本發(fā)明涉及可用于診斷血管疾病的組合物，包括可測定血液中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的試劑；和包含所述試劑可用于診斷血管疾病的試劑盒。本發(fā)明還涉及提供可診斷血管疾病信息的方法，該方法包括測定從疑似具有血管疾病個(gè)體分離的血液樣本中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的步驟。本發(fā)明還涉及包含白細(xì)胞介素12受體β2活性抑制劑的可用于預(yù)防或治療血管疾病的組合物以及篩選血管疾病治療試劑的方法，該方法包括使用可用于血管疾病治療的測試試劑治療平滑肌細(xì)胞以及測定白細(xì)胞介素12受體β2表達(dá)水平的步驟。

背景技術(shù)：

動(dòng)脈粥樣硬化是冠狀動(dòng)脈疾病和腦血管病的主要原因，兩種疾病構(gòu)成西方國家所有死亡的約50％。動(dòng)脈粥樣硬化的早期病變包括內(nèi)皮下積累充滿脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞(泡沫細(xì)胞)，其被表示為“脂紋”病變。脂紋并不是臨床上有害的，但其是以富脂質(zhì)壞死碎屑和平滑肌細(xì)胞(SMC)積累為特征的進(jìn)一步纖維化和斑塊樣病變的前兆。

所述疾病發(fā)展過程中，動(dòng)脈壁逐漸增厚并變硬形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，導(dǎo)致動(dòng)脈腔狹窄。當(dāng)這種動(dòng)脈血管內(nèi)膜增厚使動(dòng)脈腔狹窄進(jìn)一步發(fā)展且斑塊變得易碎時(shí)，就出現(xiàn)不穩(wěn)定性心絞痛。隨后，其突然破裂并引起缺血癥狀或者血塊，以及通常心肌梗死或心臟病發(fā)作。但是，由動(dòng)脈粥樣硬化的數(shù)十年發(fā)展引起的內(nèi)膜增厚沒有標(biāo)志性的受試者癥狀，所以在缺血癥狀出現(xiàn)前很難容易地診斷內(nèi)膜增厚。

當(dāng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜增厚產(chǎn)生的狹窄病變時(shí)，通常通過血管成形術(shù)包括支架或者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)進(jìn)行血管干預(yù)以消除管腔變窄并擴(kuò)張血管。但是，這種血管成形術(shù)過程會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮剝蝕，以及隨后由血管平滑肌細(xì)胞增殖過度引起的血管內(nèi)膜增厚會(huì)導(dǎo)致再狹窄。因此，在相關(guān)領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)一種可快速且容易地非侵襲性診斷血管內(nèi)膜增厚的方法。

至今，在人源樣本及模式動(dòng)物中已進(jìn)行了許多嘗試以鑒定動(dòng)脈粥樣硬化的早期診斷生物標(biāo)志物。弗雷明漢心臟研究對3,209位受試者7年多跟蹤研究的臨床數(shù)據(jù)揭示了數(shù)種有價(jià)值的生物標(biāo)志物[C-反應(yīng)蛋白、B型利鈉肽(BNP)、腎素、尿白蛋白和高半胱氨酸]。血清蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)多年來也有利地進(jìn)行了對顯示出與疾病進(jìn)程相關(guān)的可用于循環(huán)生物標(biāo)志物的研究。然而，由于個(gè)體間的差異和很難觸及血管增厚的人體組織，尚沒有臨床應(yīng)用的生物標(biāo)志物特別是血漿來源的生物標(biāo)志物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

在此背景下，本發(fā)明人使用遺傳學(xué)同類大鼠的球囊損傷的頸動(dòng)脈血管調(diào)整了差異蛋白質(zhì)組學(xué)策略，并使用成人大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)通過體外驗(yàn)證過濾除去與平滑肌細(xì)胞增殖無關(guān)的蛋白質(zhì)。然后，他們通過體外和體內(nèi)驗(yàn)證鑒定候選蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)具有與新生內(nèi)膜SMC增殖相關(guān)的新功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿中存在的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白與斑塊不穩(wěn)定導(dǎo)致的臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度相關(guān)，并且血液中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白可用作血管疾病的生物標(biāo)志物，由此產(chǎn)生了本發(fā)明。

技術(shù)方案

本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供可用于診斷血管疾病的組合物，所述組合物包括可測定血液中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的試劑。

本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供可用于診斷血管疾病的試劑盒，所述試劑盒包括可用于診斷血管疾病的組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供可提供診斷血管疾病信息的方法，該方法包括測定從疑似具有血管疾病的個(gè)體分離的血液樣本中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的步驟。

本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供可用于預(yù)防或治療血管疾病的組合物，所述組合物包含白細(xì)胞介素12受體β2活性抑制劑。

本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供篩選血管疾病治療試劑的方法，該方法包括使用可用于血管疾病治療的測試試劑治療平滑肌細(xì)胞以及測定白細(xì)胞介素12受體β2表達(dá)水平的步驟。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明中，當(dāng)白細(xì)胞介素12受體β2用作血管疾病特別是心肌梗死或者不穩(wěn)定性心絞痛的生物標(biāo)志物時(shí)，以前僅能通過血管造影術(shù)診斷的血管疾病能夠使用血液通過快速非侵襲性經(jīng)濟(jì)方式診斷。因此，早期診斷血管疾病是可能的，由于該疾病以前是基于隨著疾病發(fā)展出現(xiàn)缺血癥狀后的受試者癥狀進(jìn)行診斷的。早期診斷、預(yù)防和治療的希望成為了現(xiàn)實(shí)。

附圖說明

圖1：是新生內(nèi)膜組織染色結(jié)果，示出了球囊損傷的頸動(dòng)脈中新生內(nèi)膜隨恢復(fù)時(shí)間增厚的動(dòng)力學(xué)；

圖2a：示出了蛋白質(zhì)組學(xué)測定的示例性過程，其中制備了頸動(dòng)脈球囊損傷模型，并從損傷的頸動(dòng)脈中提取蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行二維差異凝膠電泳(2D-DIGE)；

圖2b：是使用標(biāo)志物測定從頸動(dòng)脈球囊損傷模型的損傷的頸動(dòng)脈中獲取的亞細(xì)胞分級(jí)的結(jié)果；

圖2c：示出了損傷后恢復(fù)過程中獲取的頸動(dòng)脈提取溶液中鑒定蛋白的差異表達(dá)，使用其特異抗體通過Western印跡測定評價(jià)；

圖3a：示出了制成頸動(dòng)脈球囊損傷模型后從損傷的頸動(dòng)脈提取的細(xì)胞質(zhì)蛋白(S-100餾分)的二維差異凝膠電泳(2D-DIGE)的代表性熒光圖像；

圖3b：示出了通過制成頸動(dòng)脈球囊損傷模型后從損傷的頸動(dòng)脈提取的蛋白的二維差異凝膠電泳(2D-DIGE)，鑒定從蛋白質(zhì)組學(xué)測定獲取的蛋白點(diǎn)中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白的結(jié)果，其中圖像示出了通過熒光圖像測定而定量的損傷后恢復(fù)過程中增加的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白表達(dá)；

圖4：示出了IL-12Rβ2敲減對SMC細(xì)胞(成人平滑肌細(xì)胞和粘附到平滑肌細(xì)胞的單核細(xì)胞)三種活性的影響；

圖5：示出了在IL-12Rβ2siRNA遞送到球囊損傷的頸動(dòng)脈后IL-12Rβ2表達(dá)水平比較(圖5a)和H&E組織染色測定新生內(nèi)膜組織厚度的結(jié)果(圖5b)；

圖6a：示出了使用在U937細(xì)胞系中內(nèi)源表達(dá)的IL-12Rβ2蛋白測定本發(fā)明所用的抗-IL-12Rβ2抗體抗原特異性的免疫印跡結(jié)果；

圖6b：示出了使用Pierce白蛋白/IgG清除試劑盒從患者血漿樣本中清除高豐度血漿蛋白包括白蛋白和免疫球蛋白以增強(qiáng)對低豐度蛋白的檢測，其中濾液2是圖7中使用的樣本；

圖7：示出了使用IL-12Rβ2蛋白對從正常組和具有穩(wěn)定型心絞痛或急性心肌梗死患者獲取的血漿樣本的Western印跡測定結(jié)果(圖7a)和使用IL-12Rβ2蛋白對從正常組和具有穩(wěn)定型心絞痛或急性心肌梗死患者獲取的血漿樣本的Western印跡測定結(jié)果(圖7b)，且圖7c示出了使用IL-12Rβ2蛋白對從正常組和具有穩(wěn)定型心絞痛患者獲取的血漿樣本的Western印跡測定結(jié)果，其中通過Pon S染色確保等量的蛋白上樣，箭頭示出了IL-12Rβ2蛋白的位置；

