本發(fā)明涉及一種評估胃癌術后預后和化療敏感性的試劑和系統(tǒng)。

背景技術：

胃癌(Gastric cancer,GC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率排第四，死亡率排第二。僅在中國2015年新發(fā)生胃癌病人679,000例，胃癌死亡病人498,000例，嚴重加劇了全球，尤其是中國的疾病負擔。胃癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移和化療不敏感，是導致其預后差的重要原因。有效的預測胃癌患者術后的預后和化療敏感性，將可以選擇合適的治療人群和方式，為有效診治提供有力的支持。根據(jù)TNM(tumor,node,metastasis)系統(tǒng)和組織分型對胃癌進行的臨床分期，是目前最常用的預測預后和制定治療方案的參考標準。然而，大量的研究發(fā)現(xiàn)即使是臨床分期相同，治療方案一致的病人，他們的臨床結(jié)局也會有很大的差異。由于傳統(tǒng)臨床病理診斷和單一的分子標志物對患者術后預后和化療敏感性判斷的效力較低，因此多分子標記物聯(lián)合使用的試劑盒將是新的研發(fā)方向。

惡性腫瘤作為“永遠不能治愈的創(chuàng)傷”其發(fā)生發(fā)展是一個多步驟，多因素的過程。腫瘤的進展為腫瘤實質(zhì)細胞與間質(zhì)細胞的相互作用的結(jié)果。腫瘤相關成纖維細胞，免疫細胞，包括單核細胞，淋巴細胞，中性粒細胞等是腫瘤間質(zhì)重要組分。在這獨特的微環(huán)境中，免疫細胞在清除腫瘤的同時，腫瘤細胞通過細胞接觸和分泌可溶性分子等一系列手段進行免疫編輯，改變免疫細胞的表型和功能，進而發(fā)生免疫逃逸。在大量發(fā)表的癌癥相關的研究結(jié)果顯示，腫瘤組織免疫細胞浸潤對腫瘤病人的臨床預后和化療效果產(chǎn)生重要作用，而且腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移取決于宿主免疫系統(tǒng)的反應?；谀[瘤免疫評分的免疫分型對預后和化療敏感性的預測價值可能優(yōu)于當今臨床常規(guī)使用的臨床病理分期系統(tǒng)。

免疫組化利用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使顯色劑顯色來檢測組織標本中抗原的存在，并可以進行定位、定量分析。目前免疫組化已經(jīng)廣泛應用于臨床病理診斷，是一種直觀、可靠的檢測手段。不僅如此，隨著數(shù)字圖像分析技術的飛速發(fā)展，計算機輔助的病理診斷和分析逐漸受到重視和應用，并具有高效、客觀、準確等優(yōu)點。

由于胃癌組織具有很大程度的異質(zhì)性，而且位于侵襲邊緣活躍的免疫反應也與疾病進展密切相關。因此，分子標記物檢測所采用的胃癌組織位置是非常重要的。傳統(tǒng)方法僅籠統(tǒng)檢測腫瘤組織，而忽視了侵襲邊緣和腫瘤中心的免疫反應的差異，大樣本的研究結(jié)果表明侵襲邊緣中的一些免疫相關分子標記物具有更重要的預測胃癌預后和化療療效的效力。因此將檢測分子標記物部位分為侵襲邊緣和腫瘤中心可以同時檢測兩個部位中相關標記物的表達水平。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的不足之處而提供了一種評估胃癌術后預后和化療敏感性的試劑，本發(fā)明提供了該試劑在制備評估胃癌術后預后和化療敏感性的試劑盒中的用途，本發(fā)明還提供了一種用于胃癌術后預后和化療敏感性評估的系統(tǒng)。

為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術方案：一種用于胃癌術后預后和化療敏感性評估的試劑，所述試劑包括檢測CD3的第一抗體，檢測CD8的第一抗體，檢測CD45RO的第一抗體，檢測CD66b的第一抗體，以及辣根過氧化物酶標記的第二抗體。

優(yōu)選地，所述檢測CD3的第一抗體為clone SP7，所述檢測CD8的第一抗體為clone SP16，所述檢測CD45RO的第一抗體為clone UCHL1，所述檢測CD66b的第一抗體。

優(yōu)選地，所述具有辣根過氧化物酶標記的第二抗體為山羊抗鼠/兔IgG的多克隆抗體。

本發(fā)明提供了上述所述的試劑在制備評估胃癌術后預后和化療敏感性的試劑盒中的用途。

本發(fā)明提供了CD3、CD8、CD45RO和CD66b聯(lián)合使用在制備評估胃癌術后預后和化療敏感性的試劑盒中的用途。

本發(fā)明提供了一種評估胃癌術后預后和化療敏感性的系統(tǒng)，包括：

數(shù)據(jù)輸入模塊，用于將患者分子指標的結(jié)果輸入模型計算模塊，所述分子指標包括CD3_IM、CD3_CT、CD8_IM、CD45RO_CT和CD66b_IM，其中IM代表侵襲邊緣，CT代表腫瘤中心；

