本申請(qǐng)要求2014年3月20日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/968,297的優(yōu)先權(quán)，該文通過引用納入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及糖化蛋白質(zhì)試驗(yàn)。

發(fā)明背景

提供以下說明僅僅輔助閱讀者理解，并且并不承認(rèn)本文公開或參考的任意信息構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

對(duì)糖尿病患者中血糖濃度的控制已經(jīng)顯示降低疾病的長(zhǎng)期微血管和神經(jīng)并發(fā)癥的頻率和嚴(yán)重程度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖化血紅蛋白形成的速率與血液中的葡萄糖濃度直接相關(guān)。結(jié)果，在對(duì)葡萄糖水平的監(jiān)控中，利用對(duì)糖化血紅蛋白的檢測(cè)來確定血糖濃度在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)已被控制的程度。

一般而言，血紅細(xì)胞的平均壽命是約90-120天。因此，血紅蛋白的糖化百分比的確定與這段時(shí)間期間，并且尤其是在之前的2-3個(gè)月中的平均葡萄糖濃度相關(guān)。因此，糖化血紅蛋白的百分比是這段時(shí)間中血糖控制的指標(biāo)。

血紅蛋白變體，如HbS、HbC、HbD、HbE，可能具有較短的平均壽命和不同的糖化率并且可能對(duì)％HbA1C與平均葡萄糖濃度的相關(guān)性有影響，因此影響HbA1C結(jié)果的臨床價(jià)值。

知曉常見變體是否存在，尤其在篩選環(huán)境中，是評(píng)價(jià)血糖控制時(shí)的重要因素。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葡萄糖粘附于血液中的非血紅蛋白蛋白質(zhì)，例如，豐富蛋白質(zhì)，白蛋白。由于白蛋白的循環(huán)半衰期為約20天，糖化白蛋白的濃度(或比率)是對(duì)之前2-3周中的平均葡萄糖濃度的度量。

一些用于確定糖化蛋白質(zhì)的濃度或百分比的方法已經(jīng)使用與糖化蛋白質(zhì)的糖的1，2順二醇結(jié)合的二羥基硼基化合物來使它們與非糖化蛋白質(zhì)分離。這類方法包括美國(guó)專利號(hào)4,269,605、5,284,777、5,110,745、4,861,728、PCT申請(qǐng)WO 96/03657、和PCT申請(qǐng)WO 9840750中所述的那些方法，其通過引用全文納入本文。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及用于檢測(cè)糖化蛋白質(zhì)，尤其是包括糖化血紅蛋白的試驗(yàn)和相應(yīng)裝置以及試劑。如一般理解，這種檢測(cè)可用于控制糖尿病患者的血糖水平，并且用于監(jiān)控前期糖尿病(pre-diabetic)個(gè)體。本文描述了提供適用于多種環(huán)境，包括醫(yī)療點(diǎn)環(huán)境中的快速、高精度試驗(yàn)的試驗(yàn)。

本發(fā)明描述了用于對(duì)血紅蛋白A1C(即，糖化血紅蛋白)進(jìn)行精確和準(zhǔn)確定量的試驗(yàn)?zāi)Ｊ健Ａ硗?，在一些?shí)施方式中，這種多重試驗(yàn)將檢測(cè)在測(cè)試的樣品中是否存在常見變體。在一些實(shí)施方式中，試驗(yàn)通過分別測(cè)量血紅蛋白A1C和總血紅蛋白并取得這兩個(gè)結(jié)果的比率提供了血紅蛋白A1C百分比的定量結(jié)果?？啥?、半定量或定性檢測(cè)常見血紅蛋白變體HbS、HbC、HbD和HbE。如本文所述，血紅蛋白變體結(jié)果可合并或分開表達(dá)，從而提供了各種變體的存在或量。這種檢測(cè)可用于篩選糖尿病患者并用于監(jiān)測(cè)糖尿病個(gè)體的狀態(tài)。本文描述了提供適用于多種環(huán)境，包括醫(yī)療點(diǎn)環(huán)境中的快速、高精度試驗(yàn)的試驗(yàn)。

本發(fā)明的第一方面涉及一種確定樣品中糖化蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)的方法。該方法包括使(i)標(biāo)記的特異性結(jié)合成員，其對(duì)總蛋白質(zhì)或?qū)?yīng)于總蛋白質(zhì)(即，糖化或未糖化形式的特定蛋白質(zhì)的總量，例如，糖化或未糖化血紅蛋白的總量)的肽有特異性或?qū)ξ刺腔鞍踪|(zhì)或肽有特異性，和(ii)標(biāo)記的特異性結(jié)合成員，其對(duì)糖化蛋白質(zhì)(例如，血紅蛋白A1c)或肽有特異性，與以下物質(zhì)接觸：

a.含有易于糖化的所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的肽的樣品；和

b.所述蛋白質(zhì)或肽或者所述蛋白質(zhì)或肽的未糖化形式，其中任一者是競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)，并且不來自所述樣品，并且在一些實(shí)施方式中是生物素化的；和/或

c.所述蛋白質(zhì)或肽的糖化形式，其任一者是競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)，并且不來自所述樣品，并且在一些實(shí)施方式中是生物素化的。

該方法然后包括用至少指示糖化蛋白質(zhì)(例如，A1c)水平的第一信號(hào)，和至少指示未糖化蛋白質(zhì)或總蛋白質(zhì)水平(例如，血紅蛋白(糖化和未糖化)和任選的血紅蛋白變體的總量)的第二信號(hào)檢測(cè)多種信號(hào)；并且確定糖化蛋白質(zhì)與未糖化蛋白質(zhì)之間，或糖化蛋白質(zhì)與總蛋白質(zhì)之間的比率，作為所述樣品中糖化的所述蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)的指標(biāo)。在該試驗(yàn)中，在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合條件下進(jìn)行接觸，并且第一信號(hào)和第二信號(hào)是可區(qū)分的，例如，在空間上不同，或以可區(qū)分形式不同的信號(hào)(例如，不同的發(fā)射光波長(zhǎng)和/或不同時(shí)間發(fā)射性質(zhì))。

在一個(gè)方面中，該方法包括提供：

1.對(duì)以下物質(zhì)有特異性的第一標(biāo)記的結(jié)合成員：

a.未糖化蛋白質(zhì)(例如，血紅蛋白)或

b.其(a.的)肽片段，該肽片段特異性指示所述未糖化蛋白質(zhì)；

c.或總(糖化或未糖化)蛋白質(zhì)(例如，糖化和未糖化血紅蛋白)；

d.或其(c.的)肽片段，該肽片段指示總(糖化和未糖化)蛋白。

2.對(duì)蛋白質(zhì)或肽片段(例如，糖化血紅蛋白(HbA1c)或其包含糖化氨基酸的肽)有特異性的第二標(biāo)記特異性結(jié)合成員。

第一和第二結(jié)合成員接觸包含感興趣蛋白質(zhì)的混合物(例如，獲自患者血液樣品的血紅蛋白)。在血紅蛋白樣品中，人一般具有一些量的糖化血紅蛋白和一些量的未糖化血紅蛋白。如本文他處所示，可用內(nèi)肽酶預(yù)處理(感興趣)蛋白質(zhì)以生成所述蛋白質(zhì)的肽片段。在這種情況中，第一和第二結(jié)合成員接觸包含所述肽片段的混合物。

然后可檢測(cè)(i)糖化和(ii)總蛋白質(zhì)和未糖化的相對(duì)量。在比較試驗(yàn)中，結(jié)合成員與蛋白質(zhì)或肽的所得混合物由(1)與蛋白質(zhì)或肽結(jié)合的結(jié)合成員和(2)未結(jié)合的過量結(jié)合成員組成。然后檢測(cè)過量結(jié)合成員的量。未結(jié)合成員的量與混合物中靶蛋白質(zhì)或肽的量呈反比。在一些實(shí)施方式中，對(duì)總血紅蛋白有特異性的標(biāo)記的特異性結(jié)合成員特異性結(jié)合至選白下組的肽：⁸KSAVTALWGKVNV²⁰、¹¹VTALW¹⁵、⁴⁵FGDLSTP⁵¹、⁷⁶AHLDNLKGTFAT⁸⁷、⁴⁹STPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA⁷⁰、和¹²²FTPPVQ¹²⁷。

試驗(yàn)?zāi)Ｊ娇筛鶕?jù)需要改變。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合成員(例如，抗體)連接至固體支持物，其可包括但不限于可任選被檢測(cè)的珠或顆粒。在一些實(shí)施方式中，向結(jié)合成員和來自樣品的蛋白質(zhì)及其肽的混合物中施加側(cè)流以將混合物遷移到用于未結(jié)合的結(jié)合成員的捕獲區(qū)。例如，側(cè)流路徑中的第一捕獲區(qū)可包含被第一結(jié)合成員識(shí)別的肽，從而固定未結(jié)合的第一結(jié)合成員。流路徑中的第二捕獲區(qū)可包含被第二結(jié)合成員識(shí)別的肽以固定第二結(jié)合成員。第一和第二捕獲區(qū)可在流路徑中的相同或不同位置上。