圖8a：示出了圖7的IL-12Rβ2蛋白條帶的定量及統(tǒng)計(jì)分析圖，條帶示出了從正常組和具有穩(wěn)定型心絞痛患者(SA)、不穩(wěn)定型心絞痛患者(UA)或急性心肌梗死患者(AMI)獲取的血漿樣本中IL-12Rβ2蛋白表達(dá)水平；

圖8b：示出了病理性內(nèi)膜增厚人患者(n＝3)的頸動(dòng)脈中IL-12Rβ2的染色結(jié)果；

圖9a：示出了通過超速離心從急性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛患者獲取的血漿樣本分離的細(xì)胞外囊泡餾分中Western印跡測定IL-12Rβ2的結(jié)果，CD9和CD81作為外核體標(biāo)志物；

圖9b：示出了通過基于聚合物的沉淀從急性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛患者獲取的血漿樣本分離的細(xì)胞外囊泡餾分中的Western印跡測定IL-12Rβ2的結(jié)果，CD81作為外核體標(biāo)志物，PDGFRβ作為平滑肌標(biāo)志物；和

圖9c：示出了通過免疫沉淀從具有急性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛患者獲取的血漿樣本中的PDGFRβ得到的免疫沉淀物中IL-12Rβ2的Western印跡測定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，一方面，本發(fā)明提供了可用于診斷血管疾病的組合物，所述組合物包括可測定血液中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的試劑。

本文中，術(shù)語“血管疾病”是指包含血管組織損傷以及存在由此產(chǎn)生的新生內(nèi)膜增厚癥狀的疾病，但不限于此。對于本發(fā)明的血管疾病，新生內(nèi)膜增厚過程可引起狹窄及血管壁彈性下降，血管破裂導(dǎo)致出血。本發(fā)明中，血管疾病可以是內(nèi)膜增厚、不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死(例如急性心肌梗死)、動(dòng)脈粥樣硬化或支架內(nèi)再狹窄，但不限于此。

本發(fā)明中，證實(shí)了血液中白細(xì)胞介素12受體β2是可用于血管損傷和增厚的生物標(biāo)志物，其還可用于診斷具有心臟病發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)的疾病組例如不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死(急性心肌梗死)等。因此，可測定血液中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白的水平，也就是說，本發(fā)明的可用于預(yù)測或診斷血管疾病的組合物可用于實(shí)現(xiàn)早期診斷心臟病發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。

本文中，術(shù)語“白細(xì)胞介素12受體β2(IL-12Rβ2)”是指可結(jié)合到白細(xì)胞介素12配體的受體蛋白的β2亞基。已知的是，相應(yīng)的蛋白參與了JAK2/STAT4途徑，并且能夠促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖，特別是T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞。關(guān)于該基因或蛋白質(zhì)的信息可從已知數(shù)據(jù)庫中獲取，例如NCBI GenBank，但不限于此。本發(fā)明中，白細(xì)胞介素12受體β2蛋白可以是全長人白細(xì)胞介素12受體β2蛋白，并具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

本發(fā)明的可用于診斷血管疾病的組合物可包括白細(xì)胞介素12受體β2蛋白特異的抗體或適體。本發(fā)明中，白細(xì)胞介素12受體β2蛋白特異的抗體具體地可以是Santa Cruz Biotech.Clone E-20,目錄號(hào)#sc-18648和/或Atlas抗體，產(chǎn)品號(hào)#HPA024168。

本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將Santa Cruz Biotech.Clone E-20,目錄號(hào)#sc-18648和/或Atlas抗體，產(chǎn)品號(hào)#HPA024168用作白細(xì)胞介素12受體β2蛋白特異的抗體，以此測定白細(xì)胞介素12受體β2蛋白的水平。

另一方面，本發(fā)明的可診斷血管疾病的組合物可用于測定血液白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平，其來自平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞。

白細(xì)胞介素12受體β2蛋白對應(yīng)于可結(jié)合到白細(xì)胞介素12配體的受體蛋白的亞基。具體地，白細(xì)胞介素12受體β2蛋白是跨膜蛋白，其通常存在于細(xì)胞膜中，并且尚無關(guān)于相應(yīng)的蛋白存在于血液中的報(bào)道。本發(fā)明人首次證明了可檢測血液中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白，并且白細(xì)胞介素12受體β2蛋白顯示出與血液疾病例如不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死等相關(guān)。

本發(fā)明中，血液中發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白可能來自因血管增厚而受損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞(SMC)。也就是說，白細(xì)胞介素12受體β2蛋白在因血管增厚而受損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中過表達(dá)，并且膜蛋白，白細(xì)胞介素12受體β2蛋白可存在于來自受損傷組織的細(xì)胞外囊泡(外核體等)中。細(xì)胞外囊泡可存在于血液中，因此血液的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平可測定。

本發(fā)明可用于診斷血管疾病的組合物包括測定白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的試劑，與正常對照組的血液樣本相比，白細(xì)胞介素12受體β2蛋白在具有血管疾病例如心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛個(gè)體的血液樣本中顯示出不同水平，因此該組合物可用于診斷個(gè)體的血管疾病。也就是說，當(dāng)使用本發(fā)明的組合物測定的個(gè)體血液中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白的水平高于正常對照組血液中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白的水平時(shí)，相應(yīng)的個(gè)體可被診斷為具有血液疾病。

本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，測定了正常對照組、內(nèi)膜增厚或心臟病發(fā)作低風(fēng)險(xiǎn)的穩(wěn)定型心絞痛患者組、不穩(wěn)定型心絞痛患者組和心肌梗死患者組的血液樣本中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平。結(jié)果，與正常組樣本相比，在患者組樣本中檢測到顯著高的IL-12Rβ2蛋白水平(圖7和8a)。

本發(fā)明中，可用于測定來自平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的組合物可包括i)白細(xì)胞介素12受體β2蛋白特異的抗體或適體，用作測定白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的試劑；和ii)可特異性結(jié)合到平滑肌標(biāo)志物或血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的抗體或適體。除i)和ii)之外，本發(fā)明的組合物還可包括iii)可特異性結(jié)合到細(xì)胞外囊泡標(biāo)志物的抗體或適體。

具體地，平滑肌標(biāo)志物或血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物可以是血小板源生長因子受體(PDGFR)，但不限于此。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為測定來自平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞的血液白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平，首先使用可特異性結(jié)合到相應(yīng)標(biāo)志物的抗體或適體從血液中分離了含平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物或血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞外囊泡，然后可以測定細(xì)胞外囊泡中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平。

本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用可特異性結(jié)合到平滑肌標(biāo)志物PDGFR的抗體(Santa Cruz Biotech.clone P-20.目錄號(hào)#sc-339)分離外核體，然后測定所分離的外核體中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平(圖9c)。

本發(fā)明中，測定血液白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平是測定血液中存在的細(xì)胞外囊泡中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平，所述細(xì)胞外囊泡具體地可以是外核體，但不限于此。

為此目的，本發(fā)明的組合物可包括細(xì)胞外囊泡標(biāo)志物(特別是外核體標(biāo)志物)特異的抗體或適體，并且外核體標(biāo)志物可以是CD81、CD9或CD63。外核體標(biāo)志物特異的抗體可以是可特異性結(jié)合到CD63的抗體(System Biosciences Inc.目錄號(hào)#EXOAB-CD63A-1)、可特異性結(jié)合到CD9的抗體(System Biosciences Inc.目錄號(hào)#EXOAB-CD9A-1)和/或可特異性結(jié)合到CD81的抗體(System Biosciences Inc.目錄號(hào)#EXOAB-CD81A-1)。對于本發(fā)明的目的，其中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平得以測定的細(xì)胞外囊泡、外核體等可來自血管，特別是損傷的內(nèi)皮。本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將可特異性結(jié)合到CD63的抗體(System Biosciences Inc.目錄號(hào)#EXOAB-CD63A-1)、可特異性結(jié)合到CD9的抗體(System Biosciences Inc.目錄號(hào)#EXOAB-CD9A-1)和/或可特異性結(jié)合到CD81的抗體(System Biosciences Inc.目錄號(hào)#EXOAB-CD81A-1)用作外核體標(biāo)志物特異的抗體。

