本發(fā)明涉及屬于癌癥體外臨床檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及CA215檢測試劑盒及其制備方法和使用方法。
背景技術(shù)：
：近半個(gè)世紀(jì)以來，腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年升高，成為醫(yī)學(xué)界熱點(diǎn)中的熱點(diǎn)。20世紀(jì)70年代，美國提出的向“腫瘤進(jìn)軍”反映了社會對腫瘤死亡率居高不下的焦慮，同時(shí)，在過去的幾十年中，腫瘤標(biāo)志在技術(shù)上和定義上有了突破，這一切都促使了腫瘤標(biāo)志研究的快速發(fā)展。CA215是腫瘤相關(guān)抗原，該抗原是1987年對從培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞提取的單克隆抗體RP215發(fā)現(xiàn)的。RP215被證明與位于主要由大多數(shù)癌細(xì)胞中表達(dá)的免疫球蛋白重鏈(一般稱為CA215)碳水化合物相關(guān)的表位發(fā)生反應(yīng)。由于CA215是高度與癌細(xì)胞或癌組織相關(guān)聯(lián)的，且一般不能在正常人組織中發(fā)現(xiàn)，除了在增生上皮細(xì)胞或組織，例如皮膚、食道、子宮頸以及幾個(gè)免疫特殊部位，包括神經(jīng)，眼睛和睪丸。CA215作為一個(gè)泛癌生物標(biāo)志物的具有潛在應(yīng)用價(jià)值，并且可以與其它已知的癌癥生物標(biāo)志物的并行比較來記錄CA215的在人類許多不同類型的癌癥的免疫診斷的臨床應(yīng)用。發(fā)現(xiàn)癌癥患者和正常人血清CA215水平是顯著差異(P<0.001)。由于臨床分期，在卵巢癌的情況下，相比正常個(gè)體其陽性率范圍從58-86％不等。對于宮頸癌患者，在癌癥晚期的階段陽性率分別高達(dá)66-94％。宮頸癌和卵巢癌這些臨床研究的結(jié)果還表明，平均血清CA215水平在術(shù)前階段并在一周外科手術(shù)或化療或放療之前之內(nèi)維持在相當(dāng)高的水平。相反，當(dāng)手術(shù)操作或化療或放療七天后測定，血清CA215水平顯著下降?；谶@些研究，可以得出結(jié)論認(rèn)為，癌癥患者的子宮頸和卵巢癌之間的手術(shù)切除或化學(xué)治療導(dǎo)致在CA215水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少。結(jié)果表明，CA215在癌癥患者中最可能從腫瘤部位產(chǎn)生，且該腫瘤負(fù)荷可由癌癥患者的血清CA215水平充分地反映檢測到。因此，癌癥患者的血清CA215水平的例行檢測對監(jiān)測癌癥發(fā)展的計(jì)劃之后治療或手術(shù)治療的狀態(tài)是有益的。作為一個(gè)泛癌標(biāo)志物，CA215比癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，CEA)或β2微球蛋白更好，在大多數(shù)癌癥中具有更高的顯示陽性檢出率。對于大多數(shù)人類癌癥CA215陽性檢出率都比較高，包括卵巢癌。然而，在子宮頸癌的情況下，使用CA215組合檢測比單獨(dú)用CA125有更高的檢出率，檢出率從13％提升至81％。然而，對于卵巢癌用CA215和CA125的組合也有更好的檢出率，檢測率從59％提升至82％。對于肺癌，CA215和CYFRA21-1組合檢測也具有較好的陽性檢出率。對于肝癌，CEA或甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)與CA215的組合似乎有更高的陽性檢出率。總之，其他癌癥生物標(biāo)志物與CA215的組合可以提高在常規(guī)臨床診斷癌癥中的陽性檢出率。上世紀(jì)70年代中期Arakawe首次報(bào)道用發(fā)光信號進(jìn)行酶免疫分析，利用發(fā)光的化學(xué)反應(yīng)分析超微量物質(zhì)，特別是用于臨床免疫分析中檢驗(yàn)超微量活性物質(zhì)。目前，這一技術(shù)已從實(shí)驗(yàn)室的稀有技術(shù)過渡到臨床醫(yī)學(xué)的常規(guī)檢測手段?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA)是將化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫測定技術(shù)。