本申請(qǐng)要求提交于2014年3月17日的SG臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0201400705X的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及預(yù)測(cè)化合物毒性的體外方法，包括器官特異性毒性或組織特異性毒性。
背景技術(shù)：
：：轉(zhuǎn)錄因子的NF-κB家族(在此統(tǒng)稱為NF-κB)是在動(dòng)物和人中的炎癥和應(yīng)激反應(yīng)的主導(dǎo)調(diào)節(jié)因子[1,2]。NF-κB被廣泛(ubiquitously)表達(dá)，并通常以未激活狀態(tài)保持在細(xì)胞質(zhì)中[3,4]。NF-κB可以由大量各種不同的應(yīng)激因子激活，包括細(xì)胞因子、細(xì)菌毒素、病毒產(chǎn)物、低氧、活性氧和紫外光[3-5]。通過(guò)激活，NF-κB迅速易位進(jìn)入核中，在核中它調(diào)節(jié)大量的靶標(biāo)基因。由于NF-κB靶向的基因的數(shù)量和種類，NF-κB激活與許多疾病包括癌癥[1,6]和炎癥疾病比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、哮喘、多發(fā)性硬化、炎癥腸病以及潰瘍性結(jié)腸炎[7]有關(guān)。這些疾病影響各種器官系統(tǒng)，比如肺、腸、心血管系統(tǒng)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)。NF-κB激活還與各種形式的腎疾病有關(guān)[8,9]。在特定的細(xì)胞類型中NF-κB被激活，所述特定的細(xì)胞涉及疾病過(guò)程或受某些應(yīng)激因素(stressors)影響。轉(zhuǎn)錄因子的NF-κB家族由不同的蛋白亞基的同二聚體或異二聚體組成。迄今，已經(jīng)鑒定了五種蛋白亞基[5]。很多NF-κB調(diào)節(jié)的靶標(biāo)基因涉及炎癥反應(yīng)；然而被靶向的基因的精確組取決于NF-κB的同種型和涉及的亞基。NF-κB的p65亞基是促炎白細(xì)胞介素(IL)IL-6和IL-8的激活所必需的[10-12]。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：提供了一種用于預(yù)測(cè)化合物的器官特異性或組織特異性毒性的體外測(cè)定，由化合物激活NF-κB并誘導(dǎo)其核易位的能力反映。所述測(cè)定基于NF-κΒ的核易位的檢測(cè)，例如，NF-κΒ亞基p65的核易位。簡(jiǎn)要地，選擇的細(xì)胞類型首先用可能有毒或無(wú)毒的待篩選化合物處理，然后測(cè)量NF-κΒ易位，以預(yù)測(cè)化合物的毒性以及其通過(guò)激活NF-κB誘導(dǎo)促炎NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。該測(cè)定適合高內(nèi)涵篩選(HCS)，且在一些實(shí)施方式中，HCS可以是用于評(píng)估NF-κΒ易位的優(yōu)選方法。所述測(cè)定可以使用原代體器官或組織特異性細(xì)胞或干細(xì)胞、干細(xì)胞衍生的器官特異性脊椎動(dòng)物細(xì)胞、生殖細(xì)胞(germscells)或它們的前體、或者器官特異性或組織特異性建立的細(xì)胞系，即永生或永生化細(xì)胞系。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種篩選化合物的毒性的體外方法，所述方法包括：使測(cè)試化合物與測(cè)試細(xì)胞群接觸，在所述測(cè)試細(xì)胞群中的核因子(NF)-κΒ在接觸之前未被激活；在接觸之后確定測(cè)試群中NF-κB的核定位水平；以及將測(cè)試群中NF-κB的核定位水平與未與測(cè)試化合物接觸的對(duì)照細(xì)胞群中的NF-κB的核定位水平進(jìn)行比較；其中相對(duì)于對(duì)照群，測(cè)試群中NF-κB的核定位水平的增加表明測(cè)試化合物損傷細(xì)胞和/或誘導(dǎo)促炎反應(yīng)。在所述方法中評(píng)估的NF-κΒ可以是NF-κΒ的任何同種型或亞基。在一些實(shí)施方式中，NF-κΒ是NF-κΒ的p65亞基。在一些實(shí)施方式中，NF-κΒ的p65亞基包含如SEQIDNO:1至4中任一個(gè)所示的序列，或者SEQIDNO:5或6所示的序列。在所述方法中使用的細(xì)胞，包括測(cè)試細(xì)胞群和對(duì)照細(xì)胞群的細(xì)胞，可以是人細(xì)胞或者可以是非人動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可以包含干細(xì)胞，包括例如胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、組織特異性干細(xì)胞或器官特異性干細(xì)胞。細(xì)胞可以包含體細(xì)胞或衍生自干細(xì)胞的細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以包含腫瘤細(xì)胞、生殖細(xì)胞或其前體、或者原代細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞可以包含肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、心血管細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、肺細(xì)胞、胰細(xì)胞、消化道細(xì)胞、眼細(xì)胞、耳細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或血細(xì)胞。細(xì)胞可以包含腎近端小管細(xì)胞，包括例如人原代腎近端小管細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以包含來(lái)自建立的細(xì)胞系的細(xì)胞，包括例如HK-2細(xì)胞或LLC-PK1細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以包含衍生自干細(xì)胞的細(xì)胞，所述干細(xì)胞分化自：胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞或器官/組織特異性干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞可以被至少部分分化成類肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、心血管細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、肺細(xì)胞、胰細(xì)胞、消化道細(xì)胞、生殖細(xì)胞或其前體、眼細(xì)胞、耳細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或血細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞可以是腎近端小管樣細(xì)胞。在所述方法中，接觸在約1小時(shí)至約16小時(shí)、約12小時(shí)至約16小時(shí)、或約30至約36小時(shí)、或約3天的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行。所述方法還包括在確定之前，在至多4周的總時(shí)間段內(nèi)以規(guī)律的間隔，重復(fù)一次或多次所述接觸，包括其中對(duì)于接觸的每次發(fā)生，接觸進(jìn)行相同時(shí)間段。所述方法還包括在至多4周的總時(shí)間段內(nèi)以規(guī)律的間隔重復(fù)接觸，隨后進(jìn)行一次或多次確定，包括其中對(duì)于接觸的每次發(fā)生，接觸進(jìn)行相同時(shí)間段。結(jié)合所附表和附圖，在綜述本發(fā)明的具體實(shí)施方案的下列描述后，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的其它方面和特征將變得明顯。附圖說(shuō)明在附圖中只通過(guò)示例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，附圖如下：圖1：比較先前基于NF-κB的測(cè)定和本發(fā)明的方法的實(shí)施方案的示意圖。圖2：用于檢測(cè)化合物誘導(dǎo)的NF-κB易位的本發(fā)明的方法的高內(nèi)涵篩選(HCS)實(shí)施方式的概述。圖3：(含有表1)測(cè)試的41種不同化合物的NF-κB易位的熱圖。圖4：(含有表2)測(cè)試的41種不同化合物的EC50值和確定的陽(yáng)性細(xì)胞的最高百分比。圖5：(含有表3)測(cè)試的42種不同化合物的NF-κB易位的定性分析。圖6：靈敏度、特異性和與臨床數(shù)據(jù)的總體一致性的圖示。圖7：(含有表4)測(cè)試的43種不同化合物的熱圖。圖8：(含有表5)使用化合物誘導(dǎo)的NF-κB易位作為終點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)藥物誘導(dǎo)的近端小管毒性。圖9：通過(guò)HCS成像的HPTC1(對(duì)照)。圖10：在用直接損傷人近端小管的腎毒性劑處理后(以指示的濃度)，通過(guò)HCS成像的HPTC1。測(cè)定每種化合物的EC50和IC50值。圖11：在用直接損傷人近端小管的腎毒性劑處理(以1000μg/mL)后，通過(guò)HCS成像的HPTC1。圖12：在用對(duì)人近端小管細(xì)胞不直接有毒的化合物處理(以1000μg/mL)后，通過(guò)HCS成像的HPTC1。具體實(shí)施方式轉(zhuǎn)錄因子NF-κΒ的激活導(dǎo)致廣泛表達(dá)的NF-κΒ從細(xì)胞質(zhì)易位到核。NF-κΒ激活與許多疾病有關(guān)，結(jié)果是，對(duì)鑒定調(diào)節(jié)或抑制激活的NF-κΒ的活性的化合物感興趣[7,13,14]。因此，以前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了檢測(cè)給定的測(cè)試化合物對(duì)NF-κΒ活性的作用的測(cè)定。這樣的以前的測(cè)定使用已知誘導(dǎo)NF-κΒ核易位的激動(dòng)劑，且因此激活，隨后評(píng)估測(cè)試化合物對(duì)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的NF-κΒ核定位的作用。典型地，在這樣的測(cè)定中使用的激動(dòng)劑包括腫瘤壞死因子(TNF)-α或IL-1。因此，這些以前描述的測(cè)定涉及(address)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括調(diào)節(jié)NF-κΒ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但是不涉及細(xì)胞毒性或待篩選測(cè)試化合物激活NF-κΒ的能力。與以前建立的使用激活劑/激動(dòng)劑來(lái)激活NF-κΒ的基于NF-κΒ的測(cè)定不同，本方法基于這樣的假設(shè)，即有毒的化合物對(duì)細(xì)胞施加應(yīng)激，這種應(yīng)激然后能夠激活NF-κB且誘導(dǎo)它的核易位。因此，在此描述的方法中，測(cè)量測(cè)試化合物(不存在任何激活劑或激動(dòng)劑)誘導(dǎo)NF-κB易位的能力，作為確定化合物毒性的方法。