模型計算模塊，包括免疫評分模型，用于根據(jù)患者分子指標的結(jié)果以及免疫評分模型計算患者免疫評分IS_GC結(jié)果；

結(jié)果輸出模塊，用于根據(jù)免疫評分結(jié)果判定患者是否獲得顯著的生存獲益；當患者IS_GC<0時，患者接受化療不能獲得生存獲益；當患者IS_GC≥0時，患者接受化療能夠獲得顯著的生存獲益。

進一步地，所述患者分子指標的結(jié)果是將分子指標陽性信號與分子指標陽性信號的閾值比較后得到的，分子指標陽性信號大于等于分子指標陽性信號的閾值，分子指標的結(jié)果為高表達，用數(shù)字1表示；分子指標陽性信號小于分子指標陽性信號的閾值，分子指標的結(jié)果為低表達，用數(shù)字0表示；CD3_IM,CD3_CT,CD8_IM,CD45RO_CT和CD66b_IM陽性信號的閾值分別為118、61、86、76和59；所述分子指標陽性信號的數(shù)值為200倍顯微鏡視野下的陽性細胞個數(shù)；

患者免疫評分IS_GC＝(0.149×CD3_IM)+(0.021×CD3_CT)+(0.044×CD8_IM)+(0.096×CD45RO_CT)－(0.173×CD66b_IM)。

通過綜合分析上述4種第一抗體的抗原在胃癌標本中侵襲邊緣和腫瘤中心的表達水平，達到預測患者接受手術切除腫瘤后預后和化療敏感性的目的。

本發(fā)明的主要優(yōu)點是：

(1)本發(fā)明所述系統(tǒng)非常成熟，操作過程簡便、直觀、易于重復，由普通的技術員均可以完成。

(2)利用人工輔助的半自動圖像定量分析，結(jié)果客觀準確，優(yōu)于人工半定量分析。

(3)通過本發(fā)明所述系統(tǒng)能夠很好地評估胃癌術后預后和化療敏感性情況。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中4種第一抗體在胃癌中的免疫組化染色結(jié)果；

圖2為本發(fā)明實施例1中在訓練組(N＝125)和測試組(N＝126)中預測術后1、3、5年無病生存率的ROC曲線和預測術后無病生存和整體生存曲線；

圖3為本發(fā)明實施例1中在內(nèi)部驗證組(N＝228)和外部驗證組(N＝300)中預測術后1、3、5年無病生存率的ROC曲線和預測術后無病生存和整體生存曲線；

圖4為本發(fā)明實施例1中在胃癌患者中檢測IS_GC高和低組患者接受化療和不接受化療的無病生存和整體生存曲線。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

首先，本發(fā)明染色9種標志物進行篩選，利用免疫組化的方法檢測9種分子標記物在251例接受切除術的胃癌石蠟切片(同時包括正常部位、侵襲邊緣和腫瘤中心)中的表達，并利用專業(yè)圖像軟件分析不同分子標記物分別在正常部位、侵襲邊緣和腫瘤中心中的陽性計數(shù)，用X-title軟件獲取每個分子標記物的分界值，獲得每個分子標記物的表達情況,從而得到27個分子指標。251例胃癌患者隨機劃分為訓練組和測試組，分別為125例和126例，用訓練組建立模型，用測試組驗證建立的模型是否合適。在訓練組中，利用LASSO COX回歸模型的方法獲得5個分子指標建立胃癌免疫評分(ImmunoScore of GC,IS_GC)。5個分子指標分別為CD3_IM,CD3_CT,CD8_IM,CD45RO_CT和CD66b_IM；其中IM(invasive margin)代表侵襲邊緣，CT(core of tumor)代表腫瘤中心。利用這5個分子指標結(jié)合LASSO COX回歸模型獲得的系數(shù)計算每個患者的免疫評分(IS_GC)，計算公式IS_GC＝(0.149×CD3_IM)+(0.021×CD3_CT)+(0.044×CD8_IM)+(0.096×CD45RO_CT)－(0.173×CD66b_IM)。為了簡化試劑盒的使用，用X-title軟件選取分界值為0，將患者分為IS_GC高和低兩組。生存分析表明利用IS_GC獲得的兩組患者的無病生存率和整體生存率均有顯著性差異(P<0.001)。多因素COX分析中，IS_GC可以作為獨立預測無病生存和整體生存的因素(P<0.001；如表1所示)。在測試組、納入了228例胃癌病人的內(nèi)部驗證組、納入了300例胃癌病人的外部驗證組例也得到了相似的結(jié)果(如表1所示)。所以IS_GC可以有效用于胃癌術后預后的預測。

其次，生存分析表明在II期和III期胃癌患者中，IS_GC高的患者接受化療能夠獲得顯著的生存獲益(P<0.05)，而IS_GC低的患者接受化療并不能獲得生存獲益(如圖3所示)。所以IS_GC可以預測胃癌患者的化療敏感性，為臨床選擇治療方案提供幫助。

