本發(fā)明屬于臨床體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：
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丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)是能夠催化丙氨酸與α-酮戊二酸之間的氨基轉(zhuǎn)移酶，是一種參與人體蛋白質(zhì)新陳代謝的酶，起著加快人體內(nèi)蛋白質(zhì)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的作用，該酶廣泛存在于人體各種組織、器官、肌肉、骨骼中，以肝臟細(xì)胞的細(xì)胞漿中最多。一旦有肝細(xì)胞遭到損害、肝功能下降、肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞內(nèi)的ALT即可釋放到細(xì)胞外，從而導(dǎo)致血清中ALT含量升高。ALT活性升高表示有肝細(xì)胞損傷，也可見于心肌及骨骼肌損傷。血清ALT活性是肝細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)，尤其是病毒性肝炎的重要標(biāo)志，目前ALT臨床上主要用來檢測(cè)肝功能。

體外檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的方法主要有賴氏比色法、丙酮酸氧化酶法及連續(xù)監(jiān)測(cè)法(速率法)。賴氏比色法的缺點(diǎn)是易受反應(yīng)產(chǎn)物丙酮酸的反饋抑制影響，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度不高；丙酮酸氧化酶法雖然測(cè)定結(jié)果較好，但所用的4-氨基安替比林有毒、有致畸性，不滿足綠色原則；連續(xù)監(jiān)測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)是可以確定線性期并計(jì)算每分鐘吸光度的變化(ΔA/min)，根據(jù)此值再準(zhǔn)確地計(jì)算酶活性，可以利用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)；酶和底物反應(yīng)的特異性好，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高。以上三種方法相比較，采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法較佳。

本發(fā)明的試劑盒主要采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)原理為：ALT催化L-丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移至α-酮戊二酸，生成丙酮酸和L-谷氨酸。乳酸脫氫酶(LDH)催化丙酮酸還原的同時(shí)將還原型輔酶(NADH)氧化成氧化型輔酶(NAD⁺)，由于NADH在340nm處有特征吸收，所以NADH的下降速率和ALT的活力成正比。反應(yīng)式如下：

目前ALT檢測(cè)試劑盒多采用丙酮酸氧化酶法，如CN 103320497 B(2015.09.09)、CN 100595282 C(2010.03.24)、CN 1086205 C(2002.06.12)均采用此法；CN 104195220 A(2014.12.10)主要講到緩沖液對(duì)ALT試劑的影響；CN 104404127 A(2015.03.11)所述ALT試劑盒采用單一試劑，無法消除內(nèi)源性干擾。本發(fā)明涉及的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒采用液體雙試劑，可以有效消除內(nèi)源性干擾，無需樣本前處理，可直接利用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行大批量樣本檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，適合臨床應(yīng)用推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒供臨床應(yīng)用，主要解決現(xiàn)有ALT檢測(cè)領(lǐng)域存在的準(zhǔn)確度低、操作繁瑣、污染環(huán)境、試劑不穩(wěn)定等問題。

為了解決本發(fā)明內(nèi)源性α-酮戊二酸對(duì)丙氨酸(ALT)測(cè)定的干擾，采用如下技術(shù)方案：采用兩步法檢測(cè)，血清與(缺少α-酮戊二酸)的底物溶液混合，37℃保溫5min，使樣品中所含內(nèi)源性α-酮戊二酸引起的副反應(yīng)進(jìn)行完畢。然后加入α-酮戊二酸啟動(dòng)ALT的催化反應(yīng)，在主波長(zhǎng)340nm處連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度下降速率，根據(jù)線性反應(yīng)期吸光度下降速率(-ΔA/min)，計(jì)算出ALT活力。

本發(fā)明提供的試劑盒由試劑1和試劑2組成，其中試劑1的組成和成份如下：

Tris-HCl緩沖液 120mmol/L-180mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 650mmol/L-850mmol/L

還原型輔酶(NADH) 0.2mmol/L-0.4mmol/L

乳酸脫氫酶(LDH) 2000U/L-3000U/L

酶保護(hù)劑

穩(wěn)定劑

防腐劑

試劑2的組成和成份如下：

Tris-HCl緩沖液 60mmol/L-100mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 35mmol/L-55mmol/L

穩(wěn)定劑

防腐劑

所述酶保護(hù)劑選自牛血清白蛋白(BSA)或甘油與糖類中的一種或多種組合物，其用量為BSA0.1％-2％，甘油5％-20％，優(yōu)選為BSA 0.5％-1.5％，甘油10％-15％。

以上所述糖類可選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖中的一種或多種，其用量為1g/L-15g/L，優(yōu)選為5g/L-10g/L。

所述試劑1和試劑2的穩(wěn)定劑均選自KCl及表面活性劑組合物，其用量為KCl 1g/L-15g/L，優(yōu)選為5g/L-10g/L。

以上所述表面活性劑可選自吐溫-20(Tween-20)、吐溫-80(Tween-80)、曲拉通X-100(Triton X-100)、聚乙二醇6000(PEG 6000)及聚乙二醇8000(PEG 8000)中的一種或多種，其用量為0.1％-2％，優(yōu)選為0.5％-1.5％。

所述試劑1和試劑2的防腐劑均可選自NaN₃或Proclin-300，其用量為NaN₃ 0.1g/L-2g/L，Proclin-3000.1％-2％，優(yōu)選為NaN₃ 0.6g/L-1g/L，Proclin-3000.5％-1％。

本發(fā)明丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測(cè)試劑盒適用于各類全自動(dòng)生化分析儀，現(xiàn)于全自動(dòng)生化分析儀BS-420上的應(yīng)用，其具體使用方法如下：