其檢測原理與放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)和酶免疫((enzymeimmunoassay，EIA)相似，不同這處是以發(fā)光物質(zhì)作為底物，并借助其自身的發(fā)光強(qiáng)度直接進(jìn)行測定。在化學(xué)發(fā)光免疫分析中包含兩個(gè)部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)，其基本原理同酶聯(lián)免疫技術(shù)(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)的原理在于免疫反應(yīng)中的酶作用于發(fā)光底物。發(fā)光底物在酶的作用下，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并釋放出大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體。這種激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，可同時(shí)發(fā)射出光子。利用發(fā)光信號測量儀器即可測量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的待測物質(zhì)的量成正比。由此可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中待測物質(zhì)的含量?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析既具有放射免疫的高靈敏度，又具有酶聯(lián)免疫的操作簡便、快速的特點(diǎn)，易于標(biāo)準(zhǔn)化操作。且測試中不使用有害的試劑，試劑保持期長，應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷工作，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種CA215檢測試劑盒，可以定量檢測人類癌癥標(biāo)志物CA215的濃度，具有靈敏度高、線性范圍寬、非特異性低和穩(wěn)定性能好的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒包括磁分離劑、示蹤物標(biāo)記的CA215抗體、化學(xué)發(fā)光底物液以及校準(zhǔn)品；其中，所述磁分離劑為包被CA215抗體的磁微粒溶液；所述化學(xué)發(fā)光底物液為二乙醇胺緩沖液，所述二乙醇胺緩沖液包含3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽；所述校準(zhǔn)品采用CA215純品配制，其標(biāo)示濃度分別為0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml、100AU/ml。優(yōu)選的，所述磁分離劑按照以下方法制備：(1)活化磁微粒：取充分混勻后的羧基磁微粒放于離心管中，將離心管放置于磁分離架上，待羧基磁微粒完全被吸附分離后，去除上清液，加入MES緩沖液洗滌羧基磁微粒至少一次；再加入EDC溶液和NHS溶液將羧基磁微?；罨?2)包被磁微粒：用MES緩沖液洗滌活化后的羧基磁微粒至少一次，將離心管置于磁分離架上，分離去除上清液，加入2.5mg/ml的CA215抗體混勻，在室溫下反應(yīng)2～4小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，再將離心管置于磁分離架上，去除上清液，用乙醇胺溶液洗滌至少一次，然后再加入乙醇胺溶液于離心管中，室溫反應(yīng)2～4小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，去除上清液保存，其中，羧基磁微粒與CA215抗體的體積比為1：1；(3)采用磁珠懸浮液液將步驟(2)制備的包被磁微粒稀釋至0.1～1mg/ml。優(yōu)選的，所述羧基磁微粒為Fe3O4/Fe2O3磁性納米粒子和有機(jī)高分子材料的聚合物，其平均粒徑為0.5～5μm，優(yōu)選1～3μm，且所述羧基磁微粒表面帶有羧基、氨基和羥基中的一種或多種基團(tuán)。