同樣地，由測(cè)試化合物誘導(dǎo)的NF-κΒ的易位，反映了化合物激活NF-κΒ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和誘導(dǎo)促炎作用的可能。在此描述的測(cè)定方法中，首先使用待篩選毒性的可能有毒的化合物處理細(xì)胞。然后測(cè)定NF-κB的易位，以確定化合物的毒性和它的促炎可能。誘導(dǎo)NF-κB易位的化合物分類為陽(yáng)性的，且預(yù)測(cè)對(duì)于使用的特定的細(xì)胞類型是有毒的。圖1顯示以前已知用于確定NF-κΒ調(diào)節(jié)的測(cè)定的設(shè)計(jì)，并且將它與在此描述的方法的設(shè)計(jì)相比較。設(shè)計(jì)以前已知的基于NF-κΒ的測(cè)定(圖1的左側(cè))來(lái)檢測(cè)化合物對(duì)激活的NF-κB的調(diào)節(jié)作用。因此NF-κΒ的核易位首先由激動(dòng)劑誘導(dǎo)(例如TNF-α或IL1)。激活狀態(tài)在此用具有淺色細(xì)胞質(zhì)和深色核的細(xì)胞來(lái)表示。激活的樣本具有在核中提高的NF-κB定位，然后使用待篩選化合物處理(箭頭)。篩選的化合物對(duì)激動(dòng)劑誘導(dǎo)的NF-κΒ活性的調(diào)節(jié)作用通常由HCS檢測(cè)。相比之下，在此描述的方法中(圖1的右側(cè))，細(xì)胞僅使用待篩選化合物處理。未使用激動(dòng)劑誘導(dǎo)NF-κB的核易位。因此，NF-κB定位在細(xì)胞質(zhì)中，在與任何待篩選化合物接觸之前是未激活的(這里由具有深色細(xì)胞質(zhì)和淺色核的細(xì)胞來(lái)表示)。由有毒的細(xì)胞損傷導(dǎo)致的可能的NF-κB激活可以由HCS檢測(cè)。尤其是，在此描述的測(cè)定方法中，未使用細(xì)胞因子或另外的激動(dòng)劑(例如TNFα)激活NF-κB。這個(gè)特征將所述測(cè)定與先前已知的基于NF-κB的HCS測(cè)定區(qū)分開(kāi)。換言之，在此描述的測(cè)定測(cè)量了化合物誘導(dǎo)NF-κB易位的能力，而不是由測(cè)試化合物調(diào)節(jié)NF-κB激活，隨后由另一種化合物誘導(dǎo)NF-κB的核易位。因此，在一個(gè)方面，提供了一種篩選測(cè)試化合物的毒性的體外方法。簡(jiǎn)要地，該方法包括使測(cè)試化合物與測(cè)試細(xì)胞群接觸，所述測(cè)試細(xì)胞群中的NF-κB在接觸前未被激活。然后評(píng)估NF-κB的核定位水平，并且與對(duì)照群的NF-κB核定位水平比較，所述對(duì)照群沒(méi)有使用測(cè)試化合物處理。測(cè)試化合物可以是其毒性待評(píng)估的任何化合物，包括在進(jìn)行方法前未知其激活NF-κB或誘導(dǎo)NF-κB核易位的能力的化合物。測(cè)試化合物可以是預(yù)期與受試者接觸的任何化合物，包括通過(guò)吸入、局部應(yīng)用于、吸收、攝取、施用于或植入受試者。例如，測(cè)試化合物可以是藥物化合物、有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)化合物、殺蟲劑、除草劑、環(huán)境毒素、真菌毒素、微生物毒素、含重金屬的化合物、有機(jī)溶劑、清潔劑、防腐劑、食品添加劑、膳食補(bǔ)充劑、草藥化合物、動(dòng)物衍生化合物、抗微生物化合物、化妝品成分、微粒子或納米粒子。使測(cè)試化合物與測(cè)試細(xì)胞群接觸。在與測(cè)試化合物接觸之前，測(cè)試細(xì)胞群沒(méi)有誘導(dǎo)的NF-κB激活。因此，在接觸之前，大多數(shù)NF-κB將定位于測(cè)試群的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并且因此可被激活，然后易位到核，這取決于接觸期間測(cè)試化合物的活性。測(cè)試群可以是在其中期望評(píng)估測(cè)試化合物的毒性的任何細(xì)胞群。如在此所用，在上下文允許的情況下，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”包括當(dāng)涉及屬于對(duì)照細(xì)胞群或測(cè)試細(xì)胞群的細(xì)胞時(shí)，意指單個(gè)細(xì)胞以及多個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群。類似地，在上下文允許的情況下，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”或細(xì)胞的“群”也意指單個(gè)細(xì)胞。測(cè)試的細(xì)胞群可以由任何類型的細(xì)胞組成，包括任何類型的人或非人動(dòng)物細(xì)胞，包括小鼠細(xì)胞或大鼠細(xì)胞。細(xì)胞可以是干細(xì)胞或可以是體細(xì)胞如原代細(xì)胞、建立的細(xì)胞系如永生或永生化細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、生殖細(xì)胞或其前體、以及衍生自或分化自干細(xì)胞的細(xì)胞，包括從誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞衍生或分化的。測(cè)試細(xì)胞群可以是單細(xì)胞類型或可以是含有兩種或更多種不同細(xì)胞類型的混合群。因此，測(cè)試群可以包含干細(xì)胞群。干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞或組織特異性干細(xì)胞、或器官特異性干細(xì)胞。干細(xì)胞可以包含人胚胎干細(xì)胞，包括來(lái)自現(xiàn)有細(xì)胞系的人胚胎干細(xì)胞。測(cè)試群可以包含生殖細(xì)胞群或其前體。使用的測(cè)試群可以包含體細(xì)胞，衍生自體細(xì)胞的細(xì)胞或通過(guò)干細(xì)胞分化衍生的細(xì)胞。細(xì)胞可以包含原代細(xì)胞，來(lái)自建立的細(xì)胞系的細(xì)胞，包括永生化細(xì)胞系或腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞可以分化自干細(xì)胞，包括從胚胎干細(xì)胞、從間充質(zhì)干細(xì)胞、從誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、從組織特異性干細(xì)胞或從器官特異性干細(xì)胞分化的細(xì)胞。體細(xì)胞和衍生自體細(xì)胞的細(xì)胞包括原代細(xì)胞或來(lái)自建立的、永生的或永生化細(xì)胞系的細(xì)胞。例如，體細(xì)胞可以是任何類型的器官特異性或組織特異性細(xì)胞類型，例如但不限于肝細(xì)胞(肝細(xì)胞或其它肝細(xì)胞類型)、腎細(xì)胞(小球、小管和其它腎細(xì)胞類型)、心血管細(xì)胞(心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞(神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、皮膚細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞和附件結(jié)構(gòu)特異性細(xì)胞類型：腺體和毛囊)、肺細(xì)胞(氣道上皮細(xì)胞、肺泡細(xì)胞)、胰細(xì)胞(β細(xì)胞和其它胰細(xì)胞類型)、消化道細(xì)胞(胃和小腸的不同細(xì)胞類型)、生殖器官特異性細(xì)胞類型、感覺(jué)器官(眼和耳特異性細(xì)胞類型)、骨髓細(xì)胞或血細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是腎近端小管細(xì)胞，包括例如人原代腎近端小管細(xì)胞、HK-2細(xì)胞或LLC-PK1細(xì)胞。衍生自干細(xì)胞的細(xì)胞包括已經(jīng)從胚胎干細(xì)胞、從間充質(zhì)干細(xì)胞、從誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、從器官特異性干細(xì)胞或從組織特異性干細(xì)胞分化的細(xì)胞。例如，衍生自干細(xì)胞的細(xì)胞包括至少部分分化為類肝細(xì)胞(肝細(xì)胞或其它肝細(xì)胞類型)、腎細(xì)胞(小球，小管和其它腎細(xì)胞類型)、心血管細(xì)胞(心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞(神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、皮膚細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞和附件結(jié)構(gòu)特異性細(xì)胞類型：腺體和毛囊)、肺細(xì)胞(氣道上皮細(xì)胞、肺泡細(xì)胞)、胰細(xì)胞(β細(xì)胞和其它胰細(xì)胞類型)、消化道細(xì)胞(胃和小腸的不同細(xì)胞類型)、生殖器官特異性的細(xì)胞類型包括生殖細(xì)胞及其前體、感覺(jué)器官(眼和耳特異性細(xì)胞類型)、骨髓細(xì)胞或血細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞是腎近端小管樣細(xì)胞。使用未分化或部分分化的干細(xì)胞可以允許評(píng)估化合物的胚胎毒性和/或一般毒性，而不必評(píng)估組織特異性或器官特異性。然而，可能需要在特定細(xì)胞類型中評(píng)估毒性，包括組織特異性毒性或器官特異性毒性的評(píng)估。NF-κB在所有人和動(dòng)物細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)，并且NF-κB激活在與損傷、疾病和炎癥相關(guān)的許多不同器官系統(tǒng)中發(fā)生[7]。使用NF-κB核易位作為用于預(yù)測(cè)器官特異性毒性的體外測(cè)定的終點(diǎn)是特別感興趣的。以前，難以鑒定這種體外測(cè)定的合適終點(diǎn)。雖然用于測(cè)量一般細(xì)胞毒性(例如細(xì)胞死亡、降低的代謝活性、ATP消耗)的終點(diǎn)被普遍使用，但是具有這樣終點(diǎn)的器官特異性毒性的預(yù)測(cè)尚未成功[16,17]。目前，沒(méi)有接受的用于預(yù)測(cè)對(duì)內(nèi)部的人器官的毒性作用的體外測(cè)定(經(jīng)驗(yàn)證和接受的替代方法的列表提供在alttox.org/mapp/table-of-validated-and-accepted-alternative-methods/中)。在這種情況下，所使用的細(xì)胞可以部分或完全分化。例如，細(xì)胞群可以是對(duì)特定類型的組織或器官特異性的體原代細(xì)胞、衍生自體細(xì)胞的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞或建立的細(xì)胞系、組織特異性干細(xì)胞、器官特異性干細(xì)胞、或部分或完全分化自干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞)的細(xì)胞。在使測(cè)試化合物與測(cè)試細(xì)胞群接觸之前，首先可根據(jù)適用于所使用的細(xì)胞類型的標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)方法培養(yǎng)測(cè)試群。不同的細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)條件和技術(shù)是已知的，例如在MolecularCloning:ALaboratoryManual,第四版,由MichaelR.Green和JosephSambrook,2012,ColdSpringHarborLaboratoryPress，以及在參考文獻(xiàn)[18]中描述的。