在其他實(shí)施方式中，混合物還可包含對(duì)蛋白質(zhì)(例如，血紅蛋白變體)有特異性的其他結(jié)合成員。例如，混合物還可包含對(duì)HbS有特異性的第三結(jié)合成員和對(duì)HbC有特異性的第四結(jié)合成員。這些結(jié)合成員也可連接至固體支持物并且是任選標(biāo)記的。此外，可使用相應(yīng)結(jié)合成員特異性結(jié)合的肽來將第三和第四結(jié)合成員固定在側(cè)流中。這將允許使用者進(jìn)一步確定樣品是否來自攜帶變體蛋白質(zhì)的供體。

在一些實(shí)施方式中，該方法包括裂解細(xì)胞以釋放蛋白質(zhì)(例如，含有血紅蛋白的血紅細(xì)胞)和/或至少部分使蛋白質(zhì)(例如，血紅蛋白或白蛋白)變性和/或使用內(nèi)肽酶(例如，胃蛋白酶或內(nèi)肽酶GluC(金黃色葡萄球菌(S.aureus))消化釋放蛋白質(zhì)的N-端肽或所述蛋白質(zhì)的相關(guān)多肽。

在具體實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)是人血紅蛋白，例如血紅蛋白A1c。在一些實(shí)施方式中，肽是人血紅蛋白β鏈的N-端肽，例如，長(zhǎng)度為5-14、5-11、5-8、5-7、5、6、7或8個(gè)氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是人血清白蛋白；肽是人血清白蛋白的N-端肽，例如，長(zhǎng)度為4-17、4-16、4-15、4-14、4-10、4-8、6-17、6-16、6-15、6-14、6-10、6-8個(gè)氨基酸殘基的肽。在一些實(shí)施方式中，肽包括人血清白蛋白Lue585、Lys525、Lys199、Lys439或Lys281；使用多種肽，其包括分別包括白蛋白N-端氨基酸、Leu585、Lys525、Lys199、Lys439、和Lys281肽中的至少2、3、4或5個(gè)的肽，包括各種可能的組合。在一些實(shí)施方式中，使用內(nèi)肽酶，例如，胃蛋白酶或內(nèi)肽酶GluC來切割肽(例如，從樣品中的血紅蛋白或白蛋白切下)；肽是多種肽，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同肽。

連接至特異性結(jié)合成員的標(biāo)記物可以是，例如，本質(zhì)上發(fā)熒光、時(shí)間分辨熒光(TRF)、化學(xué)發(fā)光、比色/吸收或電子/氧化還原的標(biāo)記物。如上所述，可在側(cè)流裝置上設(shè)置分離檢測(cè)區(qū)，其中該裝置包括具有針對(duì)血紅蛋白A1C或相應(yīng)肽序列的固定位點(diǎn)和針對(duì)未糖化血紅蛋白或相應(yīng)肽的固定位點(diǎn)的檢測(cè)區(qū)，并且其中在分開的區(qū)中檢測(cè)信號(hào)?？砂ㄆ渌麢z測(cè)區(qū)用于變體檢測(cè)。這可以是針對(duì)全部四種變體的一個(gè)區(qū)或針對(duì)各特定變體的分開的區(qū)。在一些實(shí)施方式中，各特異性結(jié)合成員連接至相同標(biāo)記物的不同拷貝(例如，TRF)并且通過在側(cè)流裝置的不同捕獲區(qū)中捕獲不同結(jié)合成員來分開檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，從標(biāo)記物檢測(cè)到的信號(hào)是磷光。

對(duì)于一些實(shí)施方式，試驗(yàn)試劑組也包括緩沖溶液；該試驗(yàn)試劑組也包括內(nèi)肽酶，例如，胰蛋白酶、胃蛋白酶、內(nèi)肽酶GluC、木瓜蛋白酶，或脯氨酰內(nèi)肽酶。

在某些實(shí)施方式中，第一和第二結(jié)合成員信號(hào)是熒光信號(hào)或時(shí)間分辨熒光(TRF)信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)在側(cè)流試驗(yàn)裝置上進(jìn)行，其中該裝置包括具有用于對(duì)糖化蛋白質(zhì)或肽有特異性的結(jié)合成員的固定位點(diǎn)和用于對(duì)總蛋白質(zhì)或肽(或未糖化蛋白質(zhì)或肽)有特異性的結(jié)合成員的固定位點(diǎn)的檢測(cè)區(qū)，并且其中分開檢測(cè)對(duì)應(yīng)于結(jié)合成員特異性糖化蛋白質(zhì)或肽的信號(hào)和對(duì)應(yīng)于對(duì)總蛋白質(zhì)或肽(或未糖化蛋白質(zhì)或肽)的信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，試驗(yàn)裝置如說明的那樣并且用于對(duì)糖化蛋白質(zhì)或肽有特異性的結(jié)合成員的固定位點(diǎn)和用于對(duì)未糖化蛋白質(zhì)或肽有特異性的結(jié)合成員的固定位點(diǎn)在物理上是分離的。在一些實(shí)施方式中，試驗(yàn)裝置如上述說明并且用于糖化蛋白質(zhì)或肽的固定位點(diǎn)和用于總蛋白質(zhì)或肽(或未糖化蛋白質(zhì)或肽)的固定位點(diǎn)是相同的，并且第一和第二信號(hào)是不同的，并由此分開檢測(cè)。

在具體實(shí)施方式中，第一和第二信號(hào)來自發(fā)光氧通道試驗(yàn)(LOCI)標(biāo)記物，其包括供體和受體標(biāo)記物。

在使用LOCI的一些實(shí)施方式中，用供體LOCI標(biāo)記物固定或連接總蛋白質(zhì)或肽(或蛋白質(zhì)或肽的未糖化形式)和肽的糖化形式，并且對(duì)總蛋白質(zhì)或肽(或未糖化蛋白質(zhì)或肽)有特異性的特異性結(jié)合成員和對(duì)糖化蛋白質(zhì)或肽有特異性的特異性結(jié)合成員用受體LOCI標(biāo)記物連接，例如，其中供體LOCI標(biāo)記物是或包括珠(其可經(jīng)被覆)，其包括多個(gè)供體LOCI標(biāo)記物分子，并且多種蛋白質(zhì)或肽固定在珠表面上(例如，與珠的共價(jià)連接或者特異性結(jié)合如生物素/鏈霉親和素結(jié)合)。

在使用LOCI的其他實(shí)施方式中，用受體LOCI標(biāo)記物固定總蛋白質(zhì)或?qū)?yīng)于總蛋白質(zhì)的肽(或肽的未糖化形式)和肽的糖化形式，并且對(duì)總蛋白質(zhì)或肽(或未糖化蛋白質(zhì)或肽)有特異性的特異性結(jié)合成員，和對(duì)糖化蛋白質(zhì)或肽有特異性的特異性結(jié)合成員用供體LOCI標(biāo)記物連接。

在使用LOCI的具體實(shí)施方式中，該試驗(yàn)以均相試驗(yàn)進(jìn)行或者使用細(xì)顆粒(或交換免疫試驗(yàn))試驗(yàn)的均勻懸浮液來進(jìn)行該試驗(yàn)。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)于在試驗(yàn)系統(tǒng)的有效范圍內(nèi)的樣品水平的計(jì)算的糖化蛋白質(zhì)或肽(例如，HbA1c)的變異系數(shù)低于3.0、2.7、2.5、2.3、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、或1.2％，基于最少20次重復(fù)測(cè)量。

一個(gè)相關(guān)的方面涉及用于LOCI試驗(yàn)的試劑組，包括在糖化位點(diǎn)糖化的具體蛋白質(zhì)的糖化形式或由其衍生的糖化肽；標(biāo)記的特異性結(jié)合試劑，其包括對(duì)具體蛋白質(zhì)的糖化形式有特異性或?qū)τ善溲苌呐c第一供體和受體LOCI標(biāo)記物對(duì)連接的糖化肽有特異性的特異性結(jié)合試劑；標(biāo)記的特異性結(jié)合試劑，其包括對(duì)具體蛋白質(zhì)的未糖化形式有特異性或?qū)τ善溲苌呐c第二供體和受體LOCI標(biāo)記物對(duì)連接的未糖化肽有特異性的特異性結(jié)合試劑；和第一供體和受體LOCI標(biāo)記物對(duì)的第二成員，其連接或可連接具體蛋白質(zhì)的糖化形式或由其衍生的糖化肽；和第二供體和受體LOCI標(biāo)記物對(duì)的第二成員，其連接或可連接具體蛋白質(zhì)的未糖化形式或由其衍生的未糖化肽。第一和第二供體和受體LOCI標(biāo)記物對(duì)可以是相同或不同的。

在一些實(shí)施方式中，LOCI供體標(biāo)記物連接或可連接未糖化蛋白質(zhì)或肽和所述蛋白質(zhì)或肽的糖化形式，例如，其中LOCI供體標(biāo)記物包括具有多種固定的蛋白質(zhì)或肽的珠，或多種用于蛋白質(zhì)或肽的特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。

在某些實(shí)施方式中，試劑組或其組分在試驗(yàn)裝置中；試劑組的組分與含有具體蛋白質(zhì)的樣品結(jié)合，其可在體內(nèi)糖化或者是包含糖化位點(diǎn)的由其衍生的肽。

對(duì)于一些實(shí)施方式，試驗(yàn)試劑組也包括緩沖溶液；該試驗(yàn)試劑組也包括內(nèi)肽酶，例如，胰蛋白酶、胃蛋白酶、內(nèi)肽酶GLuC、木瓜蛋白酶或脯氨酰內(nèi)肽酶。