優(yōu)選的，上述磁珠懸浮液按照以下方法配制：稱取Tris-堿1.21g、氯化鈉4.38g和Proclin3000.2g加入200ml的純化水，混勻后靜置10min后用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值8.5±0.5，然后加入2g海藻糖、10gBSA、1g明膠、1mol/L的氯化鎂0.5ml、1mol/L的氯化鋅0.05ml、1mol/L的氯化鈣0.1ml和0.5mL的T-20，用純化水定容到500mL，過濾得到磁珠懸浮液。優(yōu)選的，所述示蹤物為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、金剛烷、魯米諾、異魯米諾及其衍生物、吖啶酯中的至少一種，優(yōu)選堿性磷酸酶。優(yōu)選的，所述示蹤物標(biāo)記的CA215抗體中CA215抗體濃度為1～300ng/ml。本發(fā)明同時(shí)提供一種CA215檢測試劑盒的制備方法，所述CA215檢測試劑盒包括磁分離劑、示蹤物標(biāo)記的CA215抗體、化學(xué)發(fā)光底物液、校準(zhǔn)品以及洗滌液，其制備方法包括如下步驟：(1)制備磁分離試劑活化磁微粒：取羧基磁微粒于離心管中并充分混勻，將離心管放置于磁分離架上，待羧基磁微粒完全被吸附分離后，去除上清液，加入MES緩沖液洗滌羧基磁微粒至少一次；再加入EDC溶液和NHS溶液將羧基磁微?；罨话淮盼⒘＃河肕ES緩沖液洗滌活化后的羧基磁微粒至少一次，將離心管置于磁分離架上，分離去除上清液，加入2.5mg/ml的CA215抗體混勻，在室溫下反應(yīng)2～4小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，再將離心管置于磁分離架上，去除上清液，用乙醇胺溶液洗滌至少一次，然后再加入乙醇胺溶液于離心管中，室溫反應(yīng)2～4小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，去除上清液保存，其中羧基磁微粒與CA215抗體的體積比為1：1；采用磁珠懸浮液將制備的包被磁微粒稀釋至0.1～1mg/ml得到磁分離劑的工作液；(2)制備示蹤物標(biāo)記的CA215抗體：活化堿性磷酸酶：取20mg/ml的堿性磷酸酶置于反應(yīng)試管的底部，加入過量的40mmol/L的4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽，震蕩混勻，室溫條件下靜置反應(yīng)10～30min，然后加入1mol/L的甘氨酸溶液中和多余的4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽，反應(yīng)10min后用Zeba脫鹽柱純化，得到活化的堿性磷酸酶；活化CA215抗體：取5mg/ml的CA215單克隆抗體置于反應(yīng)試管的底部，加入過量的0.5mol/L的TCEP溶液，震蕩混勻，室溫條件下靜置反應(yīng)30-60min，然后加入1mol/L的甘氨酸溶液中和多余的TCEP溶液，反應(yīng)10分鐘，結(jié)束后馬上用Zeba脫鹽柱純化，得到活化的CA215抗體；將活化好的堿性磷酸酶和活化好的CA215抗體按質(zhì)量比1:1混合，在2-8℃條件下反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后用分子篩層析的方法得到純化好的CA215抗體-酶結(jié)合物；采用工作稀釋液將純化好的CA215抗體-酶結(jié)合物稀釋至1～300ng/ml，得到示蹤物標(biāo)記的CA215抗體的工作液；(3)配制化學(xué)發(fā)光底物液：分別稱取3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽0.2g、熒光增白劑2.5-二-雙(苯并惡唑-2-)噻吩0.1g、牛血清蛋白5g、BDMQ表面活性劑1g和proclin30010g，然后加入0.4mmol/L的MgSO40.1ml、0.8mmol/LZnCl20.1ml和0.1mol/L的二乙醇胺緩沖液500ml，混勻15分鐘，然后加入0.1mol/L的二乙醇胺緩沖液定容到1000ml，混勻過濾待用，放置在2-8℃條件下避光保存；(4)配制校準(zhǔn)品系列：采用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋CA215純品，得到校準(zhǔn)品，所述磷酸鹽緩沖液包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的BSA和0.05％的防腐劑，其中防腐劑為Proclin-300，所述校準(zhǔn)品系列的標(biāo)示濃度分別為0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml和100AU/ml；(5)配制洗滌液：取三羥甲基氨基甲烷2.24g、8.76g氯化鈉和0.5ml吐溫-20加水定容至1000ml，混勻過濾即可；(6)將磁分離劑、示蹤物標(biāo)記的CA215抗體、化學(xué)發(fā)光底物液、校準(zhǔn)品以及洗滌液組裝成所述CA215檢測試劑盒。