測(cè)試細(xì)胞群可以以任何形式培養(yǎng)，包括作為匯合單層、亞匯合單層、匯合上皮、組織化培養(yǎng)、匯合2D培養(yǎng)、體外小管、3D組織化培養(yǎng)或3D培養(yǎng)包括靜態(tài)3D培養(yǎng)或在微流體條件下生長(zhǎng)的3D培養(yǎng)。如上所述，測(cè)試群可以由單細(xì)胞類型組成或可以表現(xiàn)為兩種或更多種不同細(xì)胞類型的共培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞以單層生長(zhǎng)，如匯合或亞匯合單層。如果使用自動(dòng)化檢測(cè)方法，則優(yōu)選單層培養(yǎng)，因?yàn)?D培養(yǎng)包括不適于當(dāng)前HCS方法的多細(xì)胞層。例如，細(xì)胞可以在多孔板中以高密度(例如約20000個(gè)細(xì)胞/cm2至約50000個(gè)細(xì)胞/cm2)接種。如果使用如永生細(xì)胞系或人原代腎近端小管細(xì)胞(HPTC)的細(xì)胞，由聚苯乙烯制成的組織培養(yǎng)板通常不需要用包被、凝膠等進(jìn)行任何處理。如果使用其它原代人細(xì)胞類型(例如通常用膠原蛋白I包被培養(yǎng)的肝細(xì)胞)或干細(xì)胞，組織培養(yǎng)板可能需要包被，如MatrigelTM或合成的包被。例如，將hESC和hiPSC培養(yǎng)和分化成HPTC樣細(xì)胞可能涉及在組織培養(yǎng)板上使用hESC限定的MatrigelTM包被。在與化合物接觸之前，可以將細(xì)胞培養(yǎng)合適的時(shí)間段，例如約1天或更長(zhǎng)、約3天或更長(zhǎng)、或約1至約3天，以提供細(xì)胞平衡的時(shí)間，如果需要的話形成單層且分化。例如，如果使用HPTC，可以在與測(cè)試化合物接觸之前形成由單細(xì)胞層(即單層(simple)上皮)組成的分化的腎上皮。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞可以在微流體生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)，包括以匯合或亞匯合單層的形式。如本文所述，微流體生物反應(yīng)器可用于長(zhǎng)期培養(yǎng)和重復(fù)暴露于測(cè)試化合物。這種形式可用于在培養(yǎng)中產(chǎn)生化合物濃度梯度。如將理解的，測(cè)試群和對(duì)照群應(yīng)當(dāng)使用相同的細(xì)胞類型。典型地，除了與測(cè)試化合物接觸以外，對(duì)照群應(yīng)以與測(cè)試群相同的方式進(jìn)行培養(yǎng)和處理。相反，可能合適的是，使對(duì)照群與載體對(duì)照接觸，例如用于溶解測(cè)試化合物但沒(méi)有包括任何測(cè)試化合物的溶液或溶劑。在該方法中，然后使測(cè)試化合物與測(cè)試群接觸?？梢酝ㄟ^(guò)將化合物加入培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行接觸。例如，化合物可以溶解或分散在液體載體中，如溶劑或溶液中。接觸可以在一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，例如通過(guò)將待測(cè)試的化合物與培養(yǎng)的細(xì)胞孵育。接觸可以進(jìn)行約1分鐘或更長(zhǎng)、約5分鐘或更長(zhǎng)、約15分鐘或更長(zhǎng)、約1小時(shí)或更長(zhǎng)、約2小時(shí)或更長(zhǎng)、約4小時(shí)或更長(zhǎng)、約8小時(shí)或更長(zhǎng)、約16小時(shí)或更長(zhǎng)、約24小時(shí)或更長(zhǎng)、約36小時(shí)或更長(zhǎng)、約48小時(shí)或更長(zhǎng)、約60小時(shí)或更長(zhǎng)，或約72小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間段。接觸可以進(jìn)行約15分鐘至約72小時(shí)、約1小時(shí)至約48小時(shí)、約1小時(shí)至約24小時(shí)、約1小時(shí)至約16小時(shí)、約8小時(shí)至約36小時(shí)、約16小時(shí)至約24小時(shí)、約12小時(shí)至約16小時(shí)或約30至約36小時(shí)，或約3天的時(shí)間段。測(cè)試化合物可以留在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中，如果介質(zhì)在總培養(yǎng)期間完成之前需要改變，則加入的新鮮介質(zhì)也可以含有測(cè)試化合物以保持接觸。使用的測(cè)試化合物的濃度可以變化，并且可以取決于待測(cè)試的化合物。例如，測(cè)試化合物可以以約0.001μg/mL或更高、約0.01μg/mL或更高、約0.1μg/mL或更高、約1μg/mL或更高、約10μg/mL或更高、約100μg/mL或更高、約1000μg/mL或更高、或約10000μg/mL或更高的濃度與細(xì)胞群接觸。測(cè)試化合物可以以約0.001μg/ml至約10000μg/ml、約0.001μg/ml至約1000μg/ml、約0.005μg/ml至5000μg/ml、約0.005μg/ml至約1000μg/ml、約0.01μg/ml至約1000μg/ml、或約0.01μg/ml至約500μg/ml的濃度與細(xì)胞群接觸。如上所述，盡管對(duì)照細(xì)胞群不與測(cè)試化合物接觸，但可以與陰性對(duì)照溶液接觸，例如是用于溶解或分散用于與測(cè)試群接觸的測(cè)試化合物的溶劑或溶液(載體對(duì)照)。可以重復(fù)接觸，包括周期性地。例如，接觸可以在給定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行兩次或更多次，三次或更多次，四次或更多次或者五次或更多次，任選地插入測(cè)試群不與測(cè)試化合物接觸的周期。例如，在接觸的第一階段完成后，組織培養(yǎng)介質(zhì)可以用含有測(cè)試化合物的新鮮介質(zhì)替換?？蛇x地，可以用不含測(cè)試化合物的新鮮培養(yǎng)介質(zhì)替換介質(zhì)，并且在一段時(shí)間沒(méi)有接觸之后，然后可以使測(cè)試化合物再次與測(cè)試細(xì)胞群接觸。因此，接觸可以重復(fù)一次或更多次(超過(guò)第一次的接觸)。例如，可以重復(fù)接觸，包括周期性地，在約3至約14天，或約3天至約4周的時(shí)間。在接觸的時(shí)間段之間，沒(méi)有任何測(cè)試化合物的接觸的間隔(即將細(xì)胞暴露于新鮮培養(yǎng)介質(zhì))可以持續(xù)例如約16小時(shí)至約14天、約1天至約10天、約1天至約3天、約1天至約5天或約2天至約3天。如果重復(fù)，可以在總時(shí)間段內(nèi)以規(guī)律的間隔重復(fù)接觸。每個(gè)接觸時(shí)段可以在總時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行相同的時(shí)間長(zhǎng)度。例如，在約2周的時(shí)間段，測(cè)試化合物可以與測(cè)試群接觸約8小時(shí)，每?jī)商熘貜?fù)一次。同樣，除了測(cè)試化合物不與對(duì)照群接觸以外，對(duì)照群應(yīng)以與測(cè)試群以相似的方式進(jìn)行處理。例如，可以將載體對(duì)照添加到對(duì)照群的培養(yǎng)介質(zhì)中，如同進(jìn)行測(cè)試化合物與測(cè)試群的接觸一樣，重復(fù)相同的時(shí)間段、相同的發(fā)生次數(shù)和相同的總時(shí)間段。一旦接觸完成，確定測(cè)試群和對(duì)照群的核NF-κB水平。提及的NF-κB包括提及NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的任何家族成員，包括NF-κB的任何亞基或同種型。因此，根據(jù)核定位評(píng)估的NF-κB可以是任何NF-κB，并且可以取決于在測(cè)試細(xì)胞群中使用的細(xì)胞類型。雖然NF-κB是廣泛的，但是在不同的細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)的NF-κB的形式可能不同，因此根據(jù)測(cè)定的核定位測(cè)量的NF-κB應(yīng)當(dāng)是使用的細(xì)胞類型的適當(dāng)形式的NF-κB。例如，在該方法中檢測(cè)的NF-κB包括NF-κB的不同的同種型或亞基，包括例如NF-κB的p65亞基。在一些實(shí)施方式中，NF-κB可以包含、基本上由、或者由SEQIDNO：1所示的人NF-κBp65亞基同種型1組成：MDELFPLIFPAEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFQVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPSGRPLRLPPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS。在一些實(shí)施方式中，NF-κB可以包含、基本上由、或者由SEQIDNO：2所示的人NF-κBp65亞基同種型2組成：MDELFPLIFPAEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFQEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPSGRPLRLPPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQAPAPVPVLAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS。在一些實(shí)施方式中，NF-κB可包含、基本上由、或由SEQIDNO：3所示的人NF-κBp65亞基同種型3組成：MDELFPLIFPAEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFQVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPSGRPLRLPPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPGPPQAVAPPAPKPTQAGEGTLSEALLQLQFDDEDLGALLGNSTDPAVFTDLASVDNSEFQQLLNQGIPVAPHTTEPMLMEYPEAITRLVTGAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS。在一些實(shí)施方式中，NF-κB可以包含、基本上由、或由SEQIDNO：4所示的人NF-κBp65亞基同種型4組成：MDELFPLIFPAEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFQVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPSGRPLRLPPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFSGPTDPRPPPRRIAVPSRSSASVPKPAPQPYPFTSSLSTINYDEFPTMVFPSGQISQASALAPAPPQVLPQAPAPAPAPAMVSALAQRPPDPAPAPLGAPGLPNGLLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS。在一些實(shí)施方式中，NF-κB可以包含、基本上由、或由SEQIDNO：5所示的小鼠NF-κBp65亞基組成：MDDLFPLIFPSEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGYYEADLCPDRSIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFHVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPAGRPLLLTPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFNGPTEPRPPTRRIAVPTRNSTSVPKPAPQPYTFPASLSTINFDEFSPMLLPSGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPLAQPPAPAPVLTPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNSTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVSMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPTPLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS。在一些實(shí)施方式中，NF-κB可以包含、基本上由、或由SEQIDNO：6所示的大鼠NF-κBp65亞基組成：MDDLFPLIFPSEPAQASGPYVEIIEQPKQRGMRFRYKCEGRSAGSIPGERSTDTTKTHPTIKINGYTGPGTVRISLVTKDPPHRPHPHELVGKDCRDGFYEAELCPDRCIHSFQNLGIQCVKKRDLEQAISQRIQTNNNPFQVPIEEQRGDYDLNAVRLCFQVTVRDPSGRPLRLTPVLSHPIFDNRAPNTAELKICRVNRNSGSCLGGDEIFLLCDKVQKEDIEVYFTGPGWEARGSFSQADVHRQVAIVFRTPPYADPSLQAPVRVSMQLRRPSDRELSEPMEFQYLPDTDDRHRIEEKRKRTYETFKSIMKKSPFNGPTEPRPPPRRIAVPSRGPTSVPKPAPQPYAFSTSLSTINFDEFSPMVLPPGQISNQALALAPSSAPVLAQTMVPSSAMVPSLAQPPAPVPVLAPGPPQSLSAPVPKSTQAGEGTLSEALLHLQFDADEDLGALLGNNTDPGVFTDLASVDNSEFQQLLNQGVAMSHSTAEPMLMEYPEAITRLVTGSQRPPDPAPATLGTSGLPNGLSGDEDFSSIADMDFSALLSQISS。在一些實(shí)施方式中，NF-κB包含與SEQIDNO：1至SEQIDNO：6中的任一個(gè)具有約75％或更高、約80％或更高、約85％或更高、約90％或更高、約95％或更高、約96％或更高、約97％或更高、約98％或更高、或約99％或更高的序列同一性同時(shí)仍具有NF-κB功能的蛋白，或者由所述蛋白組成或基本上由所述蛋白組成。如在此所用，“基本上由…組成”是指蛋白質(zhì)序列在序列的一端或兩端、和/或在序列內(nèi)包括一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基，例如一個(gè)或更多個(gè)、兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、五個(gè)或更多個(gè)、六個(gè)或更多個(gè)、七個(gè)或更多個(gè)、八個(gè)或更多個(gè)、九個(gè)或更多個(gè)、十個(gè)或更多個(gè)、一至十個(gè)或一至五個(gè)，但額外的氨基酸不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響蛋白質(zhì)的功能。因此，在與測(cè)試化合物接觸后，確定測(cè)試群的核中的NF-κB水平。這可以根據(jù)核中NF-κB水平的絕對(duì)值來(lái)進(jìn)行，或者可以通過(guò)比較核和細(xì)胞質(zhì)之間的NF-κB的相對(duì)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以通過(guò)確定測(cè)試群內(nèi)NF-κB水平的細(xì)胞質(zhì)/核比率來(lái)實(shí)現(xiàn)測(cè)試群中NF-κB核定位水平的確定?？梢允褂贸上窦夹g(shù)與定量圖像分析相結(jié)合來(lái)確定核NF-κB水平。用于定位、成像和定量細(xì)胞內(nèi)的分子的各種方法是已知的，包括使用針對(duì)NF-κB的熒光標(biāo)記抗體的免疫染色技術(shù)、使用針對(duì)NF-κB的第一抗體和標(biāo)記的第二抗體的檢測(cè)方法、或者在瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中表達(dá)的熒光NF-κB融合蛋白的成像。確定核和任選地細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB水平可包括自動(dòng)成像和圖像分析技術(shù)，包括高內(nèi)涵篩選(HCS)技術(shù)。HCS技術(shù)是已知的，并且包括已經(jīng)在多孔板中接種或培養(yǎng)的大量細(xì)胞的自動(dòng)成像，之后是隨后的定量圖像分析。在圖2中描述了使用HCS過(guò)程的方法的實(shí)施方式的概述。HCS的常用的同義詞包括高通量篩選或高內(nèi)涵成像。事實(shí)上，已經(jīng)建立了基于檢測(cè)和定量NF-κB易位的HCS測(cè)定[13-15]。例如，已經(jīng)通過(guò)免疫染色檢測(cè)了NF-κB的特定亞基包括p65亞基。可選地，已經(jīng)使用融合蛋白技術(shù)，其中NF-κB的亞基與熒光報(bào)告蛋白融合。已經(jīng)用人和動(dòng)物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系和癌細(xì)胞系建立了這樣的HCS測(cè)定。因此，使用計(jì)算機(jī)輔助檢測(cè)技術(shù)可以幫助檢查核和細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB定位水平?？梢允褂脵C(jī)器人或自動(dòng)化裝置或微流體裝置來(lái)進(jìn)行測(cè)定，以便增加速度。在該方法中，一旦已經(jīng)對(duì)測(cè)試群和對(duì)照群評(píng)估了NF-κB定位水平，則將測(cè)試群獲得的NF-κB定位水平與當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)并且不與測(cè)試化合物接觸時(shí)對(duì)照細(xì)胞群獲得的值進(jìn)行比較。相對(duì)于對(duì)照群，測(cè)試群中NF-κB的核定位水平的增加表明測(cè)試化合物損傷細(xì)胞和/或誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，意味著測(cè)試化合物對(duì)該細(xì)胞類型是有毒的。因此，例如，相對(duì)于對(duì)照群，測(cè)試群中NF-κB的細(xì)胞質(zhì)/核定位水平的比率的降低(或核/細(xì)胞質(zhì)定位水平的比率的增加)表明測(cè)試化合物損傷細(xì)胞和/或誘導(dǎo)促炎反應(yīng)，因此對(duì)于該細(xì)胞類型是有毒的?？赡苄枰O(shè)定用于檢測(cè)NF-κB定位水平的閾值水平。這可以通過(guò)使用已知對(duì)所用細(xì)胞類型無(wú)毒的化合物、使用一組已知通常有毒性的化合物處理的陽(yáng)性和陰性對(duì)照群來(lái)實(shí)現(xiàn)，以及如果要評(píng)估組織特異性或器官特異性毒性時(shí)，則使用一組已知對(duì)所用細(xì)胞類型特異性毒性的化合物。陽(yáng)性和陰性對(duì)照也可以用于確定總體測(cè)定性能。真陽(yáng)性、假陽(yáng)性、真陰性和假陰性的數(shù)量可以通過(guò)將體外測(cè)定的結(jié)果與體內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較來(lái)確定。隨后，可以確定主要性能度量(靈敏度、特異性、平衡精確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和受試者工作特征曲線的曲線下面積(AUC))。此外，可以確定閾值以便判定測(cè)試結(jié)果是陽(yáng)性的還是陰性的。閾值涉及相對(duì)于載體對(duì)照的NF-κB核定位的倍數(shù)增加。例如，如果NF-κB的核定位水平的增加類似于或大于閾值，則測(cè)試結(jié)果可以是陽(yáng)性的。在一些情況下，可以通過(guò)確定NF-κB的細(xì)胞質(zhì)/核比率來(lái)評(píng)估NF-κB的核定位水平。應(yīng)當(dāng)理解，NF-κB的細(xì)胞質(zhì)/核比率的降低對(duì)應(yīng)于NF-κB核定位的增加。因此，如果使用細(xì)胞質(zhì)/核比率，則陽(yáng)性值低于閾值。最佳閾值可以通過(guò)測(cè)試更寬的閾值范圍來(lái)確定。實(shí)際閾值可以根據(jù)所使用的細(xì)胞類型和所使用的培養(yǎng)和接觸條件而變化?？蛇x地，可以將自動(dòng)分類方法用于結(jié)果。這可以例如通過(guò)使用如支持向量機(jī)或隨機(jī)森林的機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)完成。對(duì)于任何給定的測(cè)試化合物，可以通過(guò)測(cè)試增加濃度的化合物并將每種濃度的結(jié)果與對(duì)照群的結(jié)果進(jìn)行比較來(lái)計(jì)算劑量反應(yīng)曲線。以這種方式，可以獲得在該方法中發(fā)現(xiàn)有毒的測(cè)試化合物的EC50值。通過(guò)以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步例證本發(fā)明的方法和用途。實(shí)施例我們開(kāi)發(fā)了基于HCS的體外模型，使用NF-κB的核易位(例如亞基p65)作為終點(diǎn)用于預(yù)測(cè)人腎近端小管(PT)毒性。如以下實(shí)施例2和3所示，使用人原代腎近端小管細(xì)胞(HPTC)或近端小管細(xì)胞系(HK-2和LLC-PK1)，發(fā)現(xiàn)模型的平衡精確度為至少70％(表5(圖8))。如下所述獲得的結(jié)果證明NF-κB的核易位可用作用于預(yù)測(cè)器官特異性毒性的體外測(cè)定中的終點(diǎn)，并與我們先前的發(fā)現(xiàn)一致。以前，我們已經(jīng)顯示，使用HPTC、HK-2和LLC-PK1細(xì)胞[18]或衍生自人胚胎[20]或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的HPTC樣細(xì)胞，測(cè)量IL-6和IL-8的上調(diào)導(dǎo)致對(duì)化合物的PT毒性的極好預(yù)測(cè)性(Kandasamy，Chuah等人，提交的手稿)。IL-6和IL-8是NF-κB的靶基因，并被p65上調(diào)[10-12]。重要的是要注意，基于IL-6/IL-8的測(cè)定[18,20]是基于qPCR并且與HCS不相容。因此，當(dāng)與HCS組合時(shí)，基于IL-6/IL-8的測(cè)定具有低得多的通量并且比基于NF-κB的測(cè)定昂貴得多。