在一些實(shí)施方式中，具體蛋白質(zhì)是人免疫球蛋白；試驗(yàn)試劑組包括Hb A1c肽；該試劑組包括人免疫球蛋白β鏈的N-端肽，例如，長(zhǎng)度為5-14、5-11、5-8、5-7、5、6、7、或8個(gè)氨基酸殘基；具體蛋白質(zhì)是人血清白蛋白；試劑組中的肽是人血清白蛋白的N-端肽，例如，長(zhǎng)度為4-17、4-16、4-15、4-14、4-10、4-8、6-17、6-16、6-15、6-14、6-10、6-8個(gè)氨基酸殘基的肽；試劑組中的肽包括人血清白蛋白Lue585、Lys525、Lys199、Lys439、或Lys281；試劑組包括多種肽；試劑組包括多種肽，其分別包括白蛋白N-端氨基酸、Leu585、Lys525、Lys199、Lys439、和Lys281肽中的至少2、3、4或5個(gè)，包括各種可能的組合；試劑盒包括第一方面說明或如本發(fā)明的他處所說明的一種或多種試劑。

在一些方面中，提供了側(cè)流裝置(例如，如本文所述)。在一些實(shí)施方式中，側(cè)流裝置包括流體連通的以下順序：取樣區(qū)域；內(nèi)肽酶區(qū)域(包含本文所述的內(nèi)肽酶的區(qū)域)；任選地，中和區(qū)域(例如，包含用于中和來自酸性內(nèi)肽酶區(qū)域的溶液的試劑，如果需要，或任選包含結(jié)合或滅活內(nèi)肽酶的試劑的區(qū)域)；一個(gè)或多個(gè)試劑混合區(qū)域；一個(gè)或多個(gè)側(cè)流條；和吸收墊。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)試劑混合區(qū)域包含；(i)標(biāo)記的特異性結(jié)合成員，其對(duì)總蛋白質(zhì)或?qū)?yīng)于總蛋白質(zhì)的肽或未糖化蛋白質(zhì)或肽有特異性，(ii)標(biāo)記的特異性結(jié)合成員，其對(duì)糖化蛋白質(zhì)或肽有特異性，和(iii)所述蛋白質(zhì)或肽的非樣品衍生的糖化形式。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)是人免疫球蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述糖化蛋白質(zhì)是HbA1C。在一些實(shí)施方式中，對(duì)總蛋白質(zhì)有特異性的標(biāo)記的特異性結(jié)合成員特異性結(jié)合至選自下組的肽：⁸KSAVTALWGKVNV²⁰、¹¹VTALW¹⁵、⁴⁵FGDLSTP⁵¹、⁷⁶AHLDNLKGTFAT⁸⁷、⁴⁹STPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA⁷⁰、和¹²²FTPPVQ¹²⁷。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)或肽的非樣品衍生的糖化形式是生物素化的并且一個(gè)或多個(gè)側(cè)流條中的至少一個(gè)包含含有鏈霉親和素的固定區(qū)。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)側(cè)流條中的至少一個(gè)包含以下的分開的固定區(qū)：包含總蛋白質(zhì)或?qū)?yīng)于總蛋白質(zhì)的肽的固定區(qū)；包含糖化蛋白質(zhì)或糖化肽的固定區(qū)。在一些實(shí)施方式中，相同或不同側(cè)流條包含：包括一種或多種蛋白質(zhì)同種型的固定區(qū)。在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)同種型包含HbC、HbD Punjab、HbE或HbS中的至少一種。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)橫向條包含以下的分開的固定區(qū)：包含總蛋白質(zhì)或?qū)?yīng)于總蛋白質(zhì)的肽的固定區(qū)；包含糖化蛋白質(zhì)或糖化肽的固定區(qū)；和包含含有一種或多種蛋白質(zhì)同種型的固定區(qū)的第二側(cè)流條。在一些實(shí)施方式中，糖化蛋白質(zhì)是人蛋白質(zhì)；側(cè)流條包含非人靶標(biāo)；并且試劑混合區(qū)域包含對(duì)照標(biāo)記的結(jié)合成員，其特異性結(jié)合非人靶標(biāo)。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記物是熒光或時(shí)間分辨熒光(TRF)標(biāo)記物。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合成員的標(biāo)記物是相同標(biāo)記物。

其他實(shí)施方式將對(duì)于說明書和權(quán)利要求而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1是比率式A1c試驗(yàn)設(shè)置的示意圖。TRF-官能化的抗-Hb、抗-A1c和參照(對(duì)照標(biāo)記的結(jié)合成員)珠的混合物與胃蛋白酶-消化的血液樣品和生物素化的合成A1c肽混合。反應(yīng)混合物通過毛細(xì)管作用移動(dòng)到用鏈霉親和素(用于A1c檢測(cè))、合成Hb肽(用于Hb檢測(cè))和參照抗體條紋化的硝酸纖維膜中。釋放的Hb和A1c肽競(jìng)爭(zhēng)合適的區(qū)導(dǎo)致信號(hào)隨著肽濃度的增加而降低。參照區(qū)提供信號(hào)來中和流動(dòng)不規(guī)則，膜缺陷，和試劑濃度變化。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可通過將任意分析區(qū)(Hb，A1c)信號(hào)除以參照區(qū)信號(hào)或通過將分析區(qū)信號(hào)互除來獲得分析信號(hào)。

圖2是血紅蛋白變體檢測(cè)試驗(yàn)設(shè)置的示意圖，在這種特定構(gòu)造中被檢測(cè)到的4種變體在本文中稱為“SCDE”。TRF-官能化的抗-HbS、抗-HbC、抗-HbD和抗-HbE珠的混合物與胃蛋白酶消化的血樣混合。反應(yīng)混合物通過毛細(xì)管作用移動(dòng)到用合成SCDE肽偶聯(lián)物條紋化的硝酸纖維素膜中。如果SCDE肽之一存在于樣品中，將會(huì)在合適區(qū)中發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致減少的結(jié)合。通過信號(hào)水平的特定降低來確定各同種型的存在/缺失。

圖3是用于檢測(cè)A1C水平和患者是否攜帶血紅蛋白變體的檢測(cè)試驗(yàn)構(gòu)造的示意圖。稀釋緩沖液儲(chǔ)器提供了與血樣混合的稀釋液。混合物在通道中(例如，通過真空或毛細(xì)管作用)移動(dòng)到含有內(nèi)肽酶的腔室中(顯示為“胃蛋白酶”，其中血液蛋白質(zhì)呈現(xiàn)為肽)。所得的肽混合物移動(dòng)到中和區(qū)域(中和內(nèi)肽酶活性，例如，改變?nèi)芤簆H以滅活酸活化的內(nèi)肽酶，如胃蛋白酶)并且然后在液相中與結(jié)合成員(TRF-官能化的抗-Hb、抗-A1c和參照(對(duì)照標(biāo)記的結(jié)合成員)珠)和競(jìng)爭(zhēng)物A1c(例如，生物素化的合成A1c肽)混合?；旌衔锟扇芜x地被分入(或不分入)不同側(cè)流條，其中之一檢測(cè)血紅蛋白和A1c和參照水平，并且其中之一檢測(cè)可能存在的血紅蛋白變體蛋白質(zhì)。末端的墊吸收來自反應(yīng)的液體，由此抽吸液體穿過條。

圖4提供了對(duì)證明血紅蛋白和A1c的比率式測(cè)量的優(yōu)勢(shì)的數(shù)據(jù)的選擇。不同的圖顯示了各種中和使試驗(yàn)內(nèi)差異減小的優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及檢測(cè)具體糖化蛋白質(zhì)水平的試驗(yàn)方法。這類方法可用于，例如，監(jiān)測(cè)個(gè)體中的血糖平均水平(通常是人，但是方法也可適于其他動(dòng)物，尤其是其他哺乳動(dòng)物)。雖然可使用多種方法來確定在特定時(shí)間點(diǎn)的葡萄糖水平，但還能夠隨時(shí)間監(jiān)測(cè)平均水平。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)，尤其是血紅蛋白和血清白蛋白的糖化水平與對(duì)應(yīng)于體內(nèi)具體蛋白質(zhì)的平均壽命的之前時(shí)間段上的平均葡萄糖水平強(qiáng)相關(guān)。由于血紅蛋白在血液中大約90-120天的壽命，糖化血紅蛋白可用作在之前2-3個(gè)月的平均葡萄糖水平的指標(biāo)，更大的權(quán)重在之前的一個(gè)月，而白蛋白可用作之前1-3周葡萄糖水平的指標(biāo)。由于血紅蛋白變體可能在血液中有不同壽命，其可有助于進(jìn)行試驗(yàn)解釋來說明測(cè)試的患者是否攜帶一種或多種血紅蛋白變體形式。關(guān)于血紅蛋白同種型的量的定量或半定量信息可說明患者對(duì)于具體變體是雜合或純合的，并且臨床醫(yī)師可在評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)考慮。