本文中，術(shù)語“標(biāo)志物”是指能夠通過將具有血管疾病(特別是心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛)的個(gè)體與正常個(gè)體或具有心臟病發(fā)作低風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體區(qū)別開來診斷血管疾病的物質(zhì)，并且本發(fā)明中的標(biāo)志物可包括所有的有機(jī)生物分子例如多肽、蛋白質(zhì)或者核酸、脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白、糖等，其數(shù)量在具有血管疾病的個(gè)體中增加或減少。本發(fā)明中，標(biāo)志物具體地可以是在具有本發(fā)明的血管疾病的個(gè)體中增加的蛋白質(zhì)，但不限于此。

本文中，“測定蛋白水平”是為診斷本發(fā)明的血管疾病而評價(jià)生物樣本(例如全血、血漿、血清、其餾分等)中標(biāo)志物蛋白的存在及表達(dá)水平。具體地，可特異性結(jié)合到所述蛋白的抗體或適體可被用于檢測所述蛋白的量。生物樣本可以是從個(gè)體中分離的生物樣本。

因此，測定方法可包括但不限于Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、放射免疫擴(kuò)散、ouchterlony免疫擴(kuò)散、火箭免疫電泳、免疫組織化學(xué)染色、免疫沉淀測定、補(bǔ)體結(jié)合測定、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、適體芯片、微陣列、蛋白質(zhì)芯片等。使用所述測定方法，可將疑似具有血管疾病患者體內(nèi)形成的抗原-抗體復(fù)合物的量與正常對照組體內(nèi)形成的抗原-抗體復(fù)合物的量比較，以此診斷疑似具有血管疾病患者是否事實(shí)上存在血管疾病。

本文中，術(shù)語“抗體”是指表明抗原區(qū)的具體蛋白分子。對于本發(fā)明的目的，抗體可以是可特異性結(jié)合到標(biāo)志物蛋白的抗體，可包括所有多克隆抗體、單克隆抗體、重組抗體及其抗原結(jié)合片段，只要其保留了抗原結(jié)合功能即可。此外，本發(fā)明的抗體可包括專門的抗體例如人化抗體等。

可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)容易地進(jìn)行白細(xì)胞介素12受體β2蛋白特異的抗體的制備，白細(xì)胞介素12受體β2蛋白是用于本發(fā)明的血管疾病特別是心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛的標(biāo)志物蛋白。多克隆抗體可通過本領(lǐng)域公知的方法制備，其包括將白細(xì)胞介素12受體β2蛋白抗原(全長或片段)注入動(dòng)物體內(nèi)并從動(dòng)物收集血液樣本以獲取含抗體的血清。所述多克隆抗體可從一些動(dòng)物宿主例如山羊、兔、綿羊、猴、馬、豬、牛和狗制備。單克隆抗體可通過本領(lǐng)域公知的方法制備，例如雜交瘤法(見雜交瘤法)(Kohler and Milstein(1976)European Journal of Immunology 6:511-519)或噬菌體抗體庫技術(shù)(Clackson et al,Nature,352:624-628,1991；Marks et al,J.Mol.Biol.,222:58,1-597,1991)。上述方法制備的抗體可通過凝膠電泳、透析、鹽析、離子交換層析、親和層析等分離及純化。

此外，本發(fā)明的抗體不僅包括具有兩條全長輕鏈和兩條全長重鏈的完整形式，也可包括抗體分子的功能片段。抗體分子的功能片段是指至少保留抗原結(jié)合功能的片段，且包含F(xiàn)ab、F(ab')、F(ab”)₂、Fv等的片段。

本文中，術(shù)語“適體”是指約20～60核苷酸的單鏈寡核苷酸和對具體靶分子具有結(jié)合活性的核酸分子。適體依據(jù)其序列及對具體物質(zhì)的高親和力(類似抗原-抗體反應(yīng))而具有不同的三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過結(jié)合到具體的靶分子，適體可檢測靶分子或者抑制其活性。本發(fā)明的適體可以是RNA、DNA、修飾的核酸或其混合物，并且其可以是直鏈或有角形狀。優(yōu)選地，適體可結(jié)合到白細(xì)胞介素12受體β2以檢測白細(xì)胞介素12受體β2或抑制其活性。適體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過公知的方法依據(jù)白細(xì)胞介素12受體β2的序列制備。

而且，本文中術(shù)語“抗原-抗體(或適體)復(fù)合物”是指白細(xì)胞介素12受體β2蛋白及其特異性抗體或適體的結(jié)合產(chǎn)物。所形成的抗原-抗體復(fù)合物的量可通過測定檢測標(biāo)記物的信號(hào)大小來定量地確定。

所述檢測標(biāo)記物可選自包含酶、熒光物質(zhì)、配體、發(fā)光物質(zhì)、微粒、氧化還原分子和放射性同位素的組，但不限于此。可獲取用作檢測標(biāo)記物的酶的實(shí)例包括但不限于β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化物酶或堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶、RN酶、葡糖氧化酶和熒光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脫羧酶、β-內(nèi)酰胺酶等。熒光物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于FITC、RITC、熒光素、異硫氰酸鹽、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二甲醛、熒光胺等。配體的實(shí)例包括但不限于生物素衍生物等。發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于吖啶酯、熒光素、熒光素酶等。微粒的實(shí)例包括但不限于膠體金、有色乳膠等。氧化還原分子的實(shí)例包括但不限于二茂鐵、釕絡(luò)合物、紫精、醌、鈦離子、銫離子、二酰亞胺、1,4-苯醌、氫醌、K₄W(CN)₈、[Os(bpy)₃]²⁺、[RU(bpy)₃]²⁺和[MO(CN)₈]^4-等。放射性同位素的實(shí)例包括但不限于³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸⁶Re等。

優(yōu)選地，通過ELISA測定蛋白表達(dá)水平。ELISA包括多種ELISA方法，包括使用可識(shí)別固定在固相支持物上的抗原的標(biāo)記抗體或適體的直接ELISA、使用可識(shí)別可與固定在固相支持物上的抗原形成復(fù)合物的捕獲抗體或配體的標(biāo)記抗體的間接ELISA、使用可識(shí)別固定在固相支持物上抗原或適體-抗體復(fù)合物中抗原的另外的標(biāo)記抗體的直接夾心ELISA、和間接夾心ELISA，其中可識(shí)別固定在固相支持物上抗原-抗體或適體復(fù)合物中抗原的另外的標(biāo)記抗體發(fā)生反應(yīng)，然后使用可識(shí)別另外標(biāo)記抗體的標(biāo)記第二抗體。

本文中，術(shù)語“診斷”是指評價(jià)病理狀態(tài)是否存在及其性質(zhì)。對于本發(fā)明的目的，診斷是用于確定血管疾病特別是心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)生、疾病的進(jìn)展和由其引起心臟病發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)。

另一方面，本發(fā)明提供了可用于診斷血管疾病的試劑盒，所述試劑盒包括可用于診斷本發(fā)明的血管疾病的組合物。

本發(fā)明的試劑盒可用于確定作為血管疾病特別是心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛標(biāo)志物的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平，以此檢測該標(biāo)志物。本發(fā)明可用于檢測所述標(biāo)志物的試劑盒的可選組包含微陣列、適體芯片試劑盒、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)試劑盒、印跡試劑盒、免疫沉淀試劑盒、免疫熒光測定試劑盒及其組合，其能夠檢測白細(xì)胞介素12受體β2蛋白。

本發(fā)明可用于檢測標(biāo)志物的試劑盒可包含用于檢測白細(xì)胞介素12受體β2蛋白并確定白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的適體或抗體，。

另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于檢測白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的試劑盒可包括用于免疫檢測適體或抗體的底物、適合的緩沖液、用檢測標(biāo)記物標(biāo)記的抗體或適體和/或顯色底物。硝酸纖維素膜、聚乙烯樹脂制成的96-孔板、聚苯乙烯樹脂制成的96-孔板以及載玻片可用作底物。檢測標(biāo)記物如上所述。作為用于顯色的底物試劑，依據(jù)所用的檢測標(biāo)記物可使用本領(lǐng)域技術(shù)任意熟知的任意底物例如ABTS(2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))、OPD(鄰苯二胺)、或TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。

另一方面，本發(fā)明提供了可提供診斷血管疾病的信息的方法，該方法包括測定從疑似具有血管疾病的個(gè)體分離的血液樣本中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平的步驟。

具體地，本發(fā)明提供了可提供診斷血管疾病信息的方法，該方法包括如下步驟：(a)測定從疑似具有血管疾病的個(gè)體分離的血液樣本中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平；和(b)將步驟(a)中測定的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平和正常對照組樣本中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平比較。