實(shí)施例1在圖2中提供了用于檢測(cè)化合物誘導(dǎo)的NF-κB易位的HCS方法的概述。該圖顯示了細(xì)胞接種和處理過(guò)程的流程圖(直箭頭)。如圖2所示的實(shí)施方式所述，在第0天將細(xì)胞接種到多孔板中(在圖2所示的實(shí)施例中使用384孔板)。接種后，培養(yǎng)細(xì)胞以允許形成匯合單層。在第3天進(jìn)行化合物過(guò)夜處理約16小時(shí)，然后在第4天固定細(xì)胞，并例如使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，細(xì)胞核)和全細(xì)胞染色(WCS)染色，用于整個(gè)細(xì)胞的可視化。通過(guò)免疫染色檢測(cè)NF-κBp65。染色后，通過(guò)HCS使板成像。在以下實(shí)施例2和3中描述的一些實(shí)驗(yàn)中，還檢測(cè)了F-肌動(dòng)蛋白。圖2的右下部分示出了一個(gè)板的HCS結(jié)果和每孔的一個(gè)多通道圖像(注意，每孔捕獲9個(gè)多通道圖像；在板邊緣的孔沒(méi)有顯示，并且不用于避免邊緣效應(yīng))。板設(shè)計(jì)的概述顯示在圖的右上方。將每種化合物(D1-D9)從底部到頂部以增加的濃度(1.6μg/mL-1000μg/mL)施加到2個(gè)柱(每個(gè)濃度4個(gè)孔(重復(fù)))。指示對(duì)照(Ctrl)的位置。由于細(xì)胞死亡而在細(xì)胞中刪除的孔出現(xiàn)深色(右，底部)。實(shí)施例2方法化合物和定義：使用與前述相同組的41種化合物(參考文獻(xiàn)[18]和[20])。包括辛伐他汀作為第42種化合物，但由于其通常的細(xì)胞毒性高，在大多數(shù)分析中排除?；衔?-22(組1)在人中是腎毒性的，并且對(duì)近端小管(PT)細(xì)胞有毒性的?；衔?3-33(組2)在人體中是腎毒性的，但對(duì)PT細(xì)胞無(wú)毒性?；衔?4-41(組3)在人中不是腎毒性的。真陽(yáng)性(TP)定義為在體外得到陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的組1化合物。真陰性(TN)定義為在體外得到陰性測(cè)試結(jié)果的組2和組3化合物。靈敏度定義為TP的數(shù)量/22種(組1)化合物。特異性定義為TN的數(shù)量/19種(組2+3)化合物。細(xì)胞培養(yǎng)和化合物處理：將商業(yè)化的HPTC(ATCC，PCS-400-010)在補(bǔ)充有腎上皮細(xì)胞生長(zhǎng)試劑盒(ATCC，PCS-400-040)的腎細(xì)胞基礎(chǔ)介質(zhì)(ATCC，PCS-400-030)中培養(yǎng)。將第4代或第5代的細(xì)胞以50,000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在96孔Falcon黑色板中。細(xì)胞培養(yǎng)3天，然后藥物處理過(guò)夜(16小時(shí))。所有化合物在1000、500、250、125、63、31、16和1.6μg/mL的濃度下進(jìn)行篩選。使用25μg/mL的三氧化二砷作為陽(yáng)性對(duì)照。在每個(gè)平板上包括陰性對(duì)照(細(xì)胞不用任何化合物或載體處理)和載體對(duì)照。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)包括3個(gè)重復(fù)。免疫染色：在用化合物處理過(guò)夜后，使用3.7％甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)固定細(xì)胞。用含有5％牛血清白蛋白(BSA)和0.2％TritonX-100的PBS封閉細(xì)胞1小時(shí)。將抗NF-κBp65抗體(1:100，sc-372；SantaCruzBiotechnology，圣克魯茲，CA，USA)與樣本在室溫下孵育1.5小時(shí)。第二抗體是AlexaFluor488山羊抗兔IgG(H+L)(A11008；1：200；MolecularProbes，LifeTechnologies，新加坡)。樣本與第二抗體和羅丹明鬼筆環(huán)肽(MolecularProbes，R415)在室溫下孵育1小時(shí)(也評(píng)估了用羅丹明鬼筆環(huán)肽檢測(cè)的F-肌動(dòng)蛋白模式，但這與NF-κB無(wú)關(guān))。最后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(4ng/mL)染色細(xì)胞核。HCS和圖像分析：使用ImageXpressMICRO系統(tǒng)2.0版(MolecularDevices，沃金厄姆，UK)進(jìn)行HCS。每孔捕獲4個(gè)圖像。MetaXpressTM圖像分析軟件(2.0版；MolecularDevices)用于定量陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。當(dāng)核區(qū)域(由DAPI染色定義)具有等于或高于細(xì)胞質(zhì)的限定區(qū)域的綠色熒光中值強(qiáng)度時(shí)，細(xì)胞被定義為NF-κB易位陽(yáng)性。該細(xì)胞質(zhì)區(qū)域由圍繞核區(qū)域的2μm厚的環(huán)組成。結(jié)果表1(圖3)含有在測(cè)定中使用的41種不同的測(cè)試化合物的熱圖；用指示的41種藥物將HPTC處理16小時(shí)。使用以下藥物濃度：1000、500、250、125、63、31、16和1.6μg/mL。通過(guò)HCS使細(xì)胞成像，除了第42號(hào)藥物(辛伐他汀)不包括在表1中以外，HCS數(shù)據(jù)組與下表3中使用的數(shù)據(jù)組相同。如方法部分中概述的，進(jìn)行圖像分析。每個(gè)框中的數(shù)字指示陽(yáng)性的且顯示NF-κB核易位的細(xì)胞的百分比(3個(gè)重復(fù)的平均值，每個(gè)重復(fù)4個(gè)圖像)。星號(hào)標(biāo)記由于細(xì)胞死亡而導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)低的案例。表2(圖4)提供了衍生自表1所示結(jié)果的EC50值，并總結(jié)了在測(cè)試的濃度范圍內(nèi)(在表1中的每行中的最高值)化合物在任何給定濃度下的陽(yáng)性細(xì)胞的最高百分比。NF-κB易位的定性分析的內(nèi)容顯示在表3(圖5)中，通過(guò)目視檢查確定。表3中總結(jié)的結(jié)果源自HCS工作，該工作是在2013年6月20日至2013年7月5日期間進(jìn)行的。用96孔板進(jìn)行篩選，所述96孔板接種有細(xì)胞、用藥物處理、進(jìn)行免疫染色并通過(guò)HCS成像。在篩選期間，記錄了用單個(gè)化合物獲得的結(jié)果，當(dāng)整個(gè)篩選在2013年7月5日完成時(shí)重新評(píng)估，并匯編在表3中。例如，使用百草枯、三氧化二砷、三氧化二鉍、氯化金、乙酸鉛、重鉻酸鉀和四環(huán)素獲得的陽(yáng)性結(jié)果。圖6顯示了靈敏度、特異性和與臨床數(shù)據(jù)的總體一致性的百分比(y軸)。截?cái)嘀?x軸)是指陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。例如，在70％的截?cái)嘀?，所有結(jié)果被分類為陽(yáng)性，其中在70％或更多的細(xì)胞中誘導(dǎo)NF-κB易位(在測(cè)試范圍內(nèi)的任何濃度，表2，右欄)。70％的截?cái)嘀祵?dǎo)致與人臨床數(shù)據(jù)的總體一致性以及平衡精確度(靈敏度+特異性的平均值)>70％。實(shí)施例3方法化合物和定義：使用一組43種化合物，包含來(lái)自實(shí)施例2的一組41種化合物中的38種(不包括妥布霉素、異環(huán)磷酰胺、阿托伐他汀)和5種新化合物(頭孢噻啶、頭孢噻吩、鹽酸二甲雙胍、馬兜鈴酸和赭曲毒素A)?；衔?-24(組1)在人中是腎毒性的，并且對(duì)近端小管(PT)細(xì)胞有毒性?；衔?5-43(組2)在人中不是腎毒性的，或在人中是腎毒性的，但對(duì)PT細(xì)胞不是直接毒性的。真陽(yáng)性(TP)定義為在體外得到陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的組1化合物。真陰性(TN)定義為在體外得到陰性測(cè)試結(jié)果的組2化合物。靈敏度定義為(TP數(shù))/24種(組1)化合物。特異性定義為(TN數(shù))/19種(組2)化合物。平衡精度是靈敏度和特異性的平均值。細(xì)胞培養(yǎng)和化合物處理：使用三種不同批次的HPTC。商業(yè)化的HPTC，貨號(hào)58488852(HPTC1)貨號(hào)61247356(HPTC10)來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection，ATCC，馬納薩斯，VA，USA)。從獲自國(guó)立大學(xué)健康系統(tǒng)(NationalUniversityHealthSystem，NUHS，新加坡)的腎切除術(shù)樣品中分離HPTC6。僅使用沒(méi)有病理變化的正常組織，其由病理學(xué)家選擇。將所有三個(gè)批次HPTC在ATCC腎上皮細(xì)胞基礎(chǔ)介質(zhì)(ATCC，目錄號(hào)PCS-400-030)中培養(yǎng)，其補(bǔ)充有腎上皮細(xì)胞生長(zhǎng)試劑盒(ATCC，目錄號(hào)PCS-400-040)和1％青霉素鏈霉素(Gibco，目錄號(hào)15140-122)。僅使用HPTC的第4代(P)和P5。HK-2和LLC-PK1細(xì)胞購(gòu)自ATCC。將這兩種細(xì)胞系保持在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle介質(zhì)(Dulbecco’sModifiedEagleMedium，DMEM)中。已獲得使用人腎臟樣本(DSRB-E/11/143)和細(xì)胞類型(NUS-IRB參考號(hào)：09-148E)的工作批準(zhǔn)。所有細(xì)胞在37℃和5％CO2的潮濕環(huán)境中孵育。將細(xì)胞接種到具有透明底的384孔黑色板(Greiner，目錄號(hào)781091)中。將HPTC1和HPTC6以50,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種；將HPTC10以100,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種；HK-2細(xì)胞以20,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種，以及LLC-PK1細(xì)胞以10,000個(gè)細(xì)胞/cm2接種，以調(diào)節(jié)所使用的不同細(xì)胞類型和批次的不同生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。所有細(xì)胞培養(yǎng)3天以在藥物處理過(guò)夜(16小時(shí))之前實(shí)現(xiàn)分化的單層上皮的形成。篩選的43種藥物的濃度為1000、500、250、125、63、16和1.6μg/mL。使用100μg/mL的嘌呤霉素和100ng/mL的TNF-α作為陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照包括剩下的未處理的細(xì)胞(無(wú)載體，無(wú)化合物)和用100μg/mL地塞米松處理的細(xì)胞。