因此，可使用本發(fā)明的方法，例如，對(duì)糖化血紅蛋白的水平進(jìn)行定量，但也可用于對(duì)糖化非血紅蛋白，例如白蛋白的水平進(jìn)行定量。在大多數(shù)情況中，本發(fā)明的試驗(yàn)設(shè)置成針對(duì)具體感興趣的蛋白質(zhì)，提供糖化蛋白質(zhì)對(duì)未糖化蛋白質(zhì)的相對(duì)量。

以下說明集中在糖化血紅蛋白的確定，但是應(yīng)認(rèn)識(shí)到該方法通過用對(duì)其他所需蛋白質(zhì)有特異性的結(jié)合分子替換對(duì)血紅蛋白有特異性的結(jié)合分子，以及其他相應(yīng)材料并憑經(jīng)驗(yàn)選擇的過程調(diào)節(jié)可應(yīng)用于監(jiān)測(cè)其他糖化蛋白質(zhì)。在試驗(yàn)中，雖然可使用全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或多肽，在許多情況中，可使用短肽，通常長(zhǎng)度為約4-20個(gè)氨基酸殘基。這種肽可使用具有合適切割位點(diǎn)特異性的內(nèi)肽酶從全長(zhǎng)多肽上切下。

在一些方面中，提供用血紅蛋白變體檢測(cè)來對(duì)糖化血紅蛋白百分比(％HbA1C)進(jìn)行確定。在試驗(yàn)中，雖然可使用全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或多肽，在一些情況中，可使用短肽，通常長(zhǎng)度為約4-20個(gè)氨基酸殘基。這種肽可使用具有合適切割位點(diǎn)特異性的內(nèi)肽酶從全長(zhǎng)多肽上切下。肽(多肽片段)的檢測(cè)可改善試驗(yàn)的精度和準(zhǔn)度。

A.血紅蛋白試驗(yàn)構(gòu)造

本文所述的試驗(yàn)?zāi)Ｊ竭m用于各種標(biāo)記物和設(shè)計(jì)的檢測(cè)，包括但不限于：熒光、時(shí)間分辨熒光(TRF)化學(xué)發(fā)光、比色/吸收或電化學(xué)。為了實(shí)現(xiàn)多重結(jié)果(對(duì)一次測(cè)試的多重結(jié)果)，可使用側(cè)流構(gòu)造來進(jìn)行這種試驗(yàn)構(gòu)造，采用分開的未糖化Hb(或總Hb)和糖化Hb(HbA1C)結(jié)合/檢測(cè)區(qū)。

已經(jīng)開發(fā)了兩種糖化血紅蛋白試驗(yàn)的不同構(gòu)造，并且適用于其他糖化蛋白質(zhì)試驗(yàn)。第一種采用發(fā)光標(biāo)記物，如熒光、磷光、或時(shí)間分辨熒光(TRF)標(biāo)記物。這種試驗(yàn)構(gòu)造可以，例如，使用側(cè)流構(gòu)造實(shí)施，通常用分開的Hb和糖化Hb(HbA1C)結(jié)合/檢測(cè)區(qū)，雖然可使用多重化。可通過檢測(cè)磷光來檢測(cè)TRF信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)TRF信號(hào)使得熒光或自熒光最小化。可通過在一個(gè)波長(zhǎng)上(例如，在紫外區(qū))的間歇光激發(fā)并隨后測(cè)量另一波長(zhǎng)上的延遲發(fā)光信號(hào)(通常在可見區(qū))來實(shí)現(xiàn)對(duì)磷光的度量。在這種方式中，具有較長(zhǎng)延遲時(shí)間(一般在毫秒至秒?yún)^(qū)域中的任意處)的磷光可與熒光區(qū)分，熒光具有較短延遲時(shí)間(例如，一般小于1毫秒)。檢測(cè)TRF信號(hào)的實(shí)施例描述于，例如，PCT/GB2012/051645。例如，PCT/GB2012/051645描述了用于測(cè)量樣品的發(fā)光性質(zhì)的設(shè)備，該設(shè)備包含：在控制信號(hào)的控制下，用于發(fā)射輻射以激發(fā)所述樣品的激發(fā)光源；用于生成調(diào)節(jié)所述發(fā)射輻射強(qiáng)度的所述控制信號(hào)的信號(hào)源，所述控制信號(hào)具有第一頻率的第一組分和第二頻率的第二組分，所述第一頻率的周期小于所述發(fā)光性質(zhì)的預(yù)期特征時(shí)間常數(shù)或與其有相同數(shù)量級(jí)，所述第二頻率的周期大于所述發(fā)光性質(zhì)的預(yù)期特征時(shí)間常數(shù)；用于從所述樣品接收由于所述激發(fā)發(fā)出的輻射并用于生成代表所述接收的輻射強(qiáng)度的檢測(cè)信號(hào)的光檢測(cè)器；和用于解調(diào)所述檢測(cè)信號(hào)從而產(chǎn)生代表所述樣品的所述發(fā)光性質(zhì)的信號(hào)的解調(diào)器。

也可使用其它構(gòu)造。其次使用近標(biāo)記物方法，通常發(fā)光氧通道試驗(yàn)(LOCI)，其可使用例如分割的樣品排列或使用多重化來進(jìn)行。各種這些構(gòu)造在下文中詳細(xì)描述。

1.樣品處理

為了確定糖化血紅蛋白的水平，在大多數(shù)情況中，使用(人)血樣。血樣或懸浮細(xì)胞與血紅細(xì)胞裂解試劑(例如，合適的裂解去污劑或去污劑組合)接觸以從血紅細(xì)胞中釋放血紅蛋白。在許多情況中，在加入試驗(yàn)裝置之前，樣品與血紅細(xì)胞裂解劑接觸，例如，作為樣品預(yù)處理。然而，在試驗(yàn)裝置中可替代性包含裂解劑。多種這類血紅細(xì)胞裂解劑是已知的并且可用于，例如，各種含去污劑的組合物。合適的血紅細(xì)胞裂解劑包括，例如，曲通X-100和Igepal CA-630，并且其他裂解劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可使用。

除了裂解血紅細(xì)胞以外，樣品處理可包括處理以使天然血紅蛋白變性，例如，以解離血紅蛋白四聚體，并且可進(jìn)一步使β鏈變性。例如，在低pH(例如，約pH 4或1-3)下處理血紅蛋白以更好地使β-鏈N-端肽暴露于切割以釋放N-端肽。在胃蛋白酶切割的情況中，這種酸性條件(或甚至更酸性的條件)也適于胃蛋白酶活性。

另外，處理可包括稀釋樣品以提供合適的降低濃度的Hb用于檢測(cè)。選擇稀釋以與待使用的試驗(yàn)的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍相容。

對(duì)于其他蛋白質(zhì)，樣品處理將取決于感興趣蛋白質(zhì)。雖然血紅蛋白是血紅細(xì)胞的內(nèi)部組分，其他糖化蛋白質(zhì)在血液中是胞外的(例如，人血清白蛋白)、包埋或附連至細(xì)胞壁、或在其他類型細(xì)胞中是細(xì)胞內(nèi)的。例如，對(duì)于胞外蛋白質(zhì)，通常需要從樣品中去除細(xì)胞組分，如通過過量或其他細(xì)胞去除方法。類似地，對(duì)于包埋或附連至細(xì)胞膜的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)，通常例如使用合適的去污劑來從膜釋放蛋白質(zhì)。

對(duì)于血紅蛋白，可使多組分蛋白質(zhì)變性和/或使蛋白質(zhì)二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)至少部分變性來使得結(jié)合或切割位點(diǎn)更可及。可易于確定各具體蛋白質(zhì)的這種變性需要，并且可選擇合適的變性劑和/或條件。

2.血紅蛋白肽切割

如上所述，可使用完整蛋白質(zhì)或多肽，或者用蛋白質(zhì)衍生的短肽來進(jìn)行本發(fā)明的試驗(yàn)。雖然可使用完整血紅蛋白進(jìn)行試驗(yàn)(通常經(jīng)變性以解離亞基)，在本發(fā)明的方法中通常采用對(duì)糖化肽片段而非完整蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

血紅蛋白主要在N-端β-鏈纈氨酸殘基上糖化(通常僅在天然四聚體結(jié)構(gòu)中的2個(gè)β-鏈之一上)。因此，樣品處理也可包括切割血紅蛋白以提供包含N-端纈氨酸的肽片段。這可使用合適的肽酶，例如，內(nèi)肽酶，例如，胃蛋白酶或內(nèi)肽酶GluC消化來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)選擇的肽每和消化條件，在一些實(shí)施方式中，所得的N-端β鏈肽的長(zhǎng)度將為約5-11個(gè)殘基。

當(dāng)使用肽用于切割時(shí)，一般溶液是酸性的，例如，約pH 1.1-4.5(通常約1.2-2.0)并且允許切割進(jìn)行憑經(jīng)驗(yàn)確定的合適時(shí)間。對(duì)于胃蛋白酶，合適的消化時(shí)間將為37℃下約0.1至60分鐘，并且在某些實(shí)施方式中為0.3至3.0分鐘。然后可通過將pH升至約pH 8.0來變性來使胃蛋白酶失活。

內(nèi)肽酶可接觸液體或固體形式的樣品。例如，內(nèi)肽酶可配制成凍干或干組合物，其在與液體樣品接觸時(shí)易溶。在內(nèi)肽酶消化之后，所得的溶液可與緩沖液接觸以升高溶液的pH，例如，至約pH 6-8，例如，7.2-7.8，例如7.4。