優(yōu)選的，所述制備磁分離劑的步驟中，所述磁珠懸浮液按照以下方法配制：稱取Tris-堿1.21g、氯化鈉4.38g和Proclin3000.2g加入200ml的純化水，混勻后靜置10min后用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值8.5±0.5，然后加入2g海藻糖、10gBSA、1g明膠、1mol/L的氯化鎂0.5ml、1mol/L的氯化鋅0.05ml、1mol/L的氯化鈣0.1ml和0.5mL的T-20，用純化水定容到500mL，混勻過濾得到磁珠懸浮液液。優(yōu)選的，所述制備示蹤物標(biāo)記的CA215抗體的步驟中，所述工作稀釋液各組分含量如下:1％-5％體積的牛血清白蛋白、1-5％體積的鼠血清、1-10％體積的新生牛血清、1-5％體積的馬血清、1-5％體積的豬血清、8g/L的氯化鈉、0.2g/L的氯化鉀、2.9g/L磷酸氫二鈉、0.2g/L磷酸二氫鉀、10-30g/L海藻糖、0.1～1g/L4-甲酰苯基硼酸、0.1-5％體積的丙三醇、0.1-3％體積的乙二醇、0.1-20g/L黃原膠、0.01-1％體積的吐溫-20、0.1-1g/L乙二胺四乙酸、1％體積的Proclin-300、0.1-0.5％體積的慶大霉素。本發(fā)明還提供一種采用上文所述的CA215檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟：取出CA215檢測試劑盒，將所述CA215檢測試劑盒平衡至室溫，并將所述CA215檢測試劑盒中的試劑取出備用；取出待測的血清樣本平衡至室溫；按照校準(zhǔn)品和待測的血清樣本的數(shù)量準(zhǔn)備反應(yīng)管，并且編號，分別向試管中加入50μl的血清樣本以及校準(zhǔn)品，然后向每支試管中加入100μl示蹤物標(biāo)記的CA215抗體，再分別加入25μl的磁分離劑，37℃下充分振蕩，然后置于磁分離架上分離；倒出上清液，用洗滌液清洗；每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)均加入化學(xué)發(fā)光底物100μl，充分混勻后放入化學(xué)發(fā)光測量儀中進(jìn)行檢測；獲取檢測結(jié)果：直接讀取各反應(yīng)管的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度RLU值，以校準(zhǔn)品的濃度值為橫坐標(biāo)，校準(zhǔn)品的RLU值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測的血清樣本的濃度值，直接從化學(xué)發(fā)光測量儀讀取或?qū)С?。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒及其制備方法和使用方法，具有以下有益效果：一、本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒，是一種新的腫瘤標(biāo)志物，其他癌癥生物標(biāo)志物與CA215的組合可以提高在常規(guī)臨床診斷癌癥中的陽性檢出率。并且本試劑的反應(yīng)模式是夾心法，特異性好，靈敏度高，無HOOK效應(yīng)，線性范圍廣；二、本發(fā)明將羧基磁微粒引入到免疫檢測技術(shù)當(dāng)中，使試劑反應(yīng)的體系均一，能極大地提高抗原抗體結(jié)合的效率，縮短了反應(yīng)時(shí)間；三、堿性磷酸酶的標(biāo)記不同于一般的戊二醛法和過碘酸鈉法，所用的雙功能交聯(lián)法，使試劑盒具備更高的靈敏度和線性范圍，并且非特異性低，穩(wěn)定性好。四、由于采用了公司底物液的AMPPD/新增強(qiáng)劑技術(shù)，發(fā)光底物液靈敏度高、發(fā)光持續(xù)時(shí)間長，極大的提高了試劑的靈敏度。