表1 樣本檢測(cè)操作程序

計(jì)算方法：樣品中的ALT含量(U/L)＝ΔAT/min×F

ΔAT/min：測(cè)定管平均每分鐘相對(duì)空白管吸光度變化

注：TV：試劑樣品總體積，SV為樣品體積；6.22：NADH在340nm處的毫摩爾分子吸光系數(shù)；

1.0：比色皿光徑(cm)；1000：U/mL到U/L的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

本發(fā)明所使用的質(zhì)控品為羅氏高、低值質(zhì)控品；所測(cè)樣品為不溶血血清。

有益效果：本發(fā)明丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒為液體雙試劑，采用兩步法，有效消除內(nèi)源性α-酮戊二酸干擾，提高了ALT測(cè)定的準(zhǔn)確度；本發(fā)明試劑盒中加入酶保護(hù)劑和穩(wěn)定劑，提高了ALT試劑盒的穩(wěn)定性，于37℃水浴可穩(wěn)定至少一周，說明2-8℃保存可以至少穩(wěn)定一年。

以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，具體實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

附圖說明：

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1-3及對(duì)比實(shí)施例2-8℃保存一周的空白吸光度變化對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1-3及對(duì)比實(shí)施例37℃水浴一周的空白吸光度變化對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

Tris-HCl緩沖液 120mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 650mmol/L

NADH 0.2mmol/L

LDH 2000U/L

KCl 5g/L

曲拉通X-100 1％

甘油 15％

蔗糖 5g/L

NaN₃ 1g/L

試劑2的組成：

Tris-HCl緩沖液 100mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 35mmol/L

KCl 6g/L

PEG 8000 1.5％

NaN₃ 0.6g/L

實(shí)施例2

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

Tris-HCl緩沖液 150mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 750mmol/L

NADH 0.3mmol/L

LDH 2500U/L

KCl 8g/L

吐溫-20 1％

BSA 1.5％

麥芽糖 10g/L

Proclin-300 0.8％

試劑2的組成：

Tris-HCl緩沖液 80mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 45mmol/L

KCl 8g/L

PEG 6000 1％

Proclin-300 0.5％

實(shí)施例3

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

Tris-HCl緩沖液 180mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 850mmol/L

NADH 0.4mmol/L

LDH 3000U/L

KCl 10g/L

吐溫-80 1.5％

PEG 8000 0.5％

甘油 10％

果糖 6g/L

葡糖糖 8g/L

Proclin-300 1％

試劑2的組成：

Tris-HCl緩沖液 60mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 55mmol/L

KCl 10g/L

曲拉通X-100 0.5％

PEG 6000 0.5％

Proclin-300 0.8％

對(duì)比實(shí)施例

不加穩(wěn)定劑和酶保護(hù)劑的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)試劑盒，由試劑1和試劑2組成，具體成分及含量如下：

試劑1的組成：

Tris-HCl緩沖液 180mmol/L，PH＝8.4

L-丙氨酸 850mmol/L

NADH 0.4mmol/L

LDH 3000U/L

NaN₃ 1g/L

試劑2的組成：

Tris-HCl緩沖液 60mmol/L，PH＝7.2

α-酮戊二酸 55mmol/L

NaN₃ 0.6g/L

將本發(fā)明實(shí)施例1-3及對(duì)比實(shí)施例進(jìn)行準(zhǔn)確度驗(yàn)證試驗(yàn)。質(zhì)控品選用羅氏高值質(zhì)控(ALT靶值：118 U/L，靶值范圍(±10％)：106.2U/L-129.8U/L)；羅氏低值質(zhì)控(ALT靶值：37U/L，靶值范圍(±10％)：33.3U/L-40.7U/L)。采用BS-420全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，具體操作方法如表一所述，采用單點(diǎn)定標(biāo)法定標(biāo)后，ALT測(cè)定值及空白吸光度值可從儀器上直接讀取，為了減少偶然誤差，重復(fù)測(cè)定三次取均值。

實(shí)施例1-3及對(duì)比實(shí)施例準(zhǔn)確度結(jié)果如下：

表2 實(shí)施例1-3及對(duì)比實(shí)施例準(zhǔn)確度比較

將本發(fā)明實(shí)施例1-3及對(duì)比實(shí)施例進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證試驗(yàn)。將以上四種試劑盒每種平均分成兩份，一份至于2-8℃保存，另一份至于37℃水浴中保存，每隔一天測(cè)定一次，連續(xù)監(jiān)測(cè)一周，觀察空白吸光度變化及血清測(cè)定值(血清定值75.6U/L，允許誤差范圍(±10％)：68.04U/L-83.16U/L)，通過空白吸光度的變化和準(zhǔn)確度的測(cè)定比較試劑穩(wěn)定性。

表3 實(shí)施例1試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表4 實(shí)施例2試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表5 實(shí)施例3試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

表6 對(duì)比實(shí)施例試劑盒穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

由表2可知實(shí)施例1-3制得的試劑盒準(zhǔn)確度均在允許的誤差范圍(±10％)內(nèi)，而對(duì)比實(shí)施例制得的試劑盒準(zhǔn)確度超出了誤差允許范圍：由圖1和圖2可以看出，實(shí)施例1-3制得的試劑盒的穩(wěn)定性明顯強(qiáng)于對(duì)比實(shí)施例制得的試劑盒。實(shí)施例1-3制得的試劑盒雖然試劑空白有一定程度的下降，但是下降的幅度不大，在允許范圍內(nèi)，說明加入合適的穩(wěn)定劑和酶保護(hù)劑可以減緩NADH的衰減、保護(hù)酶的活性，進(jìn)而提高試劑盒的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)試劑盒的保存期。