3.血紅蛋白同種型檢測(cè)

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的方法能夠通過提供以完整蛋白質(zhì)(或完整亞基)對(duì)多種血紅蛋白同種型測(cè)量和多重檢測(cè)或檢測(cè)特征性同種型肽(包含相應(yīng)突變殘基的可區(qū)分肽)帶來顯著優(yōu)勢(shì)。在一些實(shí)施方式中，特征性同種型肽包括相應(yīng)突變殘基：HbC(E6K)、HbS(E6V)、HbE(E26K)、和HbD Punjab(E121Q)。按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)引用血紅蛋白的這些同種型。在沒有進(jìn)一步多態(tài)性鑒定的情況下，本文中引用HbD應(yīng)表示HbD Punjab(HbD Los Angeles)。

最常見的血紅蛋白是HbA(普通成年Hb)，變體同種型HbC、HbD、HbE、和HbS在人群中以各種頻率出現(xiàn)。這些列出的變體同種型均包括β鏈中的突變?？稍诒景l(fā)明的糖化血紅蛋白試驗(yàn)中使用針對(duì)相應(yīng)同種型有良好特異性(或更優(yōu)選具有對(duì)特征性同種型肽有良好特異性)的抗體形成復(fù)合物(例如，用于捕獲和標(biāo)記以形成用于TRF檢測(cè)的可檢測(cè)復(fù)合物)來檢測(cè)感興趣同種型?？稍趩蝹€(gè)多重化區(qū)或不同區(qū)中檢測(cè)不同的同種型。在例如美國(guó)專利號(hào)8,603,828 B2中描述了抗體特異性和血紅蛋白變體?？蛇x擇檢測(cè)總血紅蛋白的單克隆抗體，其結(jié)合至HbA和血紅蛋白變體共有的表位。可選擇特異性檢測(cè)未糖化血紅蛋白的單克隆抗體，其結(jié)合具有未糖化的潛在糖化位點(diǎn)的血紅蛋白肽。用于產(chǎn)生能夠精確檢測(cè)總血紅蛋白的示例性肽包括，例如，⁸KSAVTALWGKVNV²⁰、¹¹VTALW¹⁵、⁴⁵FGDLSTP⁵¹、⁷⁶AHLDNLKGTFAT⁸⁷、⁴⁹STPDAVMGNPKVKAHGKKVLGA⁷⁰、¹²²FTPPVQ¹²⁷。

上述同種型檢測(cè)提供了不受HbF(α2γ2)干擾的檢測(cè)，因?yàn)橄鄳?yīng)的β鏈(β鏈肽)在HbF中不存在并且適當(dāng)?shù)耐N型特異性將不會(huì)結(jié)合HbF蛋白質(zhì)或肽。

還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于釋放A1c肽的胃蛋白酶消化也釋放HbC、HbD Punjab、HbE、和HbS的合適特征性同種型肽。結(jié)果，可在單次胃蛋白酶消化反應(yīng)中進(jìn)行適于HbA1c、HbC、HbD、HbD、和HbS中的任意或全部的單次消化。這可在試驗(yàn)裝置中進(jìn)行，后續(xù)的同種型檢測(cè)基于與特征性同種型肽的特異性結(jié)合。

A1c的消化也從其他同種型中釋放相應(yīng)的N-端肽。結(jié)果，A1c/未糖化肽比率確定將包括比率確定中的其他Hb同種型。

一旦確認(rèn)具體肽酶釋放合適的肽，也可使用其他內(nèi)肽酶。當(dāng)使用這種其他肽酶時(shí)，通常將需要在同時(shí)終止消化反應(yīng)。這種終止可通過使用相應(yīng)抑制劑或適于感興趣內(nèi)肽酶的其他方法來完成。在一些情況中，可能需要通常分開采用兩種或更多種不同的內(nèi)肽酶。

4.側(cè)流HbA1c試驗(yàn)

如上所述，可使用側(cè)流構(gòu)造用未消化的Hb或用一種或多種來自β鏈的肽進(jìn)行試驗(yàn)?？蛇M(jìn)行該方法作為包括確定總Hb和糖化Hb的競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)，從而提供HbA1C對(duì)總Hb的比率(其可表示成百分比)，雖然也可能構(gòu)成非競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)。因此，該試驗(yàn)包括至少2次檢測(cè)：1)確定總Hb(或替代性的未糖化Hb)；和2)確定糖化Hb。因此，在一些情況中，試驗(yàn)確定未糖化Hb和糖化Hb的水平，并且然后總Hb確定為未糖化Hb和糖化Hb之和。當(dāng)用相同類型的試驗(yàn)生成未糖化Hb和糖化Hb值時(shí)，這可具體用于改善精度，使得在一次測(cè)量中出現(xiàn)的不精確被“刪除”或減少其他測(cè)量中的類似錯(cuò)誤，例如，在使用如下的比率時(shí)。

然后可將％HbA1C計(jì)算為：

％HbA1C＝[HbA1C]/([HbA1C+未糖化Hb]x 100

＝[HbA1C]/[總Hb]x 100

這本文的說明聚焦于使用競(jìng)爭(zhēng)肽的競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)。在一些實(shí)施方式中，對(duì)于總Hb確定，從樣品Hb切下的肽(樣品)和未糖化N-端肽競(jìng)爭(zhēng)物(不來自樣品的外源肽，通常合成)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合未糖化Hb肽的標(biāo)記的特異性結(jié)合試劑，例如，抗-Hb肽抗體。在一些實(shí)施方式中，肽包含或由Hb的氨基酸49-70組成，但在任意情況中是包含被未糖化Hb的結(jié)合試劑識(shí)別的表位的全部或部分的肽。結(jié)合試劑可被標(biāo)記、連接至珠或顆粒，或兩者同時(shí)。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合試劑被固定或者可在檢測(cè)區(qū)中捕獲(例如，使用生物素-鏈霉親和素結(jié)合或通過結(jié)合成員與固定肽的特異性結(jié)合)。兩種肽(一種來自樣品且一種是競(jìng)爭(zhēng)肽)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性結(jié)合試劑并且檢測(cè)了樣品肽或競(jìng)爭(zhēng)肽與特異性結(jié)合試劑的結(jié)合量。圖1說明了這一方面。

例如，在一些實(shí)施方式中，內(nèi)肽酶處理并中和的樣品與對(duì)代表總蛋白質(zhì)的肽有特異性的標(biāo)記的特異性結(jié)合成員接觸，并且所得的混合物隨后接觸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性結(jié)合成員的固定的肽。與固定的肽的結(jié)合與樣品中靶肽的量呈反比。檢測(cè)到的信號(hào)與樣品中總Hb水平負(fù)相關(guān)。

類似地，在相同的反應(yīng)中，對(duì)于HbA1C確定，從樣品HbA1C切下的N-端肽(樣品)和糖化N-端肽(不來自樣品，通常合成)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合針對(duì)HbA1C N-端肽的標(biāo)記的特異性結(jié)合試劑(例如，抗體)。在檢測(cè)區(qū)中可固定或可捕獲結(jié)合試劑(例如，使用生物素-鏈霉親和素結(jié)合)。兩種肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至特異性結(jié)合試劑。檢測(cè)到的信號(hào)與樣品中未糖化Hb水平負(fù)相關(guān)。

例如，在一些實(shí)施方式中，內(nèi)肽酶處理并中和的樣品與對(duì)代表糖化Hb(例如，A1c)的肽有特異性的標(biāo)記的特異性結(jié)合成員接觸，并且所得的混合物隨后接觸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性結(jié)合成員的A1c肽。A1c肽可初始或在另一個(gè)實(shí)施方式中固定，A1c肽可經(jīng)生物素化。在后一種情況中，樣品中的A1c與競(jìng)爭(zhēng)A1c肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至結(jié)合成員并且隨后在包含固定的鏈霉親和素的區(qū)中捕獲競(jìng)爭(zhēng)生物素化A1c肽，從而捕獲生物素化的競(jìng)爭(zhēng)物A1c和結(jié)合至生物素化的競(jìng)爭(zhēng)物A1c的任何特異性結(jié)合成員。與固定的肽的結(jié)合與樣品中靶肽的量呈反比。檢測(cè)到的信號(hào)與樣品中A1c水平負(fù)相關(guān)。

未糖化Hb和HbA1c的檢測(cè)區(qū)在試驗(yàn)中不同，其中兩次檢測(cè)使用相同的標(biāo)記物，但是檢測(cè)區(qū)可在試驗(yàn)中相同，其中使用不同的標(biāo)記物，其提供可區(qū)分的信號(hào)。

在Hb變體待檢測(cè)的方面中，樣品可與對(duì)變體有特異性的標(biāo)記的結(jié)合成員(例如，各待檢測(cè)變體的不同特異性結(jié)合成員)接觸并且然后接觸各待檢測(cè)變體的競(jìng)爭(zhēng)肽。如上述試驗(yàn)所述，在一些實(shí)施方式中，可固定各變體的競(jìng)爭(zhēng)肽，并且標(biāo)記的特異性結(jié)合成員與競(jìng)爭(zhēng)肽的結(jié)合與樣品中變體的量呈反比?？稍谙嗤膫?cè)流條中捕獲對(duì)變體有特異性的標(biāo)記的結(jié)合成員，因?yàn)槠渲袡z測(cè)到總和糖化蛋白質(zhì)，或者可在分開的側(cè)流條中檢測(cè)。例如，參見圖2和3。