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中：圖1為本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒CA215檢測劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒的制備方法步驟流程圖；圖3為本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒的使用方法步驟流程圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的技術(shù)原理如下：本發(fā)明采用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測泛癌標(biāo)志物CA215的濃度值，在反應(yīng)管中加入CA215校準(zhǔn)品或待測血清樣本，再加入示蹤物標(biāo)記的CA215單克隆抗體進(jìn)行反應(yīng)，再加入包被CA215單克隆抗體的磁微粒溶液，包被的CA215單克隆抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的CA215單克隆抗體分別與CA215抗原分子的不同表位結(jié)合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)。沒有結(jié)合的堿性磷酸酶標(biāo)記的CA215單克隆抗體在洗滌步驟中被除去。加入化學(xué)發(fā)光底物液，在發(fā)光儀上讀取發(fā)光值(RLU)，發(fā)射的光的強(qiáng)度與樣品中的CA215濃度成正比，通過CA215檢測劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可定量獲得CA215的濃度值，CA215檢測劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。實(shí)施例中CA215抗體和CA215純品由加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)的QegoryLee教授贈(zèng)與，磁微粒購于日本JSR公司。實(shí)施例一CA215檢測試劑盒所述CA215檢測試劑盒包括磁分離劑、示蹤物標(biāo)記的CA215抗體、化學(xué)發(fā)光底物液、校準(zhǔn)品以及洗滌液。所述磁分離劑為包被CA215抗體的磁微粒溶液，所述磁分離劑中CA215抗體的包被濃度為0.1～1mg/mL。其中，磁微粒為Fe3O4/Fe2O3磁性納米粒子和有機(jī)高分子材料的聚合物，即Fe3O4/Fe2O3為內(nèi)核，其微球表面帶有羧基、氨基和羥基中的一種或多種基團(tuán)。所述磁微粒平均粒徑為0.5～5μm，優(yōu)選1～3μm。所述示蹤物標(biāo)記的CA215抗體中的用于標(biāo)記CA215抗體的示蹤物可以為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、金剛烷、魯米諾、異魯米諾及其衍生物、吖啶酯中的至少一種，優(yōu)選堿性磷酸酶。所述示蹤物標(biāo)記的CA215抗體中CA215抗體濃度為1～300ng/ml。所述化學(xué)發(fā)光底物液為二乙醇胺緩沖液，每升二乙醇胺緩沖液中包括3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽(AMPPD)0.2g、熒光增白劑2.5-二-雙(苯并惡唑-2-)噻吩(EBF)0.1g、牛血清蛋白(BSA)5g、BDMQ表面活性劑1g和proclin30010g、0.4mmol/L的MgSO40.1ml和0.8mmol/LZnCl20.1ml，其余為0.1mol/L的二乙醇胺。所述校準(zhǔn)品采用CA215純品配制，在本實(shí)施例中，共配制了6種標(biāo)示濃度的校準(zhǔn)品，其標(biāo)示濃度分別為0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml、100AU/ml。所述洗滌液為pH7.0～8.0的中性緩沖液，取三羥甲基氨基甲烷2.24g、8.76g氯化鈉和0.5ml吐溫-20加水定容至1000ml，混勻過濾即可。請參閱圖2，為本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒的制備方法步驟流程圖。