檢測線T線未出現(xiàn)紫紅色線；馬鈴薯病毒的檢測試紙條，對健康植株和緩沖液對照的檢測結(jié)果，僅C線出現(xiàn)紫紅色，T線未出現(xiàn)紫紅色，結(jié)果是陰性，因此本試紙條具有特異性。
4、馬鈴薯病毒快速檢測試紙條準(zhǔn)確性的測定
用PVX的檢測試紙條對96個(gè)馬鈴薯的植株做是否含有X病毒的檢測；同時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對上述樣品進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%；用PVY0的檢測試紙條對100個(gè)馬鈴薯的植株做是否含有Y病毒的O株系病毒的檢測；同時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對上述樣品進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%；用PVA病毒的檢測試紙條對100個(gè)馬鈴薯的植株做是否含有A病毒的檢測；同時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對上述樣品進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%；用PVS的檢測試紙條對100個(gè)馬鈴薯的植株做是否含有S病毒的檢測；同時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對上述樣品進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%；用PVM的檢測試紙條對100個(gè)馬鈴薯的植株做是否含有M病毒的檢測；同時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對上述樣品進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%;用番茄黑環(huán)病毒的檢測試紙條對100個(gè)馬鈴薯的植株做是否含有番茄黑環(huán)病毒病毒的檢測；同時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對上述樣品進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%。用PVYNTN的檢測試紙條對98個(gè)馬鈴薯的植株做是否含有Y病毒的NTN株系病毒的檢測；同時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對上述樣品進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%;用PLRV的檢測試紙條對100個(gè)馬鈴薯的植株做是否含有V病毒的檢測；同時(shí)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法對上述樣品進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的檢測結(jié)果完全一致，符合率達(dá)100%。本實(shí)驗(yàn)足以說明馬鈴薯病毒快速檢測試紙條的準(zhǔn)確性高。
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