本發(fā)明中，血管疾病、診斷、白細(xì)胞介素12受體β2等如上所述。

本發(fā)明中，血液樣本是指收集用于診斷疑似具有血管疾病的個(gè)體中血管疾病的血液樣本(例如全血、血漿、血清、其餾分等)，具體地可以是血漿樣本或細(xì)胞外囊泡餾分，但不限于此。本發(fā)明中，細(xì)胞外囊泡可以是外核體。

本發(fā)明可用于診斷血管疾病的方法特征在于當(dāng)從疑似具有血管疾病個(gè)體分離的血液樣本中測定的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平高于正常對照組樣本中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平時(shí)，所述個(gè)體可診斷為具有血管疾病。

本發(fā)明可提供用于診斷血管疾病信息的方法中，測定從疑似具有血管疾病的個(gè)體分離的血液樣本中白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平可以是測定血液樣本中的來自血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平，并且該測定可通過從血液樣本中的血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中分離或提取細(xì)胞外囊泡(即外核體)然后測定其中存在的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為測定血液中平滑肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平，首先使用可特異性結(jié)合到相應(yīng)標(biāo)志物的抗體或適體從血液中分離了含平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物或血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞外囊泡，然后測定相應(yīng)細(xì)胞外囊泡中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平。

本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用可特異地結(jié)合到平滑肌標(biāo)志物PDGFRβ的抗體，并測定了使用該抗體分離的外核體中的白細(xì)胞介素12受體β2蛋白水平(圖9c)。

另一方面，本發(fā)明提供了可用于預(yù)防或治療血管疾病的組合物，所述組合物包括白細(xì)胞介素12受體β2活性抑制劑。

本發(fā)明中，血管疾病、白細(xì)胞介素12受體β2等如上所述。

本文中，術(shù)語“白細(xì)胞介素12受體β2活性抑制劑”是指能夠減低白細(xì)胞介素12受體β2的表達(dá)或者活性的任意試劑，具體的其可包括能夠通過減低白細(xì)胞介素12受體β2轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)或者阻斷其活性來減低白細(xì)胞介素12受體β2的表達(dá)水平或者活性的所有試劑。

白細(xì)胞介素12受體β2活性抑制劑可以是靶向白細(xì)胞介素12受體β2以抑制白細(xì)胞介素12受體β2的表達(dá)或活性的化合物、核酸、含核酸的病毒或載體，但形式不限。優(yōu)選地，白細(xì)胞介素12受體β2活性抑制劑可以是但不限于可抑制白細(xì)胞介素12受體β2mRNA表達(dá)的寡核苷酸、可抑制白細(xì)胞介素12受體β2蛋白活性的抗體或其抗原結(jié)合片段。具體地，可抑制白細(xì)胞介素12受體β2mRNA表達(dá)的寡核苷酸可以是反義寡核苷酸、白細(xì)胞介素12受體β2特異的適體或者siRNA。也就是說，本發(fā)明的白細(xì)胞介素12受體β2活性抑制劑的可選自組包含抗-白細(xì)胞介素12受體β2蛋白抗體以及白細(xì)胞介素12受體β2基因特異的反義寡核苷酸、siRNA、shRNA和microRNA。白細(xì)胞介素12受體β2基因特異的siRNA可通過本領(lǐng)域公知的方法參考白細(xì)胞介素12受體β2的堿基序列制備。

本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，4種類型白細(xì)胞介素12受體β2基因特異的siRNA被處理用于頸動(dòng)脈球囊損傷模型，得到新生內(nèi)膜增厚顯著下降。

本文中，術(shù)語“反義寡核苷酸”是指含有與具體mRNA序列互補(bǔ)的核酸序列的DNA、RNA或其衍生物，并且反義寡核苷酸的功能是通過結(jié)合到mRNA中的互補(bǔ)序列抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。反義寡核苷酸序列是指互補(bǔ)并結(jié)合到白細(xì)胞介素12受體β2mRNA且能夠抑制翻譯、易位到細(xì)胞質(zhì)、成熟或全部生物學(xué)功能的其他重要活性的DNA或RNA序列。反義寡核苷酸可以是6到100個(gè)堿基長度，優(yōu)選8到60個(gè)堿基長度，更優(yōu)選10到40個(gè)堿基長度。反義寡核苷酸可以是體外合成并應(yīng)用到抗體中或者是體內(nèi)合成的。體外合成反義寡核苷酸的一個(gè)實(shí)例是使用RNA聚合酶I。體內(nèi)合成反義RNA的一個(gè)實(shí)例是使用具有相反方向多克隆位點(diǎn)(MCS)起始點(diǎn)的載體，以使得反義RNA可被轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，反義RNA序列中可具有翻譯終止密碼子，以阻止翻譯成肽序列。

本發(fā)明所用反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)可依據(jù)本領(lǐng)域公知方法參考白細(xì)胞介素12受體β2的堿基序列容易地實(shí)施。

本文中，術(shù)語“siRNA”是指能夠介導(dǎo)RNA干擾或基因沉默的核苷酸分子。由于siRNA能夠抑制靶基因的表達(dá)，其提供了基因敲減或遺傳治療的有效途徑。siRNA是21～25個(gè)核苷酸的小RNA片段，其是使用dicer切割雙鏈RNA產(chǎn)生的?？商禺惤Y(jié)合到mRNA的siRNA具有mRNA的互補(bǔ)序列以抑制其表達(dá)。對于本發(fā)明的目的，siRNA可特異地作用于白細(xì)胞介素12受體β2以切割白細(xì)胞介素12受體β2分子，誘導(dǎo)RNA干擾(RNAi)。結(jié)果，白細(xì)胞介素12受體β2可被抑制。siRNA可通過化學(xué)方式或者酶法方式合成。siRNA的制備方法不具體限定，可使用本領(lǐng)域任意已知的方法。例如，所述方法可包括直接化學(xué)合成siRNA、體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA、酶切割體外轉(zhuǎn)錄合成的長雙鏈RNA、將可表達(dá)shRNA的質(zhì)粒或病毒載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞來表達(dá)以及將PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))-產(chǎn)生的siRNA表達(dá)盒轉(zhuǎn)移到細(xì)胞來表達(dá)，但不限于此。

本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用可特異地抑制人白細(xì)胞介素12受體β2的目錄號(hào)#M_007932-00制品和可特異地抑制大鼠白細(xì)胞介素12受體β2目錄號(hào)#M_095069-01制品(由GE Dharmacon制造)測定效果。

本文中，術(shù)語“治療”是指意圖改變受治療個(gè)體或細(xì)胞自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，并且可實(shí)施用于預(yù)防或者在臨床病理學(xué)過程中實(shí)施。希望的治療效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或再發(fā)生、緩解癥狀、和減輕疾病的任意直接或間接病理學(xué)后果、防止轉(zhuǎn)移、減低疾病惡化速率、改善或緩和疾病狀態(tài)以及減輕或改善預(yù)后。本發(fā)明中，治療優(yōu)選地意指其中血管疾病特別是血管增厚、心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛的癥狀已通過給藥包含白細(xì)胞介素12受體β2抑制劑的組合物有利地緩和的所有作用。此外，“預(yù)防”意指其中血管疾病特別是血管增厚、心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)生通過給藥本發(fā)明包含白細(xì)胞介素12受體β2抑制劑的組合物而受到限制或阻礙的所有作用。

本發(fā)明的藥物組合物還可包括通?？捎糜谥苽渌幬锝M合物的適合的載體、輔藥或稀釋劑。包含藥學(xué)上可接受載體的組合物具有可用于口服或腸胃外給藥的多種劑型。組合物的劑型可包括使用一般稀釋劑或輔藥例如填充劑、膨脹劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑等。用于口服給藥的固態(tài)劑型可包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊等。固態(tài)劑型可通過將一種或多種化合物與至少一種輔藥例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等制備。除所述簡單輔藥外，還可使用潤滑劑例如硬脂酸鎂或者滑石。用于口服給藥的液態(tài)劑型可包括懸液、內(nèi)用溶液、乳劑、糖漿劑等。除一般稀釋劑例如水合液體石蠟以外，還可使用其他輔藥例如潤濕劑、調(diào)味劑、芳香劑、防腐劑等。用于腸胃外給藥的劑型可包括無菌水性溶液、非水性溶劑、懸液、乳劑、凍干制劑或栓劑。非水性溶液和懸液可包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、可注射酯例如油酸乙酯等。栓劑的基質(zhì)可包括witepsol、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明膠等。