實(shí)施例二CA215檢測試劑盒的制備方法所述CA215檢測試劑盒的制備方法包括如下步驟：1)制備磁分離劑：活化磁微粒：充分混勻羧基磁微粒后，取100μl的羧基磁微粒到1.5ml的離心管中，置于磁分離架上，待分離后去除上清液，取200μl100mmol/L的MES緩沖液(pH5.0)加入到離心管中，置于磁分離架上，待分離后去除上清液，重復(fù)清洗3次，迅速加入新配制的50μl50mg/ml的EDC溶液和50μl50mg/ml的NHS溶液到裝有羧基磁微粒的離心管中，混勻羧基磁微粒充分懸浮，室溫下反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后，用100μl100mmol/L的MES緩沖液(pH5.0)洗滌3次；包被磁微粒：將上述活化好的羧基磁微粒置于磁分離架上，分離去除上清液，加入100μl2.5mg/ml的CA215抗體，清柔的混勻；在室溫下反應(yīng)2h；反應(yīng)結(jié)束后將離心管置于磁分離架上，去除上清液，加入100μl3mol/L的乙醇胺溶液(pH9.0)洗滌3次，然后再加入100μl3mol/L的乙醇胺溶液(pH9.0)于離心管中，室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，去除上清液，加入適量的保存液保存，所述保存液為含有1％BSA和0.1mol/LPBS的緩沖液，其pH＝7.4；采用磁珠懸浮液將上述CA215抗體包被的羧基磁微粒稀釋至0.1～1mg/ml，即所述磁分離劑包被的CA215抗體濃度為0.1～1mg/ml，得到磁分離劑的工作液。其中所述磁珠懸浮液按照以下方法配制：稱取Tris-堿1.21g、氯化鈉4.38g和Proclin3000.2g加入200ml的純化水，混勻后靜置10min后用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值8.5±0.5，然后加入2g海藻糖、10gBSA、1g明膠、1mol/L的氯化鎂0.5ml、1mol/L的氯化鋅0.05ml、1mol/L的氯化鈣0.1ml和0.5mL的T-20，用純化水定容到500mL，混勻過濾得到磁珠懸浮液。2)制備示蹤物標(biāo)記的CA215抗體：(1)活化堿性磷酸酶：取0.02ml20mg/ml的堿性磷酸酶置于反應(yīng)試管的底部，稱取2mg的4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(sulfo-smcc)，用純化水溶解至40mmol/L(17.5mg/ml)，在含有堿性磷酸酶的反應(yīng)試管中加入5ul的40mmol/L的sulfo-smcc溶液，震蕩混勻，室溫條件下靜置反應(yīng)10-30min，然后加入1mol/L的甘氨酸溶液0.5μl中和多余的sulfo-smcc，反應(yīng)10min，結(jié)束后馬上用Zeba脫鹽柱純化，得到活化的堿性磷酸酶；(2)活化CA215抗體：取0.5ml5mg/ml的CA215單克隆抗體置于反應(yīng)試管的底部，稱取6mg的TCEP，用pH7.2的PBS溶解得到0.5mol/L的TCEP溶液，在含有CA215抗體的反應(yīng)試管中加入50μlTCEP溶液，震蕩混勻，室溫條件下靜置反應(yīng)30-60min，然后加入1mol/L的甘氨酸溶液1μl中和多余的TCEP，反應(yīng)10分鐘，結(jié)束后馬上用Zeba脫鹽柱純化，得到活化的CA215抗體；(3)將上述活化好的抗體和活化好的堿性磷酸酶按質(zhì)量比1:1混合，在2-8℃條件下反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后用分子篩層析的方法得到純化好的CA215抗體-酶結(jié)合物；采用工作稀釋液將純化好的CA215抗體-酶結(jié)合物稀釋至1～300ng/ml，即所述示蹤物標(biāo)記的CA215抗體中CA215抗體濃度為1～300ng/ml，得到示蹤物標(biāo)記的CA215抗體工作液。其中所述工作稀釋液各組分含量如下:1％-5％體積的牛血清白蛋白、1-5％體積的鼠血清、1-10％體積的新生牛血清、1-5％體積的馬血清、1-5％體積的豬血清、8g/L的氯化鈉、0.2g/L的氯化鉀、2.9g/L磷酸氫二鈉、0.2g/L磷酸二氫鉀、10-30g/L海藻糖、0.1～1g/L4-甲酰苯基硼酸、0.1-5％體積的丙三醇、0.1-3％體積的乙二醇、0.1-20g/L黃原膠、0.01-1％體積的吐溫-20、0.1-1g/L乙二胺四乙酸、1％體積的Proclin-300、0.1-0.5％體積的慶大霉素。