表1多因素分析與生存相關的因素

外部驗證組(N＝300)^*:300例胃癌病人數(shù)據(jù)來自于中山大學附屬第一醫(yī)院。

注：COX比例風險回歸模型；單因素分析中具有顯著差異(P<0.05)的指標納入多因素分析；HR,風險比；CI,置信區(qū)間。

本發(fā)明所述用于評估胃癌術后預后和化療敏感性的試劑，包括檢測CD3的第一抗體、檢測CD8的第一抗體、檢測CD45RO的第一抗體和檢測CD66b的第一抗體，基于4種第一抗體均可以在胃癌組織石蠟切片中檢測到清晰的陽性信號(如圖1所示)來評估胃癌術后預后和化療敏感性，具體步驟包括以下3部分：

(一)標本檢測

1.選取228例包括侵襲邊緣和腫瘤中心的胃癌組織蠟塊，并確保無大片壞死；

2.獲取4μm的石蠟切片4片，在65℃烤片2小時，取出，略冷；

3.室溫下用二甲苯脫蠟2次，每次10分鐘；

4.在100％乙醇中洗去二甲苯，再依次經(jīng)過95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇，每次5分鐘；

5.雙蒸水中洗5分鐘；

6.用0.3％H₂O₂封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫10分鐘；

7.雙蒸水中洗4次，每次5分鐘；

8.抗原修復：不同抗原的修復條件如表2所示

表2不同抗體的來源和具體實驗條件

CB,檸檬酸緩沖液

9.室溫自然冷卻30分鐘；

10.PBS緩沖液中洗4次，每次3分鐘；

11.將第一抗體(詳見表2)分別滴加在4張組織切片上，4℃孵育12小時；

12.PBS緩沖液中洗4次，每次5分鐘；

13.滴加辣根過氧化物酶標記的第二抗體，37℃孵育30分鐘；包括兩種第二抗體，分別是山羊抗鼠/兔IgG的多克隆抗體(購自Dako公司，貨號K5007)。

14.PBS緩沖液中洗4次，每次3分鐘；

15.滴加DAB顯色劑，室溫，具體時間如表2所示；

16.雙蒸水中洗4次，每次5分鐘；

17.蘇木素復染，室溫2分鐘；

18.雙蒸水中洗4次，每次5分鐘；

19.PBS緩沖液中洗3分鐘；

20.自來水中洗3分鐘；

21.晾干，封片。

(二)圖像分析

1.在200倍視野下分別獲取侵襲邊緣和腫瘤中心的圖片各兩種，分辨率為2560×1920；

2.采用分析軟件識別陽性信號(棕色)，陰性細胞核(藍色)，空白區(qū)域(白色)；

3.手動畫出需要分析的區(qū)域(region of interest，ROI)；

4.分析分子指標：包括CD3_IM,CD3_CT,CD8_IM,CD45RO_CT和CD66b_IM；

5.分子指標陽性信號的計算方法：分子指標陽性信號的數(shù)值為200倍顯微鏡視野下的陽性細胞個數(shù)；

6.最終結(jié)果為多種照片的平均值。

(三)結(jié)果分析

1.將分子指標陽性信號與其閾值相比較，把分子指標的結(jié)果分為低表達和高表達兩種，分別用數(shù)字0和1表示；分子指標陽性信號大于等于其閾值，分子指標的結(jié)果為高表達，用數(shù)字1表示；分子指標陽性信號小于其閾值，分子指標的結(jié)果為低表達，用數(shù)字0表示。CD3_IM,CD3_CT,CD8_IM,CD45RO_CT和CD66b_IM陽性信號的閾值分別為118、61、86、76和59(200倍顯微鏡視野下的陽性細胞個數(shù))。分子指標的閾值為200倍顯微鏡視野下的陽性細胞個數(shù)的平均值，是通過對每個病人切片計數(shù)平均陽性細胞個數(shù)后，在訓練組用X-title軟件根據(jù)病人的DFS(無病生存率)生成的最佳cutoff值(閾值)。

2.計算患者免疫評分IS_GC＝(0.149×CD3_IM)+(0.021×CD3_CT)+(0.044×CD8_IM)+(0.096×CD45RO_CT)－(0.173×CD66b_IM)；其中IM代表侵襲邊緣，CT代表腫瘤中心。

3.判斷患者免疫評分IS_GC的高與低：當患者IS_GC<0時，認為患者屬于低IS_GC組；當患者IS_GC≥0時，認為患者屬于高IS_GC組。

結(jié)果表明：在該組患者中，預測患者1、3、5年無病生存的ROC曲線檢測AUC分別為(如圖2所示)。生存分析表明兩組患者的無病生存率和整體生存率均有顯著差異(P<0.001；如圖3所示)。多因素COX分析中，患者IS_GC可以作為獨立預測無病生存和整體生存的指標(P<0.001；如表1所示)。生存分析表明在II期和III期胃癌患者中，IS_GC高的患者接受化療能夠獲得顯著的生存獲益(P<0.05；如圖4所示)，而IS_GC低的患者接受化療并不能獲得生存獲益(如圖4所示)。所以IS_GC可以預測胃癌患者的化療敏感性，為臨床選擇治療方案提供幫助。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質(zhì)和范圍。