在每個(gè)板上還包括載體對(duì)照。對(duì)每種化合物和濃度測(cè)試4個(gè)重復(fù)。免疫染色：在用化合物處理過(guò)夜后，使用3.7％甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)固定細(xì)胞。用含有5％牛血清白蛋白(BSA)和0.2％TritonX-100的PBS封閉細(xì)胞1小時(shí)。將樣品與抗NF-κBp65抗體(Abcam，目錄號(hào)ab16502)在4℃孵育過(guò)夜。使用AlexaFluor488山羊抗兔IgG(H+L)(Invitrogen，目錄號(hào)A11008)作為第二抗體。最后，將細(xì)胞用DAPI(Merck，目錄號(hào)268298)，羅丹明鬼筆環(huán)肽(Invitrogen，目錄號(hào)R415)和全細(xì)胞紅色染色(Cellomics，目錄號(hào)8403401)復(fù)染。用羅丹明鬼筆環(huán)肽檢測(cè)F-肌動(dòng)蛋白與NF-κB的工作無(wú)關(guān)。HCS和圖像分析：使用與實(shí)施例1和2中所述相同的設(shè)備和軟件進(jìn)行HCS的圖像采集。使用四種不同的通道來(lái)檢測(cè)DAPI(細(xì)胞核)、AlexaFluor488(NF-κB；用于更好的獲取染色模式，NF-κB染色在圖9-12中以紅色顯示)、羅丹明鬼筆環(huán)肽(F-肌動(dòng)蛋白)和Cy5(全細(xì)胞紅色染色)。每孔9個(gè)位點(diǎn)成像(全部4個(gè)通道)。通過(guò)使用MetaXpressTM圖像分析軟件2.0版，使用易位增強(qiáng)模塊自動(dòng)分析圖像[19]。DAPI染色區(qū)域用于定義內(nèi)核區(qū)域(核)和外核區(qū)域(核周圍的細(xì)胞質(zhì))。將距離DAPI染色區(qū)域的邊緣2μm以內(nèi)的區(qū)域定義為內(nèi)核區(qū)域(核)。將距離DAPI染色區(qū)域外邊緣0.1μm至2μm的環(huán)定義為外核區(qū)域(細(xì)胞質(zhì))。通過(guò)MetaXpressTM圖像分析軟件(2.0版)自動(dòng)定量外核區(qū)域與內(nèi)核區(qū)域的強(qiáng)度比率。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的最終定量結(jié)果是來(lái)自36個(gè)圖像(4個(gè)重復(fù)(孔)，每孔9個(gè)多通道圖像)的平均結(jié)果。結(jié)果表4(圖7)描述了熱圖。將三批HPTC和兩種細(xì)胞系(HK-2和LLC-PK1)用指示的43種化合物處理16小時(shí)。使用以下化合物濃度：1000、500、250、125、63、16和1.6μg/mL。使用ImageXpressMICRO系統(tǒng)通過(guò)HCS使細(xì)胞成像。如方法部分所述，通過(guò)MetaXpressTM圖像分析軟件2.0版自動(dòng)分析圖像。在測(cè)試的每個(gè)濃度下測(cè)定每種化合物的外核區(qū)域(細(xì)胞質(zhì))對(duì)內(nèi)核區(qū)域(核)的平均強(qiáng)度比率。每個(gè)框中的數(shù)字顯示了相對(duì)于測(cè)試的濃度的整個(gè)范圍每種化合物獲得的最低強(qiáng)度比率(對(duì)于所測(cè)試的7個(gè)濃度獲得7個(gè)值，并且選擇最低值并顯示在表4中)。表4中所示的結(jié)果通過(guò)使用0.75的截?cái)嘀捣诸悶殛?yáng)性或陰性(等于或低于0.75的所有結(jié)果被分類為陽(yáng)性)。表5(圖8)提供了通過(guò)使用該截?cái)嘀但@得的靈敏度、特異性和平衡精確度的結(jié)果。使用3個(gè)不同批次的HPTC和2個(gè)細(xì)胞系(HK-2和LLC-PK1)。如圖9所示，在未處理狀態(tài)(頂部)或用指示的對(duì)照化合物處理后，通過(guò)HCS使HPTC1成像。顯示了DAPI染色的細(xì)胞核(藍(lán)色，左側(cè))或NF-κB染色(紅色，中間)。合并的圖像顯示在右側(cè)。在未處理的細(xì)胞、載體對(duì)照和陰性對(duì)照中，核區(qū)域刪除了NF-κB(在NF-κB染色(紅色，中間)的細(xì)胞中心的“整體深色”)。陽(yáng)性對(duì)照樣本(100μg/mL的嘌呤霉素和100ng/mL的TNF-α)顯示NF-κB的核易位(在DAPI陽(yáng)性核區(qū)域中NF-κB的增加的強(qiáng)度)。比例尺：50μm。如圖10所示，在用指示的化合物處理后，通過(guò)HCS使HPTC1成像。顯示了DAPI染色的核(藍(lán)色，左側(cè))或NF-κB染色(紅色，中間)。合并的圖像顯示在右側(cè)。所有化合物是對(duì)人近端小管細(xì)胞直接有毒的腎毒性劑。在所示的所選案例中使用的濃度在化合物名稱下提供(以所有濃度范圍測(cè)試每種化合物，但在此沒(méi)有顯示所有的圖像)。這里選擇的濃度是觀察到NF-κB從細(xì)胞質(zhì)易位到核的化合物的最低濃度?；谠谒鶞y(cè)試的所有濃度范圍獲得的HCS結(jié)果，計(jì)算EC50(其中50％的細(xì)胞發(fā)生NF-κB核易位的化合物濃度)和IC50(其中50％的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞死亡的化合物濃度；基于細(xì)胞核的計(jì)數(shù)結(jié)果)值。當(dāng)在1000μg/mL的最高化合物濃度下，大于50％的細(xì)胞仍然存在時(shí)，指示大于1000μg/mL的IC50值?；诖笥?000μg/mL的如此高的IC50值，如果細(xì)胞死亡已用作預(yù)測(cè)毒性的終點(diǎn)，則相應(yīng)的化合物將被預(yù)測(cè)為對(duì)人近端小管細(xì)胞不具毒性(在該圖中包括的所有化合物對(duì)于這種細(xì)胞類型有毒性)。相比之下，在所有情況中，在大于50％的細(xì)胞中在所測(cè)試的濃度范圍內(nèi)觀察到NF-κB的核易位，并且基于這些結(jié)果，所有化合物將被預(yù)測(cè)為有毒的。這些結(jié)果表明，當(dāng)使用NF-κB易位作為終點(diǎn)時(shí)，與細(xì)胞死亡相比，靈敏度更高。這也通過(guò)EC50值低于IC50值(除了他克莫司，其中兩個(gè)值都相對(duì)低)的事實(shí)得以體現(xiàn)。比例尺：50μm。如圖11所示，在用指示的化合物處理后通過(guò)HCS使HPTC1成像。使用與圖10相同的化合物。在用最大化合物濃度(1000μg/ml)處理后捕獲圖11中的圖像。觀察到大量的NF-κB的核易位。在一些圖像上，由于細(xì)胞死亡僅看到少量細(xì)胞。比例尺：50μm。如圖12所示，在用指示的化合物處理后，通過(guò)HCS使HPTC1成像。在用最大化合物濃度(1000μg/mL)處理后捕獲圖像。該圖中包括的所有化合物對(duì)于人近端小管細(xì)胞不是直接毒性的。沒(méi)有觀察到大量的NF-κB核易位或細(xì)胞死亡。所有EC50和IC50值大于1000μg/mL。比例尺：50μm。討論盡管上述實(shí)施例1和2涉及原代和永生化的人腎細(xì)胞，但是NF-κB易位還可以用于通過(guò)使用相應(yīng)的器官特異性細(xì)胞類型來(lái)篩選對(duì)其它器官的毒性作用。NF-κB在所有人和動(dòng)物細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)，并且NF-κB激活在與損傷、疾病和炎癥相關(guān)的許多不同器官系統(tǒng)中發(fā)生[7]。因此，NF-κB易位也可以用于評(píng)估化合物對(duì)于人或動(dòng)物中的其它器官系統(tǒng)的毒性和促炎能力。這可以通過(guò)使用相應(yīng)的器官特異性人或動(dòng)物細(xì)胞類型來(lái)完成。優(yōu)選地，應(yīng)當(dāng)使用衍生自成體、胚胎或誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的原代細(xì)胞或類似的細(xì)胞類型。因此，將器官特異性細(xì)胞類型接種到適合于HCS的基底(例如多孔板)上。在這樣的基底上，器官特異性細(xì)胞類型將用待篩選對(duì)該細(xì)胞類型可能有毒性和促炎作用的化合物處理?；衔飳?duì)NF-κB核易位的誘導(dǎo)將通過(guò)HCS和隨后的圖像分析來(lái)確定，并且NF-κB的激活將被歸類為陽(yáng)性結(jié)果。將使用原代人或動(dòng)物器官特異性細(xì)胞類型(例如原代腎細(xì)胞類型，例如HPTC，原代大鼠肝細(xì)胞或原代人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞)進(jìn)行測(cè)定?？蛇x地，可以使用衍生自干細(xì)胞的器官特異性細(xì)胞類型。合適的干細(xì)胞類型包括所有種類的人或動(dòng)物成體干細(xì)胞(例如骨髓衍生的間充質(zhì)干細(xì)胞或脂肪衍生的干細(xì)胞)，或者人或動(dòng)物衍生的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞?？梢园ㄔ谶@種基于NF-κB的測(cè)定中的器官系統(tǒng)和細(xì)胞類型是：肝(肝細(xì)胞和其它肝細(xì)胞類型)、腎(小球、小管和其它腎細(xì)胞類型)、心血管系統(tǒng)(心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、皮膚(角質(zhì)形成細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞和附件結(jié)構(gòu)特異性細(xì)胞類型：腺體和毛囊)、肺(氣道上皮細(xì)胞、肺泡細(xì)胞)、胰(β細(xì)胞和其它胰細(xì)胞類型)、消化道(胃和小腸的不同細(xì)胞類型)、生殖器官特異性細(xì)胞類型包括生殖細(xì)胞及其前體、感覺(jué)器官(眼和耳特異性細(xì)胞類型)、骨髓和血細(xì)胞。在此描述的測(cè)定和先前建立的基于NF-κB的HCS測(cè)定之間的差異如下。(1)在此所述的測(cè)定中，使用NF-κB/p65易位作為終點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)化合物的器官特異性毒性及其誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。該測(cè)定不涉及在用所測(cè)試的化合物處理之前由激活劑/激動(dòng)劑(例如TNF-α或IL-1)誘導(dǎo)的NF-κB易位的調(diào)節(jié)。(2)不使用NF-κB的激活劑/激動(dòng)劑，例如TNF-α或IL-1。(3)已用人原代器官特異性細(xì)胞類型進(jìn)行了HSC測(cè)定，但也可用衍生自干細(xì)胞的分化細(xì)胞進(jìn)行。在本說(shuō)明書中提及的所有出版物和專利申請(qǐng)都在此引用作為參考，就如同每一篇出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體地且單獨(dú)地指出以被引用作為參考那樣。任何出版物的引用為在申請(qǐng)日前公開(kāi)的內(nèi)容，并且不應(yīng)將其解釋為由于先于本發(fā)明而承認(rèn)本發(fā)明不早于這些公開(kāi)。如在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式的“一(a)”、“一種(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)含義，除非文意另有明確表示。在本申請(qǐng)說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中，所用術(shù)語(yǔ)“包括(comprise)”、“包含(comprising)”、“含有(comprises)”和這些術(shù)語(yǔ)的其它形式意指非限定的包含含義，換言之，在沒(méi)有排除其它任何元素或成分的情況下，包括具體所述元素或成分。如在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中所用的，所有給定的范圍或列舉旨在包含其含有的任何中間值或范圍或任何項(xiàng)目或子集。除非另外定義，本文所用全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