3)配制化學(xué)發(fā)光底物液：分別稱取3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽(AMPPD)0.2g、熒光增白劑2.5-二-雙(苯并惡唑-2-)噻吩(EBF)0.1g、牛血清蛋白(BSA)5g、BDMQ表面活性劑1g和proclin30010g，然后加入0.4mmol/L的MgSO40.1ml、0.8mmol/LZnCl20.1ml和0.1mol/L的二乙醇胺緩沖液500ml，混勻15分鐘，然后加入0.1mol/L的二乙醇胺緩沖液定容到1000ml，混勻過濾待用，放置在2-8℃條件下避光保存；4)配制校準(zhǔn)品：采用pH7.4磷酸鹽緩沖液稀釋CA215純品，定標(biāo)得到校準(zhǔn)品，所述磷酸鹽緩沖液包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的BSA和0.05％的防腐劑，其中防腐劑為Proclin-300，所述校準(zhǔn)品的標(biāo)示濃度分別為0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml和100AU/ml。5)配制洗滌液：取三羥甲基氨基甲烷2.24g、8.76g氯化鈉和0.5ml吐溫-20加水定容至1000ml，混勻過濾即可。6)將磁分離劑、示蹤物標(biāo)記的CA215抗體、化學(xué)發(fā)光底物液、校準(zhǔn)品以及洗滌液組裝成所述CA215檢測試劑盒。請參閱圖3，為本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒的使用方法步驟流程圖。實(shí)施例三CA215檢測試劑盒的使用方法CA215檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟：S1、取出CA215檢測試劑盒，將所述CA215檢測試劑盒平衡至室溫，并將所述CA215檢測試劑盒中的試劑取出備用：具體地，將所述CA215檢測試劑盒置室溫(18～25℃)下平衡30分鐘；S2、取出待測的血清樣本平衡至室溫：具體地，將待測的血清樣本置室溫(18～25℃)平衡30分鐘。S3、按照校準(zhǔn)品和待測的血清樣本的數(shù)量準(zhǔn)備試管，并且編號，分別向試管中加入50μl的血清樣本以及校準(zhǔn)品，然后每支試管中加入100μl示蹤物標(biāo)記的CA215抗體，再分別加入25μl的磁分離劑，37℃下充分振蕩，然后置于磁分離架上分離；具體地，試管數(shù)量為7個(gè)，每個(gè)試管內(nèi)分別加入濃度為0AU/ml、5AU/ml、10AU/ml、20AU/ml、50AU/ml和100AU/ml的六個(gè)校準(zhǔn)品以及待測的血清樣本；S4、倒出上清液，用洗滌液清洗；S5、每個(gè)試管內(nèi)均加入化學(xué)發(fā)光底物100μl，充分混勻后用化學(xué)發(fā)光測量儀中進(jìn)行檢測；S6、獲取檢測結(jié)果：直接讀取測量各試管的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度RLU值，以校準(zhǔn)品的濃度值為橫坐標(biāo)，校準(zhǔn)品的RLU值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測的血清樣本的濃度值，直接從化學(xué)發(fā)光測量儀讀取或?qū)С?。?shí)施例四CA215檢測試劑盒的分析性能評價(jià)首先利用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對CA215標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，繪制檢測劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，參見圖1所示，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)置于電腦軟件中，接著測試已知含量樣品和校準(zhǔn)品等，讀取發(fā)光值或根據(jù)劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出發(fā)光值對應(yīng)的濃度，對所述CA215檢測試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確性、特異性、精密度、最低檢測限和穩(wěn)定性的評價(jià)。