在一些實(shí)施方式中，混合出現(xiàn)在液相中(例如，在微流體通道中，而不在側(cè)流條或墊中)并且從液相直接遞送到側(cè)流條。這一方面避免了在“干相”中(即在墊或膜中)發(fā)生混合的標(biāo)準(zhǔn)側(cè)流試驗(yàn)中可能出現(xiàn)的一些問題，其中墊和膜之間的連接可能干擾顆粒移動(dòng)，導(dǎo)致一些額外程度的不準(zhǔn)確。

在一些實(shí)施方式中，也可進(jìn)行控制結(jié)合反應(yīng)并且可用于中和來自上述結(jié)合反應(yīng)的信號(hào)。例如，在一些實(shí)施方式中，結(jié)合成員混合物還可包含對(duì)照標(biāo)記的結(jié)合成員，其特異性結(jié)合不太可能在樣品中存在的靶標(biāo)。例如，對(duì)照標(biāo)記的結(jié)合成員(例如，抗體)可具有對(duì)來自不同物種的蛋白質(zhì)的結(jié)合特異性(例如，山羊IgG)。對(duì)照標(biāo)記的結(jié)合成員可經(jīng)過含有其余溶液的側(cè)流，并且然后在包含特異性結(jié)合對(duì)照標(biāo)記的結(jié)合成員的蛋白質(zhì)(例如，抗-山羊IgG)的區(qū)中被捕獲。結(jié)合的量應(yīng)該保持相當(dāng)一致，但將根據(jù)試驗(yàn)中除特異性結(jié)合親和性以外的變量而變化。然后，從對(duì)照生成的信號(hào)可用于中和其他靶信號(hào)，從而減少試驗(yàn)中的變異。

5.LOCI HbA1c試驗(yàn)

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可使用發(fā)光氧通道試驗(yàn)(LOCI)有效設(shè)計(jì)HbA1c試驗(yàn)。有效構(gòu)造是競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)?zāi)Ｊ健Ｔ谠S多情況中，特異性結(jié)合試劑首先接觸切割肽，然后接觸合成肽，但是順序可顛倒或者接觸可以同時(shí)發(fā)生。

因此，在競(jìng)爭(zhēng)性LOCI試驗(yàn)中，組分可包括用LOCI供體或受體標(biāo)記物連接的合成或純化的Hb肽(例如，已結(jié)合至標(biāo)記物或者可結(jié)合至標(biāo)記物，如通過使用鏈霉親和素/生物素對(duì))和相似的合成或純化的A1c肽。還存在抗-Hb肽和抗-HbA1c肽抗體(或其他特異性結(jié)合試劑)，各自連接LOCI供體或受體標(biāo)記物對(duì)的另一個(gè)。

在一些構(gòu)造中，樣品在樣品處理后分開，從而分別在分開的空間或位置上確定Hb肽和HbA1c肽的水平，例如，在分開的溶液體積中。例如，樣品可沉積在分開的孔中，或者可流入分開的流動(dòng)通道中。

作為分割樣品的替代，試驗(yàn)可多重化，例如，通過使用在可區(qū)分的不同波長(zhǎng)下和/或在可區(qū)分不同時(shí)間下發(fā)光的LOCI受體標(biāo)記物。多種這類受體已知并可使用。

在一些實(shí)施方式中，使用A1c肽的基礎(chǔ)試驗(yàn)包括使用未糖化N-端肽和糖化N-端肽。未糖化N-端肽和糖化N-端肽可在分開的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)中使用，或者可用于與多重化結(jié)合的單次結(jié)合反應(yīng)。將描述糖化肽的反應(yīng)；未糖化肽的反應(yīng)是基本相同的，除了其涉及對(duì)未糖化肽有特異性的抗體。在一些實(shí)施方式中，肽與生物素連接，但可替代性地直接與LOCI供體頭部連接。結(jié)合混合物也包括與LOCI受體標(biāo)記物連接的抗-HbA1C肽。(注，其他反應(yīng)將包括抗-HbN-端肽)。這些試劑和含有切割的糖化N-端肽(HbA1C肽)樣品混合在一起，并且允許發(fā)生切割的N-端肽和可連接或已連接LOCI供體標(biāo)記物的肽的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。結(jié)果抗體-受體標(biāo)記物偶聯(lián)物將以對(duì)應(yīng)于其在結(jié)合反應(yīng)混合物中相應(yīng)數(shù)量的相對(duì)比例結(jié)合至切割的肽和可連接或已連接至供體標(biāo)記物的肽。

當(dāng)LOCI供體標(biāo)記物與適于該標(biāo)記物的波長(zhǎng)的光接觸時(shí)，供體標(biāo)記物生成單線態(tài)氧。由于單線態(tài)氧在水性介質(zhì)中壽命非常短，其將僅在如果供體和受體標(biāo)記物之間的距離短時(shí)激發(fā)從受體標(biāo)記物發(fā)出光，即，如果與供體標(biāo)記物連接的肽已結(jié)合至其抗體-受體標(biāo)記物偶聯(lián)物。對(duì)于與來自樣品的肽結(jié)合的抗體-受體標(biāo)記物偶聯(lián)物，沒有發(fā)生光發(fā)射，因?yàn)闆]有緊密連接的LOCI供體標(biāo)記物(即，單線態(tài)氧生成器)。

結(jié)果，當(dāng)用適于從LOCI供體標(biāo)記物生成單線態(tài)氧的波長(zhǎng)的光照射完全的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合混合物時(shí)，發(fā)射的光信號(hào)的強(qiáng)度將與結(jié)合反應(yīng)混合物中切割的肽的濃度負(fù)相關(guān)。因此，切割的N-端肽的濃度越高，所得的信號(hào)將越小，并且相反，切割的N-端肽的濃度越低，所得的信號(hào)將越大。對(duì)應(yīng)于糖化肽的信號(hào)和對(duì)應(yīng)于未糖化肽的信號(hào)與相應(yīng)的相關(guān)肽濃度相關(guān)。然后糖化肽的分?jǐn)?shù)可如下計(jì)算為糖化肽與總肽的比率：

糖化分?jǐn)?shù)＝[gHb]/([gHb+Hb]＝[gHb]/([總Hb]

在一些情況中，使用LOCI的試驗(yàn)提供了高精度，給出了具有小于3.0、2.7、2.5、2.3、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、或1.5％的CV的計(jì)算的HbA1c百分比的結(jié)果，基于最少20個(gè)重復(fù)。

6.HbA1c試驗(yàn)實(shí)施例

已使用側(cè)流模式的TRF標(biāo)記物并使用競(jìng)爭(zhēng)性LOCI來進(jìn)行試驗(yàn)。

胃蛋白酶消化和試驗(yàn)準(zhǔn)備

肽酶消化的條件可顯著變化。胃蛋白酶條件的示例可發(fā)現(xiàn)于Thomas等，Reg.Toxicol Pharmacol 39(2004)87-98。就潛在差異而言，將測(cè)試不同條件下釋放Hb N-端肽，包括以下條件：

1.Hb(A1c和未糖化Hb)稀釋至5mg/mL(3x)。

2.在84mM HCl，35mM NaCl，pH 1.3(模擬胃液-SGF)中制備1mg/ml胃蛋白酶。

3. 100μL的SGF分成12管并加熱至37℃。

4.向6管中加入5μL的總Hb(5mg/mL)，最后一管沒有胃蛋白酶。

5.向另外6管中加入5μL的A1c(5mg/mL)，最后一管沒有胃蛋白酶。

6.在5、10、20、30和60分鐘時(shí)取出Hb和A1c管，用35μL的0.2M NaHCO₃pH11猝滅，并且然后在85℃下加熱10分鐘。

TRF試驗(yàn)實(shí)施例

對(duì)于測(cè)試試驗(yàn)，用SGF進(jìn)行小規(guī)模消化。在這一消化方案中，2μl的消化樣品([Hb]＝180μg/ml)被加至37℃下的149μl SGF(含胃蛋白酶)，pH 1.3中。消化允許進(jìn)行1分鐘，然后通過加入50μl 0.2M NaHCO₃pH11猝滅(也含有5mg/ml的果糖基纈氨酸)，給出最終[Hb]＝1.8μg/ml。

對(duì)于實(shí)際試驗(yàn)，16μl的消化物與2μl的TRF-抗肽抗體(5μg/ml)和2μl生物素化的肽(20μg/ml)混合。

混合物施加到含有鏈霉親和素條的試驗(yàn)條。抗體同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來自消化物的肽和生物素化的肽，但是僅生物素化的肽-Ab復(fù)合物將在鏈霉親和素條處固定(試驗(yàn)條的捕獲區(qū))?？蛇M(jìn)行試驗(yàn)來給出定量的糖化肽結(jié)果，或者可用糖化和未糖化肽同時(shí)進(jìn)行來給出比率(例如，百分比)結(jié)果。當(dāng)同時(shí)測(cè)試糖化和未糖化肽時(shí)，它們可分開進(jìn)行(例如，使用單一樣品或2個(gè)不同條)或用多重化一起進(jìn)行(例如，用在可區(qū)分的不同波長(zhǎng)下發(fā)射的標(biāo)記物和/或用可區(qū)分的不同時(shí)間特征或通過在試驗(yàn)條的不同位置處捕獲)。