此外，本發(fā)明的藥物組合物可具有但不限于選自包括片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、懸液、內(nèi)用溶液、乳劑、糖漿劑、無菌水性溶液、非水性溶劑、懸液、乳劑、凍干制劑和栓劑的組中的任意劑型。

另一方面，本發(fā)明提供了治療血管疾病的方法，該方法向個(gè)體給藥含白細(xì)胞介素12受體β2抑制劑作為有效成分的藥物組合物的步驟。

本文中，術(shù)語“個(gè)體”是指可能具有血管疾病特別是血管增厚、心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛或者已經(jīng)具有所述疾病的所有動(dòng)物包括人。血管疾病特別是血管增厚、心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛可通過向個(gè)體給藥本發(fā)明的藥物組合物得到緩解或治療。緩解意指通過給藥本發(fā)明的組合物使血管疾病特別是血管增厚、心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛好轉(zhuǎn)或有利地改善的所有作用。

本發(fā)明的藥物組合物可給藥藥學(xué)有效量。

本文中，術(shù)語“給藥”是指通過適合的途徑將本發(fā)明的藥物組合物導(dǎo)入受試者。只要能夠使本發(fā)明的組合物到達(dá)靶組織，任意口服或腸胃外途徑都可使用。

根據(jù)目的或需要，可依據(jù)本領(lǐng)域通常使用的方法、給藥途徑、給予劑量適當(dāng)?shù)亟o藥所述藥物組合物。給藥途徑例如經(jīng)口服、腸胃外、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、局部、鼻內(nèi)給藥。腸胃外給藥可包括局部(通過使用支架)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥。此外，適合的給藥劑量和給藥頻率可依據(jù)本領(lǐng)域公知的方法選擇，并且事實(shí)上本發(fā)明藥物組合物的給藥劑量和給藥頻率可通過多種因素例如被治療癥狀的種類、給藥途徑、性別、健康狀況、飲食、個(gè)體年齡和體重以及病重程度適當(dāng)?shù)卮_定。

本文中，術(shù)語“藥學(xué)有效量”是指以合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比應(yīng)用到任意醫(yī)學(xué)用途時(shí)，足以抑制或緩解血管通透性增加的量。有效劑量水平的確定可依據(jù)個(gè)體種類、嚴(yán)重程度、年齡、性別、藥物活性、對藥物的敏感度、給藥時(shí)間、給藥途徑和排泄率、治療持續(xù)時(shí)間、同時(shí)使用的藥物以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的其他因素。本發(fā)明的組合物可單獨(dú)給藥或者與其他治療試劑組合給藥，并且可與傳統(tǒng)治療試劑先后給藥或同時(shí)給藥。所述組合物可以單劑或多劑形式給藥。依據(jù)上述因素，將所述組合物以能夠顯示出最大效應(yīng)而不引起副作用的最小量給藥是重要的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定。

另一方面，本發(fā)明提供了篩選可用于血管疾病治療試劑的方法，該方法包括使用血管疾病治療的測試試劑治療白細(xì)胞介素12受體β2-表達(dá)的平滑肌細(xì)胞并測定白細(xì)胞介素12受體β2表達(dá)水平的步驟。

詳細(xì)來說，依據(jù)本發(fā)明的篩選方法，當(dāng)通過可用于血管疾病治療的測試試劑治療后白細(xì)胞介素12受體β2表達(dá)水平下降時(shí)，可確定該測試試劑為血管疾病的治療試劑。

“測試試劑”包括任意物質(zhì)、分子、元素、化合物、實(shí)體或其組合。測試試劑包括但不限于例如蛋白質(zhì)、多肽、小有機(jī)分子、多糖、多核苷酸等。其可以是天然產(chǎn)物、合成的化合物、或化學(xué)化合物、或者兩種或更多種物質(zhì)的組合。除非另有說明，否則術(shù)語“試劑”、“物質(zhì)”及“化合物”可互換使用。

可通過本發(fā)明的方法篩選或鑒定的試劑包括多肽、β-轉(zhuǎn)角模擬物、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香族化合物、雜環(huán)化合物、苯二氮卓、低聚N-取代甘氨酸、低聚氨甲酸酯、糖類、脂肪酸、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。測試試劑可從多種來源包括合成的文庫或天然產(chǎn)物獲得。

實(shí)施例

下文中，將參考實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。但是，實(shí)施例僅用于說明目的，本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1：大鼠頸動(dòng)脈球囊誘導(dǎo)損傷模型的制備

本發(fā)明中，動(dòng)物研究的實(shí)施服從Ewha女子大學(xué)的機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理及使用委員會(huì)(IACUC)指南并符合美國國立衛(wèi)生研究院出版的“Guide for Care and Use of Laboratory Animals”(國家科學(xué)院出版社，第8版，2011)。

本發(fā)明中，10周齡雄性Sprague-Dawley大鼠用于大鼠頸動(dòng)脈球囊誘導(dǎo)損傷模型，并且大鼠頸動(dòng)脈球囊誘導(dǎo)損傷模型的制備如前文所述(DH Kang,et al.,Circulation 2013；128:pp 834-844)。首先，通過吸入異氟醚氣體(N₂O:O₂/70％:30％)麻醉大鼠。

為蛋白質(zhì)組學(xué)測定，手術(shù)后使大鼠在籠中恢復(fù)不同時(shí)間(18小時(shí)、3天、5天和7天)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組使用8只大鼠，假手術(shù)用作零時(shí)間對照。

為組織學(xué)和免疫學(xué)測定，使大鼠恢復(fù)10天。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的大小見附圖說明所示。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都是重復(fù)3次。

實(shí)施例2：導(dǎo)管介導(dǎo)的壁內(nèi)遞送siRNA進(jìn)入頸動(dòng)脈

為檢測將siRNA遞送到實(shí)施例1制備的頸動(dòng)脈損傷動(dòng)物模型的損傷頸動(dòng)脈產(chǎn)生的分子生物學(xué)變化，進(jìn)行了導(dǎo)管介導(dǎo)的壁內(nèi)遞送siRNA。

詳細(xì)來說，依據(jù)制造商的使用說明(Ambion)，將大鼠特異的siRNA SMART庫(GE Healthcare Dharmacon,目錄號(hào)#M_095069-01,200nM)與siPORTTM NeoFXTM試劑預(yù)混合。球囊損傷后，立即用Opti-MEM洗滌頸總動(dòng)脈，并通過導(dǎo)管給藥轉(zhuǎn)染預(yù)混物(200μl)。將血管孵育15分鐘以有效轉(zhuǎn)染，然后結(jié)扎。將熒光染料共軛的對照siRNA命名為siGLO-Red(Dharmacon)用于證實(shí)siRNA的壁內(nèi)轉(zhuǎn)染。

實(shí)施例3：組織學(xué)測定

對于組織學(xué)測定，如實(shí)施例1所述通過吸入異氟醚氣體(N₂O:O₂/70％:30％)麻醉大鼠，使用含3.7％甲醛的肝素化生理鹽水穿心灌注固定后切斷頸總動(dòng)脈。用石蠟包埋切斷的頸動(dòng)脈，并通過旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(萊卡RM2255)切片。從頸總動(dòng)脈的中間位置取兩片連續(xù)的組織切片(4μm厚度)并用蘇木精和曙紅(H&E)染色。使用NIH Image v1.62測定管腔、內(nèi)彈性膜和外彈性膜的面積。內(nèi)膜和中膜的面積通過內(nèi)彈性膜面積減去管腔面積和外彈性膜面積來計(jì)算。將每只大鼠的兩片連續(xù)切片的平均值用于分析。

實(shí)施例4：測定人血液樣本

本發(fā)明所用的血液樣本取自正常健康者對照和經(jīng)血管造影確定具有冠狀動(dòng)脈疾病的患者，經(jīng)Ewha女子大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(韓國，首爾)核準(zhǔn)。

具有冠狀動(dòng)脈疾病的患者當(dāng)中，依據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)將具有缺血癥狀的患者分為穩(wěn)定性心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死。所有志愿者簽署知情同意書后參與該研究。

將收集的全血樣本離心，并使用Pierce白蛋白/IgG移除依據(jù)制造商的操作手冊進(jìn)一步純化血漿樣本。

實(shí)施例5：統(tǒng)計(jì)分析

使用進(jìn)行雙因素比較的Student's t-test或者使用具有Tukey's“誠實(shí)顯著差異”事后檢驗(yàn)的one-way ANOVA進(jìn)行多因素分析(SPSS 12.0K for Windows,SPSS,Chicago,IL,USA)來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P值)。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。使用兩個(gè)非參數(shù)檢驗(yàn)：Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)來分析血液樣本數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1：通過物理損傷測定大鼠頸動(dòng)脈蛋白質(zhì)組變化