：的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。出于清楚理解的目的，雖然通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例已經(jīng)詳細(xì)描述了前述發(fā)明，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯而易見(jiàn)的是，鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)，在沒(méi)有脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)或范圍的情況下，可以另外進(jìn)行一些變化和修改。參考文獻(xiàn)[1]Ben-NeriahY,KarinM.Inflammationmeetscancer,withNF-kappaBasthematchmaker.NatImmunol.2011；12:715-23.[2]OeckinghausA,HaydenMS,GhoshS.CrosstalkinNF-kappaBsignalingpathways.NatImmunol.2011；12:695-708.[3]SenR,BaltimoreD.Inducibilityofkappaimmunoglobulinenhancer-bindingproteinNf-kappaBbyaposttranslationalmechanism.Cell.1986；47:921-8.[4]SunZ,AnderssonR.NF-kappaBactivationandinhibition:areview.Shock.2002；18:99-106.[5]OeckinghausA,GhoshS.TheNF-kappaBfamilyoftranscriptionfactorsanditsregulation.ColdSpringHarbPerspectBiol.2009；1:a000034.[6]DelPreteA,AllavenaP,SantoroG,FumaruloR,CorsiMM,MantovaniA.Molecularpathwaysincancer-relatedinflammation.BiochemMed(Zagreb).2011；21:264-75.[7]LawrenceT.ThenuclearfactorNF-kappaBpathwayininflammation.ColdSpringHarbPerspectBiol.2009；1:a001651.[8]GuijarroC,EgidoJ.Transcriptionfactor-kappaB(NF-kappaB)andrenaldisease.KidneyInt.2001；59:415-24.[9]SanzAB,Sanchez-NinoMD,RamosAM,MorenoJA,SantamariaB,Ruiz-OrtegaM,等人.NF-kappaBinrenalinflammation.JAmSocNephrol.2010；21:1254-62.[10]KunschC,LangRK,RosenCA,ShannonMF.SynergistictranscriptionalactivationoftheIL-8genebyNF-kappaBp65(RelA)andNF-IL-6.JImmunol.1994；153:153-64.[11]KunschC,RosenCA.NF-kappaBsubunit-specificregulationoftheinterleukin-8promoter.MolCellBiol.1993；13:6137-46.[12]MatsusakaT,FujikawaK,NishioY,MukaidaN,MatsushimaK,KishimotoT,等人.TranscriptionfactorsNF-IL6andNF-kappaBsynergisticallyactivatetranscriptionoftheinflammatorycytokines,interleukin6andinterleukin8.ProcNatlAcadSciUSA.1993；90:10193-7.[13]TraskOJ.NuclearFactorKappaB(NF-kappaB)TranslocationAssayDevelopmentandValidationforHighContentScreening.2004.[14]ZockJM.Applicationsofhighcontentscreeninginlifescienceresearch.CombChemHighThroughputScreen.2009；12:870-76.[15]DingGJ,FischerPA,BoltzRC,SchmidtJA,ColaianneJJ,GoughA,等人.CharacterizationandquantitationofNF-kappaBnucleartranslocationinducedbyinterleukin-1andtumornecrosisfactor-alpha.Developmentanduseofahighcapacityfluorescencecytometricsystem.JBiolChem.1998；273:28897-905.[16]LinZ,WillY.Evaluationofdrugswithspecificorgantoxicitiesinorgan-specificcelllines.ToxicolSci.2012；126:114-27.[17]WuY,ConnorsD,BarberL,JayachandraS,HanumegowdaUM,AdamsSP.MultiplexedassaypanelofcytotoxicityinHK-2cellsfordetectionofrenalproximaltubuleinjurypotentialofcompounds.ToxicolInVitro.2009；23:1170-8.[18]LiY,OoZY,ChangSY,HuangP,EngKG,ZengJL,等人.Aninvitromethodforthepredictionofrenalproximaltubulartoxicityinhumans.ToxicolRes.2013；2:352-62.[19]KodihaM,BrownC,StochajU.AnalysisofSignalingEventsbyCombiningHigh-ThroughputScreeningTechnologywithComputer-BasedImageAnalysis.SciSignal.2008；37:12-29.[20]LiY,KandasamyK,ChuahJK,LamYN,TohWS,OoZY,ZinkD.Identificationofnephrotoxiccompoundswithembryonicstem-cell-derivedhumanrenalproximaltubular-likecells.MolPharm.2014；11:1982-90。序列表<110>新加坡科技研究局D·津克S·熊<120>基于核因子-NFKB易位預(yù)測(cè)化合物的毒性的方法<130>93231-923<150>SG10201400705X<151>2014-03-17<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>551<212>PRT<213>人類(Homosapiens)<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(551)<223>人NF-Bp65亞基同種型1<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(551)<223>人NF-KBp65亞基同種型1<400>1MetAspGluLeuPheProLeuIlePheProAlaGluProAlaGlnAla151015SerGlyProTyrValGluIleIleGluGlnProLysGlnArgGlyMet202530ArgPheArgTyrLysCysGluGlyArgSerAlaGlySerIleProGly354045GluArgSerThrAspThrThrLysThrHisProThrIleLysIleAsn505560GlyTyrThrGlyProGlyThrValArgIleSerLeuValThrLysAsp65707580ProProHisArgProHisProHisGluLeuValGlyLysAspCysArg859095AspGlyPheTyrGluAlaGluLeuCysProAspArgCysIleHisSer100105110PheGlnAsnLeuGlyIleGlnCysValLysLysArgAspLeuGluGln115120125AlaIleSerGlnArgIleGlnThrAsnAsnAsnProPheGlnValPro130135140IleGluGluGlnArgGlyAspTyrAspLeuAsnAlaValArgLeuCys145150155160PheGlnValThrValArgAspProSerGlyArgProLeuArgLeuPro165170175ProValLeuSerHisProIlePheAspAsnArgAlaProAsnThrAla180185190GluLeuLysIleCysArgValAsnArgAsnSerGlySerCysLeuGly195200205GlyAspGluIlePheLeuLeuCysAspLysValGlnLysGluAspIle210215220GluValTyrPheThrGlyProGlyTrpGluAlaArgGlySerPheSer225230235240GlnAlaAspValHisArgGlnValAlaIleValPheArgThrProPro245250255TyrAlaAspProSerLeuGlnAlaProValArgValSerMetGlnLeu260265270ArgArgProSerAspArgGluLeuSerGluProMetGluPheGlnTyr275280285LeuProAspThrAspAspArgHisArgIleGluGluLysArgLysArg290295300ThrTyrGluThrPheLysSerIleMetLysLysSerProPheSerGly305310315320ProThrAspProArgProProProArgArgIleAlaValProSerArg325330335SerSerAlaSerValProLysProAlaProGlnProTyrProPheThr340345350SerSerLeuSerThrIleAsnTyrAspGluPheProThrMetValPhe355360365ProSerGlyGlnIleSerGlnAlaSerAlaLeuAlaProAlaProPro370375380GlnValLeuProGlnAlaProAlaProAlaProAlaProAlaMetVal385390395400SerAlaLeuAlaGlnAlaProAlaProValProValLeuAlaProGly405410415ProProGlnAlaValAlaProProAlaProLysProThrGlnAlaGly420425430GluGlyThrLeuSerGluAlaLeuLeuGlnLeuGlnPheAspAspGlu435440445AspLeuGlyAlaLeuLeuGlyAsnSerThrAspProAlaValPheThr450455460AspLeuAlaSerValAspAsnSerGluPheGlnGlnLeuLeuAsnGln465470475480GlyIleProValAlaProHisThrThrGluProMetLeuMetGluTyr485490495ProGluAlaIleThrArgLeuValThrGlyAlaGlnArgProProAsp500505510ProAlaProAlaProLeuGlyAlaProGlyLeuProAsnGlyLeuLeu515520525SerGlyAspGluAspPheSerSerIleAlaAspMetAspPheSerAla530535540LeuLeuSerGlnIleSerSer545550<210>2<211>548<212>PRT<213>人類(Homosapiens)<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(548)<223>人NF-KBp65亞基同種型2<400>2MetAspGluLeuPheProLeuIlePheProAlaGluProAlaGlnAla151015SerGlyProTyrValGluIleIleGluGlnProLysGlnArgGlyMet202530ArgPheArgTyrLysCysGluGlyArgSerAlaGlySerIleProGly354045GluArgSerThrAspThrThrLysThrHisProThrIleLysIleAsn505560GlyTyrThrGlyProGlyThrValArgIleSerLeuValThrLysAsp65707580ProProHisArgProHisProHisGluLeuValGlyLysAspCysArg859095AspGlyPheTyrGluAlaGluLeuCysProAspArgCysIleHisSer100105110PheGlnAsnLeuGlyIleGlnCysValLysLysArgAspLeuGluGln115120125AlaIleSerGlnArgIleGlnThrAsnAsnAsnProPheGlnGluGlu130135140GlnArgGlyAspTyrAspLeuAsnAlaValArgLeuCysPheGlnVal145150155160ThrValArgAspProSerGlyArgProLeuArgLeuProProValLeu165170175SerHisProIlePheAspAsnArgAlaProAsnThrAlaGluLeuLys180185190IleCysArgValAsnArgAsnSerGlySerCysLeuGlyGlyAspGlu195200205IlePheLeuLeuCysAspLysValGlnLysGluAspIleGluValTyr210215220PheThrGlyProGlyTrpGluAlaArgGlySerPheSerGlnAlaAsp225230235240ValHisArgGlnValAlaIleValPheArgThrProProTyrAlaAsp245250255ProSerLeuGlnAlaProValArgValSerMetGlnLeuArgArgPro260265270SerAspArgGluLeuSerGluProMetGluPheGlnTyrLeuProAsp275280285ThrAspAspArgHisArgIleGluGluLysArgLysArgThrTyrGlu290295300ThrPheLysSerIleMetLysLysSerProPheSerGlyProThrAsp305310315320ProArgProProProArgArgIleAlaValProSerArgSerSerAla325330335SerValProLysProAlaProGlnProTyrProPheThrSerSerLeu340345350SerThrIleAsnTyrAspGluPheProThrMetValPheProSerGly355360365GlnIleSerGlnAlaSerAlaLeuAlaProAlaProProGlnValLeu370375380ProGlnAlaProAlaProAlaProAlaProAlaMetValSerAlaLeu385390395400AlaGlnAlaProAlaProValProValLeuAlaProGlyProProGln405410415AlaValAlaProProAlaProLysProThrGlnAlaGlyGluGlyThr420425430LeuSerGluAlaLeuLeuGlnLeuGlnPheAspAspGluAspLeuGly435440445AlaLeuLeuGlyAsnSerThrAspProAlaValPheThrAspLeuAla450455460SerValAspAsnSerGluPheGlnGlnLeuLeuAsnGlnGlyIlePro465470475480ValAlaProHisThrThrGluProMetLeuMetGluTyrProGluAla485490495IleThrArgLeuValThrGlyAlaGlnArgProProAspProAlaPro500505510AlaProLeuGlyAlaProGlyLeuProAsnGlyLeuLeuSerGlyAsp515520525GluAspPheSerSerIleAlaAspMetAspPheSerAlaLeuLeuSer530535540GlnIleSerSer545<210>3<211>482<212>PRT<213>人類(Homosapiens)<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(482)<223>人NF-KBp65亞基同種型3<400>3MetAspGluLeuPheProLeuIlePheProAlaGluProAlaGlnAla151015SerGlyProTyrValGluIleIleGluGlnProLysGlnArgGlyMet202530ArgPheArgTyrLysCysGluGlyArgSerAlaGlySerIleProGly354045GluArgSerThrAspThrThrLysThrHisProThrIleLysIleAsn505560GlyTyrThrGlyProGlyThrValArgIleSerLeuValThrLysAsp65707580ProProHisArgProHisProHisGluLeuValGlyLysAspCysArg859095AspGlyPheTyrGluAlaGluLeuCysProAspArgCysIleHisSer100105110PheGlnAsnLeuGlyIleGlnCysValLysLysArgAspLeuGluGln115120125AlaIleSerGlnArgIleGlnThrAsnAsnAsnProPheGlnValPro130135140IleGluGluGlnArgGlyAspTyrAspLeuAsnAlaValArgLeuCys145150155160PheGlnValThrValArgAspProSerGlyArgProLeuArgLeuPro165170175ProValLeuSerHisProIlePheAspAsnArgAlaProAsnThrAla180185190GluLeuLysIleCysArgValAsnArgAsnSerGlySerCysLeuGly195200205GlyAspGluIlePheLeuLeuCysAspLysValGlnLysGluAspIle210215220GluValTyrPheThrGlyProGlyTrpGluAlaArgGlySerPheSer225230235240GlnAlaAspValHisArgGlnValAlaIleValPheArgThrProPro245250255TyrAlaAspProSerLeuGlnAlaProValArgValSerMetGlnLeu260265270ArgArgProSerAspArgGluLeuSerGluProMetGluPheGlnTyr275280285LeuProAspThrAspAspArgHisArgIleGluGluLysArgLysArg290295300ThrTyrGluThrPheLysSerIleMetLysLysSerProPheSerGly305310315320ProThrAspProArgProProProArgArgIleAlaValProSerArg325330335SerSerAlaSerValProLysProAlaProGlyProProGlnAlaVal340345350AlaProProAlaProLysProThrGlnAlaGlyGluGlyThrLeuSer355360365GluAlaLeuLeuGlnLeuGlnPheAspAspGluAspLeuGlyAlaLeu370375380LeuGlyAsnSerThrAspProAlaValPheThrAspLeuAlaSerVal385390395400AspAsnSerGluPheGlnGlnLeuLeuAsnGlnGlyIleProValAla405410415ProHisThrThrGluProMetLeuMetGluTyrProGluAlaIleThr420425430ArgLeuValThrGlyAlaGlnArgProProAspProAlaProAlaPro435440445LeuGlyAlaProGlyLeuProAsnGlyLeuLeuSerGlyAspGluAsp450455460PheSerSerIleAlaAspMetAspPheSerAlaLeuLeuSerGlnIle465470475480SerSer<210>4<211>448<212>PRT<213>人類(Homosapiens)<220><221>MISC_FEATURE<222>(1)..(448)<223>人NF-KBp65亞基同種型4<400>4MetAspGluLeuPheProLeuIlePheProAlaGluProAlaGlnAla151015SerGlyProTyrValGluIleIleGluGlnProLysGlnArgGlyMet202530ArgPheArgTyrLysCysGluGlyArgSerAlaGlySerIleProGly354045GluArgSerThrAspThrThrLysThrHisProThrIleLysIleAsn505560GlyTyrThrGlyProGlyThrValArgIleSerLeuValThrLysAsp65707580ProProHisArgProHisProHisGluLeuValGlyLysAspCysArg859095AspGlyPheTyrGluAlaGluLeuCysProAspArgCysIleHisSer100105110PheGlnAsnLeuGlyIleGlnCysValLysLysArgAspLeuGluGln115120125AlaIleSerGlnArgIleGlnThrAsnAsnAsnProPheGlnValPro130135140IleGluGluGlnArgGlyAspTyrAspLeuAsnAlaValArgLeuCys145150155160PheGlnValThrValArgAspProSerGlyArgProLeuArgLeuPro165170175ProValLeuSerHisProIlePheAspAsnArgAlaProAsnThrAla180185190GluLeuLysIleCysArgValAsnArgAsnSerGlySerCysLeuGly195200205GlyAspGluIlePheLeuLeuCysAspLysValGlnLysGluAspIle2102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