1)準(zhǔn)確性CA215定量檢測試劑盒的方法學(xué)鑒定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及鑒定規(guī)程對實(shí)施例1的CA215檢測試劑盒進(jìn)行檢定結(jié)果如下：將已知含量樣品用本發(fā)明實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算回收率(回收率＝回收量/加入量×100％)，結(jié)果如下表所示：加入量AU/ml5102550回收量AU/ml4.9410.6526.1151.02回收率％98.80106.50104.44102.042)特異性將已知含量類似物用本發(fā)明實(shí)施例1中的CA215檢測試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果如下表所示：3)精密性檢測濃度分別為5AU/ml的質(zhì)控品1和50AU/ml的質(zhì)控品2的發(fā)光值，質(zhì)控品1和質(zhì)控品2的濃度分別做10個(gè)平行孔重復(fù)測定其發(fā)光值，計(jì)算CV值(CoefficientofVariance，離散系數(shù)，為標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值比值的百分比)，結(jié)果如下表所示：4)最低檢測限重復(fù)測定標(biāo)示濃度為零的校準(zhǔn)品(或樣本稀釋液)10次，計(jì)算出發(fā)光值的均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，將的反應(yīng)量代入CA215檢測劑量-反應(yīng)曲線，計(jì)算出相應(yīng)濃度值，即為最低檢測限，結(jié)果如下表所示：5)穩(wěn)定性試劑盒中各組分置37℃7天后測試準(zhǔn)確性，最低檢測限，精密度，曲線相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如下：將以上結(jié)果匯總得出：檢測項(xiàng)目檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性回收率在95％～110％符合標(biāo)準(zhǔn)特異性本試劑盒測定結(jié)果應(yīng)不大于1AU/ml符合標(biāo)準(zhǔn)精密性CV(％)小于15％(n＝10)符合標(biāo)準(zhǔn)靈敏度小于1AU/ml符合標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性試劑盒中各組分置37℃至少7天符合標(biāo)準(zhǔn)從上述匯總表可以看到說明所述CA215檢測試劑盒各項(xiàng)性能指標(biāo)均合格，且具有準(zhǔn)確性高、特異性高、精密性好、靈敏度高和穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例五：正常人的CA215的含量和臨界值的確定隨機(jī)抽取200例健康人血清用實(shí)施例1中的CA215檢測試劑盒進(jìn)行測定，匯總所有測定值，以百分位數(shù)法確定其臨界值(95％位數(shù)的參考限)，參考值范圍≤6.3AU/ml。實(shí)施例六：隨機(jī)抽取60例卵巢癌患者血清，用實(shí)施例1中的制備的CA215定量試劑盒進(jìn)行測定，匯總所有測定值，平均濃度為20.74AU/ml，顯著高于健康人血清測值。實(shí)施例七：隨機(jī)抽取60例宮頸癌患者血清，用實(shí)施例1中的制備的CA215定量試劑盒進(jìn)行測定，匯總所有測定值，平均濃度為31.08AU/ml，顯著高于健康人血清測值。本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒及其制備方法和使用方法，具有以下有益效果：一、本發(fā)明提供的CA215檢測試劑盒，是一種新的腫瘤標(biāo)志物，其他癌癥生物標(biāo)志物與CA215的組合可以提高在常規(guī)臨床診斷癌癥中的陽性檢出率。并且本試劑的反應(yīng)模式是夾心法，特異性好，靈敏度高，無HOOK效應(yīng)，線性范圍廣；二、本發(fā)明將羧基磁微粒引入到免疫檢測技術(shù)當(dāng)中，使試劑反應(yīng)的體系均一，能極大地提高抗原抗體結(jié)合的效率，縮短了反應(yīng)時(shí)間；三、堿性磷酸酶的標(biāo)記不同于一般的戊二醛法和過碘酸鈉法，所用的雙功能交聯(lián)法，使試劑盒具備更高的靈敏度和線性范圍，并且非特異性低，穩(wěn)定性好。四、由于采用了公司底物液的AMPPD/新增強(qiáng)劑技術(shù)，發(fā)光底物液靈敏度高、發(fā)光持續(xù)時(shí)間長，極大的提高了試劑的靈敏度。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3