球囊誘導(dǎo)的大鼠頸動(dòng)脈損傷參與內(nèi)皮剝蝕后血栓誘導(dǎo)激活的SMC(平滑肌細(xì)胞)增生，其誘導(dǎo)典型內(nèi)皮增厚，因而類似于使用球囊栓子切除術(shù)對動(dòng)脈血管的物理損傷。該體內(nèi)模型滿足與SMC增生有關(guān)的組織學(xué)和生物化學(xué)研究。

首次檢測了球囊損傷的頸動(dòng)脈中新生內(nèi)膜增生的動(dòng)力學(xué)。如前所述，球囊損傷可誘導(dǎo)傷口管腔側(cè)中的新生內(nèi)膜增厚的逐漸增加(圖1)。基于該動(dòng)力學(xué)，選擇5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(假處理對照及損傷后18小時(shí)、3天、5天和7天)通過二維差異凝膠電泳(2D-DIGE)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)測定(圖2a)。

為獲取足量用于DIGE測定的蛋白質(zhì)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集總共8段損傷的頸動(dòng)脈片段用于蛋白質(zhì)提取，并進(jìn)行亞細(xì)胞分級(jí)分離(圖2b)。使用Cy3/Cy5熒光進(jìn)行蛋白組分染色，然后通過二維差異凝膠電泳測定超過2,100個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)。將每個(gè)損傷樣本與內(nèi)標(biāo)(Cy2-標(biāo)記的)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)繪圖，發(fā)現(xiàn)約140個(gè)蛋白點(diǎn)顯示出時(shí)間依賴方式的表達(dá)變化。在140個(gè)蛋白當(dāng)中，通過質(zhì)譜成功鑒定了44個(gè)蛋白。使用特異抗體((IL-12Rβ2-特異抗體；Santa Cruz Biotech.Clone E-20,目錄號(hào)#sc-18648/Atlas抗體，產(chǎn)品號(hào)#HPA024168))通過免疫印跡法證實(shí)了所鑒定蛋白的差異表達(dá)，從而證明了蛋白質(zhì)組學(xué)測定是定量且準(zhǔn)確的(圖2c)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2：體外和體內(nèi)測定驗(yàn)證白細(xì)胞介素12受體β2功能

集中于實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中鑒定的44個(gè)蛋白之中白細(xì)胞介素12受體β2的變化，在人大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)中驗(yàn)證了其細(xì)胞功能。

詳細(xì)來說，通過4種IL-12Rβ2-特異的小干擾RNA(siRNA)(GE Healthcare Dharmacon,目錄號(hào)#M_007932-00)的混合物處理，人大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中IL-12Rβ2(白細(xì)胞介素12受體β2)的表達(dá)被敲減。由于血小板衍生生長因子(PDGF)和TNF-α是球囊損傷的傷口中血小板/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的主要因子，所以大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和趨化性移行由PDGF-BB誘導(dǎo)，而粘附到平滑肌細(xì)胞的單核細(xì)胞由腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)。

結(jié)果，白細(xì)胞介素12受體β2的敲減顯著降低了3種類型細(xì)胞的活性(圖4)。

此外，如實(shí)施例2所述進(jìn)行將大鼠特異的IL-12Rβ2(白細(xì)胞介素12受體β2)siRNA導(dǎo)管介導(dǎo)地轉(zhuǎn)染至球囊損傷的頸動(dòng)脈時(shí)，成功地實(shí)現(xiàn)了IL-12Rβ2敲減(圖5a)，并且與對照siRNA相比新生內(nèi)膜增厚顯著減少(圖5b)，表明IL-12Rβ2在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)并且參與了血管平滑肌細(xì)胞增生。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3：IL-12Rβ2作為血管增厚可能的生物標(biāo)志物

由于快速生長或損傷的細(xì)胞以外核體形式釋放細(xì)胞蛋白或microRNA，本發(fā)明人預(yù)計(jì)IL-12Rβ2蛋白高表達(dá)可能出現(xiàn)在具有冠狀動(dòng)脈疾病患者特別是具有不穩(wěn)定型癥狀例如急性心肌梗死或不穩(wěn)定型心絞痛患者的血液中。

為此，使用了可特異性識(shí)別所述細(xì)胞系中內(nèi)源表達(dá)的IL-12Rβ2蛋白的抗體(Santa Cruz Biotech.Clone E-20,目錄號(hào)#sc-18648；Atlas抗體.產(chǎn)品號(hào)#HPA024168)(圖6a)。為增強(qiáng)低豐度蛋白的檢測，從患者的血漿樣本中去除了大量的血漿蛋白包括白蛋白和免疫球蛋白(圖6b)。

對從經(jīng)歷了冠狀血管造影術(shù)的具有心絞痛癥狀的患者獲取的血漿樣本進(jìn)行了Western印跡測定，并與正常樣本比較。結(jié)果，與正常樣本相比，在患者樣本中檢測到顯著高表達(dá)水平的IL-12Rβ2蛋白(圖7)。

如圖8a所示，定量及統(tǒng)計(jì)分析表明,血漿中IL12-Rβ2的水平與人患者的疾病嚴(yán)重程度強(qiáng)相關(guān)(4因素之間P＝3.448×10^-6)。

為證明血漿IL-12β2與血管狹窄化相關(guān)，通過組織染色檢測了具有病理性內(nèi)膜增厚的人患者(n＝3)頸動(dòng)脈血管中IL-12Rβ2的表達(dá)。結(jié)果，與正常動(dòng)脈血管壁相比，增厚內(nèi)膜傷口中的IL-12βR2表達(dá)顯著更高(圖8b)。

由于檢測到血漿中IL-12Rβ2的分子大小符合全長形式，推測IL-12Rβ2能夠以外核體形式釋放而不被水解脫落。為證實(shí)此，發(fā)明人通過超速離心和基于聚合物的沉淀從血漿樣本中分離了細(xì)胞外囊泡。的確，IL-12Rβ2與外核體標(biāo)志物CD9和CD81共同存在于沉淀中(圖9a和圖9b)。對于外核體標(biāo)志物，將System Biosciences Inc.目錄號(hào)#EXOAB-CD63A-1用作特異性結(jié)合到CD63的抗體、將System Biosciences Inc.目錄號(hào)#EXOAB-CD9A-1用作特異性結(jié)合到CD9的抗體、并將System Biosciences Inc.目錄號(hào)#EXOAB-CD81A-1用作特異性結(jié)合到CD81的抗體。此外，PDGFRβ作為平滑肌標(biāo)志物也在外核體組分中檢測到，表明患者血漿樣本中存在平滑肌細(xì)胞來源的外核體。

最后，為檢測IL-12Rβ2和PDGFRβ是否定位于相同的外核體中，使用可特異結(jié)合到PDGFRβ的抗體(Santa Cruz Biotech.clone P-20.目錄號(hào)#sc-339)從患者血漿中免疫沉淀PDGFRβ，然后檢測IL-12Rβ2。結(jié)果，如圖9c所示，在PDGFRβ免疫沉淀物中檢測到IL-12Rβ2，證實(shí)了來自平滑肌細(xì)胞的外核體中兩種蛋白質(zhì)共定位。

總之，證實(shí)了在增厚的動(dòng)脈血管中可誘導(dǎo)IL-12Rβ2表達(dá)，并且由于斑塊不穩(wěn)定而將IL-12Rβ2釋放到了患者血液中。因此，本發(fā)明證實(shí)了IL-12Rβ2可作為標(biāo)志物用于測定血管疾病的嚴(yán)重程度。

基于以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可以具體不同的形式應(yīng)用本發(fā)明而不改變其技術(shù)精髓或基本特征。因此，應(yīng)理解，上述實(shí)施方案不是限制性的，而是各方面是說明性的。本發(fā)明的范圍受所附權(quán)利要求書限定，而不受說明書限定，因此落入權(quán)利要求書的界限范圍內(nèi)所有改變和修改、或者所述界限的等價(jià)方案都意圖落入本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

<110> 梨花女子大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)

<120> 用于診斷血管疾病的生物標(biāo)志物及其用途

<130> OPA15318-PCT

<150> 10-2015-0020481

<151> 2015-02-10

<160> 3

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> Il-12 受體β2, a.a.