比率式測(cè)量和標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果導(dǎo)致降低的試驗(yàn)差異

設(shè)計(jì)了比率式試驗(yàn)，其中保留一條泳道用于A1c競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)，而另一個(gè)包含抗山羊抗體，與抗-A1c Ab修飾混合的山羊抗體修飾的TRF顆粒將與其結(jié)合以形成參照線。用于該試驗(yàn)中的條含有兩條線：鏈霉親和素和抗山羊抗體。通過將抗-A1c-TRF珠與生物素化的A1c肽混合并抑制與鏈霉親和素線上的消化的A1c校準(zhǔn)物的結(jié)合來進(jìn)行A1c試驗(yàn)?？股窖駻b在第二線上條紋化并用作恒定參照。抗-A1c-TRF和山羊-TRF珠混合并且它們的相對(duì)濃度經(jīng)調(diào)節(jié)以給出與零抑制時(shí)大約相等的信號(hào)。

圖4提供了來自上述試驗(yàn)的數(shù)據(jù)。當(dāng)獨(dú)立檢測(cè)總Hb和Ref信號(hào)時(shí)，差異分別為17％和19％CV(圖4，A和B)。將Hb信號(hào)除以參照信號(hào)使CV降至7％(圖4，C和D)。當(dāng)獨(dú)立測(cè)量A1c和Ref信號(hào)時(shí)，差異分別為20％和17％CV。將Hb信號(hào)除以參照信號(hào)使CV降至8％(圖4，E和F)。當(dāng)獨(dú)立測(cè)量A1c和Hb信號(hào)時(shí)，差異分別為20％和19％CV。將Hb信號(hào)除以參照信號(hào)將CV降至6％。

Hb變體(同種型)檢測(cè)

在37℃下在模擬胃液(SGF)中用胃蛋白酶消化已知含有Hb同種型的患者樣品。經(jīng)消化的樣品用試驗(yàn)稀釋液稀釋至總共500倍。向含有4種SCED珠類型的凍干的團(tuán)塊中加入18μl的上述樣品。反應(yīng)混合物在用HbS、HbC、HbD、和HbE肽條紋化的免疫層析膜上跑動(dòng)(圖2)。然后在TRF讀數(shù)儀上直接讀取條。表1顯示了相對(duì)于平均信號(hào)HbAA非同種型陰性對(duì)照在條的各區(qū)上剩余的信號(hào)百分比，證明可通過試驗(yàn)檢測(cè)不同的同種型。

表1

LOCI試驗(yàn)實(shí)施例

進(jìn)行試驗(yàn)為使用Hb A1c肽的LOCI試驗(yàn)，獲得高度精確結(jié)果。在下文中，“受體”是指LOCI受體標(biāo)記物，并且“供體”是指LOCI供體標(biāo)記物。LOCI試驗(yàn)實(shí)施例使用與TRF實(shí)施例相同的消化。為了進(jìn)行試驗(yàn)，將14μl的消化物與2μl的200μg/ml的受體-抗肽抗體復(fù)合物溶液、2μl的2μg/ml的生物素化肽溶液、和2μl的鏈霉親和素-供體偶聯(lián)物混合?；旌衔镌诤诎抵斜３?小時(shí)，然后讀取信號(hào)。對(duì)于TRF實(shí)施例，可運(yùn)行糖化肽和未糖化肽的試驗(yàn)，從而信號(hào)在分開的位置上，或者信號(hào)可經(jīng)多重化。

7.替代性試驗(yàn)構(gòu)造

除了所述的一般試驗(yàn)構(gòu)造以外，可以其他方式構(gòu)造本發(fā)明試驗(yàn)中的一些。

在一些方面中，再次用HbA1C說明構(gòu)造，雖然構(gòu)造也可應(yīng)用于其他糖化蛋白質(zhì)，可使用針對(duì)感興趣肽，例如，來自患者樣品的HbA1C肽，和合成競(jìng)爭(zhēng)性A1c肽的第一抗體來進(jìn)行側(cè)流或LOCI模式中的試驗(yàn)。對(duì)于側(cè)流，合成A1c肽固定或者游離但可固定在試驗(yàn)條的第一位置上(例如，使用鏈霉親和素-生物素對(duì)，例如，其中合成A1c肽連接至生物素并且可通過結(jié)合至鏈霉親和素固定在位置上)。結(jié)果，合成A1c肽結(jié)合第一抗體并且固定或可固定在第一位置上。因此，對(duì)于合成A1c肽和來自患者樣品的切割的A1c肽之間的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，不與來自患者樣品的切割的肽結(jié)合的抗-肽抗體標(biāo)記的偶聯(lián)物將結(jié)合固定或可固定的合成A1c肽。用合成肽固定的標(biāo)記物提供了與樣品中A1c肽的濃度負(fù)相關(guān)的信號(hào)。與來自患者樣品的切割的肽結(jié)合的抗體-標(biāo)記物偶聯(lián)物將不會(huì)在第一位置上結(jié)合，因?yàn)槠洳缓Y(jié)合部分(如生物素)。

在一些實(shí)施方式中，也提供了針對(duì)HbA1C有特異性的第二抗體。在該實(shí)施方式中，第二抗體，與結(jié)合的來自患者樣品的切割的肽將在第二位置上結(jié)合。如果第二抗體的濃度經(jīng)滴定，使得基本所有的第二抗體與來自患者樣品的切割的肽結(jié)合，則第二位置上的信號(hào)將與樣品中切割的肽的濃度相關(guān)，其因此與原始樣品中HbA1C的濃度相關(guān)。在這種模式中，第二位置的作用是對(duì)第一位置上的信號(hào)和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的檢查。

另一種替代性方案包括使用抗糖化肽抗體和針對(duì)全蛋白的抗體或針對(duì)與全蛋白相關(guān)的肽的抗體。還包括消化蛋白質(zhì)以釋放具體糖化肽，例如，N-端肽。如果使用針對(duì)全蛋白的抗體，在一些實(shí)施方式中，消化僅是部分的，而保留被抗-蛋白質(zhì)抗體識(shí)別的關(guān)鍵表位結(jié)構(gòu)。如果使用額外消化，針對(duì)與總蛋白質(zhì)相關(guān)的第二肽的抗體是合適的。對(duì)于側(cè)流模式，向條施加含有切割的糖化肽和部分消化的蛋白質(zhì)(或其他與總蛋白質(zhì)相關(guān)的肽)的消化溶液，其在第一位置上有固定的合成肽(或鏈霉親和素或其他結(jié)合成員用于固定合成肽)。來自患者樣品的切割的糖化肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合可固定(例如，使用鏈霉親和素/生物素對(duì))或固定的合成肽。結(jié)果，在第一位置上的結(jié)合產(chǎn)生與樣品中切割的肽的濃度負(fù)相關(guān)的信號(hào)。第二位置含有針對(duì)抗體-蛋白質(zhì)(或抗體-第二肽)偶聯(lián)物的固定試劑。

也可針對(duì)包括糖化肽和總蛋白質(zhì)或與總蛋白質(zhì)相關(guān)的肽的雙重確定設(shè)計(jì)使用LOCI的試驗(yàn)(用于具體蛋白質(zhì))。在這類試驗(yàn)中，組分包括與合成糖化肽連接或可與之連接的LOCI標(biāo)記物對(duì)之一和與針對(duì)肽的抗體連接的LOCI標(biāo)記物對(duì)的另一個(gè)。切割的肽與合成肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合標(biāo)記的抗體。如前所述，信號(hào)與切割的(樣品)肽濃度負(fù)相關(guān)。對(duì)糖化肽的檢測(cè)與對(duì)蛋白質(zhì)或與總蛋白質(zhì)相關(guān)的肽的檢測(cè)成對(duì)?？稍诜珠_的體積上或在用多重化提供可區(qū)分信號(hào)的單體積中進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

B.白蛋白試驗(yàn)構(gòu)造

經(jīng)過體內(nèi)非酶促糖化的另一種蛋白質(zhì)是人血清白蛋白，其血清半衰期為約20天。已經(jīng)提出了確定白蛋白的糖化水平作為可用于糖尿病管理的度量。

雖然針對(duì)血紅蛋白A1c試驗(yàn)描述的不同構(gòu)造可用于糖化白蛋白，LOCI方法有益于該應(yīng)用。如前所述，該方法使用LOCI，并且可例如使用分割的樣品排列或使用多重化來進(jìn)行。已經(jīng)報(bào)告了白蛋白在自然上主要在4個(gè)位點(diǎn)上糖化，主要是N-端。

可構(gòu)造試驗(yàn)來采用天然糖化位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)，并且可采用完整白蛋白或具有天然糖化位點(diǎn)的肽片段，例如，糖化可及的賴氨酸殘基。在一些情況中，選擇的糖化位點(diǎn)將包括N-端和/或Lys525、Lys199、Lys439和Lys281中的一個(gè)或多個(gè)。如上所述，可選擇并使用一種或多種肽，其包括這些糖化位點(diǎn)和/或其他中的一個(gè)或多個(gè)。其他糖化位點(diǎn)包括，例如，可及的精氨酸殘基和其他可及的賴氨酸殘基?？纱_定在一個(gè)或多個(gè)殘基處糖化的白蛋白的分?jǐn)?shù)代替確定糖化絕對(duì)水平。使用糖化分?jǐn)?shù)有助于消除一些差異來源，包括許多患者間和樣品處理差異。