<400> 1

Met Ala His Thr Phe Arg Gly Cys Ser Leu Ala Phe Met Phe Ile Ile

1 5 10 15

Thr Trp Leu Leu Ile Lys Ala Lys Ile Asp Ala Cys Lys Arg Gly Asp

20 25 30

Val Thr Val Lys Pro Ser His Val Ile Leu Leu Gly Ser Thr Val Asn

35 40 45

Ile Thr Cys Ser Leu Lys Pro Arg Gln Gly Cys Phe His Tyr Ser Arg

50 55 60

Arg Asn Lys Leu Ile Leu Tyr Lys Phe Asp Arg Arg Ile Asn Phe His

65 70 75 80

His Gly His Ser Leu Asn Ser Gln Val Thr Gly Leu Pro Leu Gly Thr

85 90 95

Thr Leu Phe Val Cys Lys Leu Ala Cys Ile Asn Ser Asp Glu Ile Gln

100 105 110

Ile Cys Gly Ala Glu Ile Phe Val Gly Val Ala Pro Glu Gln Pro Gln

115 120 125

Asn Leu Ser Cys Ile Gln Lys Gly Glu Gln Gly Thr Val Ala Cys Thr

130 135 140

Trp Glu Arg Gly Arg Asp Thr His Leu Tyr Thr Glu Tyr Thr Leu Gln

145 150 155 160

Leu Ser Gly Pro Lys Asn Leu Thr Trp Gln Lys Gln Cys Lys Asp Ile

165 170 175

Tyr Cys Asp Tyr Leu Asp Phe Gly Ile Asn Leu Thr Pro Glu Ser Pro

180 185 190

Glu Ser Asn Phe Thr Ala Lys Val Thr Ala Val Asn Ser Leu Gly Ser

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Pro Ser Thr Phe Thr Phe Leu Asp Ile Val Arg Pro

210 215 220

Leu Pro Pro Trp Asp Ile Arg Ile Lys Phe Gln Lys Ala Ser Val Ser

225 230 235 240

Arg Cys Thr Leu Tyr Trp Arg Asp Glu Gly Leu Val Leu Leu Asn Arg

245 250 255

Leu Arg Tyr Arg Pro Ser Asn Ser Arg Leu Trp Asn Met Val Asn Val

260 265 270

Thr Lys Ala Lys Gly Arg His Asp Leu Leu Asp Leu Lys Pro Phe Thr

275 280 285

Glu Tyr Glu Phe Gln Ile Ser Ser Lys Leu His Leu Tyr Lys Gly Ser

290 295 300

Trp Ser Asp Trp Ser Glu Ser Leu Arg Ala Gln Thr Pro Glu Glu Glu

305 310 315 320

Pro Thr Gly Met Leu Asp Val Trp Tyr Met Lys Arg His Ile Asp Tyr

325 330 335

Ser Arg Gln Gln Ile Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ser Val Ser Glu

340 345 350

Ala Arg Gly Lys Ile Leu His Tyr Gln Val Thr Leu Gln Glu Leu Thr

355 360 365

Gly Gly Lys Ala Met Thr Gln Asn Ile Thr Gly His Thr Ser Trp Thr

370 375 380

Thr Val Ile Pro Arg Thr Gly Asn Trp Ala Val Ala Val Ser Ala Ala

385 390 395 400

Asn Ser Lys Gly Ser Ser Leu Pro Thr Arg Ile Asn Ile Met Asn Leu

405 410 415

Cys Glu Ala Gly Leu Leu Ala Pro Arg Gln Val Ser Ala Asn Ser Glu

420 425 430

Gly Met Asp Asn Ile Leu Val Thr Trp Gln Pro Pro Arg Lys Asp Pro

435 440 445

Ser Ala Val Gln Glu Tyr Val Val Glu Trp Arg Glu Leu His Pro Gly

450 455 460

Gly Asp Thr Gln Val Pro Leu Asn Trp Leu Arg Ser Arg Pro Tyr Asn

465 470 475 480

Val Ser Ala Leu Ile Ser Glu Asn Ile Lys Ser Tyr Ile Cys Tyr Glu

485 490 495

Ile Arg Val Tyr Ala Leu Ser Gly Asp Gln Gly Gly Cys Ser Ser Ile

500 505 510

Leu Gly Asn Ser Lys His Lys Ala Pro Leu Ser Gly Pro His Ile Asn

515 520 525

Ala Ile Thr Glu Glu Lys Gly Ser Ile Leu Ile Ser Trp Asn Ser Ile

530 535 540

Pro Val Gln Glu Gln Met Gly Cys Leu Leu His Tyr Arg Ile Tyr Trp

545 550 555 560

Lys Glu Arg Asp Ser Asn Ser Gln Pro Gln Leu Cys Glu Ile Pro Tyr

565 570 575

Arg Val Ser Gln Asn Ser His Pro Ile Asn Ser Leu Gln Pro Arg Val

580 585 590

Thr Tyr Val Leu Trp Met Thr Ala Leu Thr Ala Ala Gly Glu Ser Ser

595 600 605

His Gly Asn Glu Arg Glu Phe Cys Leu Gln Gly Lys Ala Asn Trp Met

610 615 620

Ala Phe Val Ala Pro Ser Ile Cys Ile Ala Ile Ile Met Val Gly Ile

625 630 635 640

Phe Ser Thr His Tyr Phe Gln Gln Lys Val Phe Val Leu Leu Ala Ala

645 650 655

Leu Arg Pro Gln Trp Cys Ser Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Asn Ser

660 665 670

Thr Cys Ala Lys Lys Tyr Pro Ile Ala Glu Glu Lys Thr Gln Leu Pro

675 680 685

Leu Asp Arg Leu Leu Ile Asp Trp Pro Thr Pro Glu Asp Pro Glu Pro

690 695 700

Leu Val Ile Ser Glu Val Leu His Gln Val Thr Pro Val Phe Arg His

705 710 715 720

Pro Pro Cys Ser Asn Trp Pro Gln Arg Glu Lys Gly Ile Gln Gly His

725 730 735

Gln Ala Ser Glu Lys Asp Met Met His Ser Ala Ser Ser Pro Pro Pro

740 745 750

Pro Arg Ala Leu Gln Ala Glu Ser Arg Gln Leu Val Asp Leu Tyr Lys

755 760 765

Val Leu Glu Ser Arg Gly Ser Asp Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Cys

770 775 780

Pro Trp Thr Val Leu Pro Ala Gly Asp Leu Pro Thr His Asp Gly Tyr

785 790 795 800

Leu Pro Ser Asn Ile Asp Asp Leu Pro Ser His Glu Ala Pro Leu Ala

805 810 815

Asp Ser Leu Glu Glu Leu Glu Pro Gln His Ile Ser Leu Ser Val Phe

820 825 830

Pro Ser Ser Ser Leu His Pro Leu Thr Phe Ser Cys Gly Asp Lys Leu

835 840 845

Thr Leu Asp Gln Leu Lys Met Arg Cys Asp Ser Leu Met Leu

850 855 860

<210> 2

<211> 4040

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> Il-12 受體β2, CDS

<400> 2

tgcagagaac agagaaagga catctgcgag gaaagttccc tgatggctgt caacaaagtg 60

ccacgtctct atggctgtgt acgctgagca cacgatttta tcgcgcctat catatcttgg 120

tgcataaacg cacctcacct cggtcaaccc ttgctccgtc ttatgagaca ggctttatta 180

tccgcatttt atatgagggg aatctgacgg tggagagaga attatcttgc tcaaggcgac 240

acagcagagc ccacaggtgg cagaatccca cccgagcccg cttcgacccg cggggtggaa 300

accacgggcg cccgcccggc tgcgcttcca gagctgaact gagaagcgag tcctctccgc 360

cctgcggcca ccgcccagcc ccgacccccg ccccggcccg atcctcactc gccgccagct 420

ccccgcgccc accccggagt tggtggcgca gaggcgggag gcggaggcgg gagggcgggc 480

gctggcaccg ggaacgcccg agcgccggca gagagcgcgg agagcgcgac acgtgcggcc 540

cagagcaccg gggccacccg gtccccgcag gcccgggacc gcgcccgctg gcaggcgaca 600

cgtggaagaa tacggagttc tataccagag ttgattgttg atggcacata cttttagagg 660

atgctcattg gcatttatgt ttataatcac gtggctgttg attaaagcaa aaatagatgc 720

gtgcaagaga ggcgatgtga ctgtgaagcc ttcccatgta attttacttg gatccactgt 780

caatattaca tgctctttga agcccagaca aggctgcttt cactattcca gacgtaacaa 840

gttaatcctg tacaagtttg acagaagaat caattttcac catggccact ccctcaattc 900

tcaagtcaca ggtcttcccc ttggtacaac cttgtttgtc tgcaaactgg cctgtatcaa 960

tagtgatgaa attcaaatat gtggagcaga gatcttcgtt ggtgttgctc cagaacagcc 1020

tcaaaattta tcctgcatac agaagggaga acaggggact gtggcctgca cctgggaaag 1080

aggacgagac acccacttat acactgagta tactctacag ctaagtggac caaaaaattt 1140

aacctggcag aagcaatgta aagacattta ttgtgactat ttggactttg gaatcaacct 1200

cacccctgaa tcacctgaat ccaatttcac agccaaggtt actgctgtca atagtcttgg 1260

aagctcctct tcacttccat ccacattcac attcttggac atagtgaggc ctcttcctcc 1320

gtgggacatt agaatcaaat ttcaaaaggc ttccgtgagc agatgtaccc tttattggag 1380

agatgaggga ctggtactgc ttaatcgact cagatatcgg cccagtaaca gcaggctctg 1440

gaatatggtt aatgttacaa aggccaaagg aagacatgat ttgctggatc tgaaaccatt 1500

tacagaatat gaatttcaga tttcctctaa gctacatctt tataagggaa gttggagtga 1560

ttggagtgaa tcattgagag cacaaacacc agaagaagag cctactggga tgttagatgt 1620

ctggtacatg aaacggcaca ttgactacag tagacaacag atttctcttt tctggaagaa 1680

tctgagtgtc tcagaggcaa gaggaaaaat tctccactat caggtgacct tgcaggagct 1740

gacaggaggg aaagccatga cacagaacat cacaggacac acctcctgga ccacagtcat 1800

tcctagaacc ggaaattggg ctgtggctgt gtctgcagca aattcaaaag gcagttctct 1860

gcccactcgt attaacataa tgaacctgtg tgaggcaggg ttgctggctc ctcgccaggt 1920

ctctgcaaac tcagagggca tggacaacat tctggtgact tggcagcctc ccaggaaaga 1980

tccctctgct gttcaggagt acgtggtgga atggagagag ctccatccag ggggtgacac 2040

acaggtccct ctaaactggc tacggagtcg accctacaat gtgtctgctc tgatttcaga 2100

gaacataaaa tcctacatct gttatgaaat ccgtgtgtat gcactctcag gggatcaagg 2160

aggatgcagc tccatcctgg gtaactctaa gcacaaagca ccactgagtg gcccccacat 2220

taatgccatc acagaggaaa aggggagcat tttaatttca tggaacagca ttccagtcca 2280

ggagcaaatg ggctgcctcc tccattatag gatatactgg aaggaacggg actccaactc 2340

ccagcctcag ctctgtgaaa ttccctacag agtctcccaa aattcacatc caataaacag 2400

cctgcagccc cgagtgacat atgtcctgtg gatgacagct ctgacagctg ctggtgaaag 2460

ttcccacgga aatgagaggg aattttgtct gcaaggtaaa gccaattgga tggcgtttgt 2520

ggcaccaagc atttgcattg ctatcatcat ggtgggcatt ttctcaacgc attacttcca 2580

gcaaaaggtg tttgttctcc tagcagccct cagacctcag tggtgtagca gagaaattcc 2640

agatccagca aatagcactt gcgctaagaa atatcccatt gcagaggaga agacacagct 2700

gcccttggac aggctcctga tagactggcc cacgcctgaa gatcctgaac cgctggtcat 2760

cagtgaagtc cttcatcaag tgaccccagt tttcagacat cccccctgct ccaactggcc 2820

acaaagggaa aaaggaatcc aaggtcatca ggcctctgag aaagacatga tgcacagtgc 2880

ctcaagccca ccacctccaa gagctctcca agctgagagc agacaactgg tggatctgta 2940

caaggtgctg gagagcaggg gctccgaccc aaagccagaa aacccagcct gtccctggac 3000

ggtgctccca gcaggtgacc ttcccaccca tgatggctac ttaccctcca acatagatga 3060

cctcccctca catgaggcac ctctcgctga ctctctggaa gaactggagc ctcagcacat 3120

ctccctttct gttttcccct caagttctct tcacccactc accttctcct gtggtgataa 3180

gctgactctg gatcagttaa agatgaggtg tgactccctc atgctctgag tggtgaggct 3240

tcaagcctta aagtcagtgt gccctcaacc agcacagcct gccccaattc ccccagcccc 3300

tgctccagca gctgtcatct ctgggtgcca ccatcggtct ggctgcagct agaggacagg 3360

caagccagct ctgggggagt cttaggaact gggagttggt cttcactcag atgcctcatc 3420

ttgcctttcc cagggcctta aaattacatc cttcactgtg tggacctaga gactccaact 3480

tgaattccta gtaactttct tggtatgctg gccagaaagg gaaatgagga ggagagtaga 3540

aaccacagct cttagtagta atggcataca gtctagagga ccattcatgc aatgactatt 3600

tctaaagcac ctgctacaca gcaggctgta cacagcagat cagtactgtt caacagaact 3660

tcctgagatg atggaaatgt tctacctctg cactcactgt ccagtacatt agacactagg 3720

cacattggct gttaatcact tggaatgtgt ttagcttgac tgaggaatta aattttgatt 3780

gtaaatttaa atcgccacac atggctagtg gctactgtat tggagtgcac agctctagat 3840

ggctcctaga ttattgagag cctccaaaac aaatcaacct agttctatag atgaagacat 3900

aaaagacact ggtaaacacc aatgtaaaag ggcccccaag gtggtcatga ctggtctcat 3960

ttgcagaagt ctaagaatgt acctttttct ggccgggcgt ggtagctcat gcctgtaatc 4020

ccagcacttt gggaggctga 4040

<210> 3

<211> 2589

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<223> Il-12 受體β2, 來自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司的cDNA 序列

<400> 3

atggcacata cttttagagg atgctcattg gcatttatgt ttataatcac gtggctgttg 60

attaaagcaa aaatagatgc gtgcaagaga ggcgatgtga ctgtgaagcc ttcccatgta 120

attttacttg gatccactgt caatattaca tgctctttga agcccagaca aggctgcttt 180

cactattcca gacgtaacaa gttaatcctg tacaagtttg acagaagaat caattttcac 240

catggccact ccctcaattc tcaagtcaca ggtcttcccc ttggtacaac cttgtttgtc 300

tgcaaactgg cctgtatcaa tagtgatgaa attcaaatat gtggagcaga gatcttcgtt 360

ggtgttgctc cagaacagcc tcaaaattta tcctgcatac agaagggaga acaggggact 420

gtggcctgca cctgggaaag aggacgagac acccacttat acactgagta tactctacag 480

ctaagtggac caaaaaattt aacctggcag aagcaatgta aagacattta ttgtgactat 540

ttggactttg gaatcaacct cacccctgaa tcacctgaat ccaatttcac agccaaggtt 600

actgctgtca atagtcttgg aagctcctct tcacttccat ccacattcac attcttggac 660

atagtgaggc ctcttcctcc gtgggacatt agaatcaaat ttcaaaaggc ttccgtgagc 720

agatgtaccc tttattggag agatgaggga ctggtactgc ttaatcgact cagatatcgg 780

cccagtaaca gcaggctctg gaatatggtt aatgttacaa aggccaaagg aagacatgat 840

ttgctggatc tgaaaccatt tacagaatat gaatttcaga tttcctctaa gctacatctt 900

tataagggaa gttggagtga ttggagtgaa tcattgagag cacaaacacc agaagaagag 960

cctactggga tgttagatgt ctggtacatg aaacggcaca ttgactacag tagacaacag 1020

atttctcttt tctggaagaa tctgagtgtc tcagaggcaa gaggaaaaat tctccactat 1080

caggtgacct tgcaggagct gacaggaggg aaagccatga cacagaacat cacaggacac 1140

acctcctgga ccacagtcat tcctagaacc ggaaattggg ctgtggctgt gtctgcagca 1200

aattcaaaag gcagttctct gcccactcgt attaacataa tgaacctgtg tgaggcaggg 1260

ttgctggctc ctcgccaggt ctctgcaaac tcagagggca tggacaacat tctggtgact 1320

tggcagcctc ccaggaaaga tccctctgct gttcaggagt acgtggtgga atggagagag 1380

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