各種糖化位點(diǎn)可以不同比率糖化并因此可糖化至不同程度，該程度取決于平均血糖濃度。因此，可組合使用多個(gè)糖化位點(diǎn)以確定糖化模式和/或糖化程度。與單糖化位點(diǎn)分析相似，可確定各位點(diǎn)的糖化率。即，確定各位點(diǎn)上糖化殘基與未糖化殘基的比率。在低血糖水平上，只有更易感的一個(gè)或多個(gè)殘基將被糖化，例如，5-端殘基。在較高血糖水平下，越來越大比例的更易感殘基將被糖化，并且中等易感殘基將開始被糖化。在更高的血糖水平下，最易感殘基將被糖化至更大的程度，越來越大分?jǐn)?shù)的中等易感殘基將被糖化，并且弱易感殘基將開始被糖化。因此，可使用一組經(jīng)過糖化的殘基各自的糖化模式和/或程度來提供對(duì)平均血糖水平的驗(yàn)證和/或附加信息。這可用于，例如，監(jiān)測(cè)不同醫(yī)藥或生活方式介入策略對(duì)患者的功效和/或風(fēng)險(xiǎn)。

C.試驗(yàn)準(zhǔn)確度控制

樣品處理可包括稀釋樣品以提供合適的降低濃度的分析物用于檢測(cè)。在一些實(shí)施方式中，選擇稀釋以與待使用的試驗(yàn)的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍相容。采用提供至少4、4.5或5個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)信號(hào)范圍，或甚至更大范圍的試驗(yàn)是有幫助的。

更一般地，通過在寬的動(dòng)態(tài)范圍檢測(cè)系統(tǒng)中使用合適的樣品稀釋、標(biāo)記物加載、和用合適標(biāo)記物構(gòu)建檢測(cè)區(qū)，相關(guān)(例如，臨床相關(guān))分析物濃度范圍可在可檢測(cè)信號(hào)動(dòng)態(tài)范圍上擴(kuò)展，產(chǎn)生增強(qiáng)的臨床準(zhǔn)確性?？色@得這種優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵诖蠓秶?，由于試?yàn)和檢測(cè)系統(tǒng)的不精確是相對(duì)恒定的。因此，在這樣做的時(shí)候，需要避免信號(hào)-濃度曲線上系統(tǒng)噪音變得明顯更高的區(qū)?？稍谠S多試驗(yàn)應(yīng)用中使用這種方法，例如，在濃度范圍的相關(guān)數(shù)量級(jí)明顯小于檢測(cè)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍的情況下。因此，例如，如果相關(guān)濃度范圍在1或2個(gè)數(shù)量級(jí)上延伸，同時(shí)系統(tǒng)的信號(hào)動(dòng)態(tài)范圍是5個(gè)數(shù)量級(jí)，則對(duì)應(yīng)于1或2個(gè)數(shù)量級(jí)的信號(hào)可在5個(gè)數(shù)量級(jí)的信號(hào)范圍上延伸。

可通過調(diào)節(jié)多個(gè)不同參數(shù)中的任一個(gè)來調(diào)節(jié)信號(hào)-濃度曲線斜率。在許多情況中，調(diào)節(jié)信號(hào)-濃度的斜率和位置，使得對(duì)應(yīng)于感興趣的最高濃度的信號(hào)將在檢測(cè)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍的頂部處或其附近(對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)型試驗(yàn)，這將通常是相反的)。通過這種方式，系統(tǒng)的全動(dòng)態(tài)范圍可被利用或至少移動(dòng)對(duì)應(yīng)于感興趣分析物濃度范圍的細(xì)胞范圍遠(yuǎn)離低信號(hào)區(qū)域。這樣的結(jié)果是降低了固有系統(tǒng)噪音的相對(duì)影響。

可以多種方式調(diào)節(jié)高信號(hào)點(diǎn)。這些包括，例如，樣品稀釋度和/或樣品尺寸，其調(diào)節(jié)樣品中分析物的量并因此將標(biāo)記樣品的量用于檢測(cè)(假定試驗(yàn)系統(tǒng)不被分析物過載)。

或者或量外，可調(diào)節(jié)每種分析物的信號(hào)，例如，通過選擇可檢測(cè)標(biāo)記物(即，區(qū)分每種標(biāo)記物部分的信號(hào)強(qiáng)度)、信號(hào)放大、調(diào)節(jié)捕獲位點(diǎn)數(shù)量、和/或調(diào)節(jié)每種分析物的信號(hào)生成部分的數(shù)量。

定義

“總蛋白質(zhì)”是指樣品中具體蛋白質(zhì)(例如，血紅蛋白)的總量，如論該蛋白質(zhì)被糖化與否。“對(duì)應(yīng)于總蛋白質(zhì)的肽”是指感興趣蛋白質(zhì)(例如，血紅蛋白)的肽部分，其在檢測(cè)時(shí)表示樣品中蛋白質(zhì)的量。這種肽將一般是不包含用于蛋白質(zhì)的糖化的潛在位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的部分。

本文所用術(shù)語“試驗(yàn)裝置”(也稱為“試驗(yàn)筒”或簡(jiǎn)稱“筒”)是指用于進(jìn)行試驗(yàn)的裝置，其在裝置上和/或裝置中包括用于施加樣品、反應(yīng)和信號(hào)讀取的位置。在許多但非全部試驗(yàn)裝置中，將有固定分析物的定位區(qū)，例如，在大多數(shù)側(cè)流試驗(yàn)裝置中。

以生物或生物化學(xué)試驗(yàn)常用的方式使用術(shù)語“標(biāo)記物”，并且其指以一定方式直接或間接可檢測(cè)的復(fù)合物或分子的部分，該方式提供對(duì)標(biāo)記物是否存在或存在的標(biāo)記物的量的檢測(cè)。示例包括熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光部分、光吸收部分、共振光散射顆粒、酶等，以及特異性結(jié)合部分，如生物素，其可用于連接用于檢測(cè)的另一個(gè)部分。本文所用術(shù)語“可檢測(cè)標(biāo)記物”等于術(shù)語“標(biāo)記物”。指示標(biāo)記物是“直接可檢測(cè)”表示該標(biāo)記物直接參與信號(hào)生成(例如，熒光團(tuán)或具有特征性光吸收、反射或散射性質(zhì)的部分，或放射性部分)。相反，對(duì)于待生成的可檢測(cè)信號(hào)而言，“間接可檢測(cè)”標(biāo)記物需要存在至少一種其他物質(zhì)。間接可檢測(cè)標(biāo)記物的示例包括與底物反應(yīng)產(chǎn)生有色、熒光或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的酶，和與特異性結(jié)合對(duì)的另一個(gè)特異性結(jié)合的特異性結(jié)合部分，從而使信號(hào)生成物質(zhì)或部分與間接標(biāo)記物相關(guān)。

術(shù)語“全包被標(biāo)記物”是指一種結(jié)構(gòu)，通常是顆粒，其含有或包含可檢測(cè)部分并且是下文定義的層狀標(biāo)記物或具有至少一個(gè)蛋白質(zhì)涂層，其基本完全連接至下面的表面(即，“全連接涂層標(biāo)記物”)，例如，連接至顆粒表面。在大多數(shù)情況中，蛋白質(zhì)將通過胺完全連接，例如，使得可及的胺被基本消除。在大多數(shù)情況中，這種全包被標(biāo)記物具有基本完全覆蓋包被顆?；驔]有固相顆粒核心的層狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部的一個(gè)或多個(gè)涂層。

術(shù)語“層狀標(biāo)記物”是指一種結(jié)構(gòu)，同時(shí)是顆粒，其含有或包含可檢測(cè)部分并且具有至少2層的一種或多種聚合材料。在許多情況中，層之間有共價(jià)連接。在許多情況中，層將是親水性的。層狀標(biāo)記物將具有核心顆粒，例如，聚苯乙烯顆粒，或可在沒有核心的情況下形成。可檢測(cè)部分，例如，可被層覆蓋，和/或可在層內(nèi)或?qū)娱g分布。對(duì)于具有核心顆粒和被層覆蓋的可檢測(cè)部分的層狀標(biāo)記物，可檢測(cè)部分可包埋在核心顆粒中和/或核心顆粒的表面上。

術(shù)語“分段標(biāo)記物”是指一種結(jié)構(gòu)，通常是顆粒，其是用共價(jià)連接的蛋白質(zhì)涂覆的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)以基本消除蛋白質(zhì)中至少一種類型的官能團(tuán)的方式連接。

然后，例如，通過消除二硫鍵在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生其他官能團(tuán)。這種結(jié)構(gòu)，例如，顆粒，含有或包含可檢測(cè)部分。蛋白質(zhì)涂層具有一個(gè)或多個(gè)通過-SH基團(tuán)連接的其他部分，其通過二硫鍵還原或通過從這種還原的二硫鍵衍生的官能團(tuán)產(chǎn)生。這種其他部分可以是多種類型，例如，特異性結(jié)合對(duì)的成員(例如，抗原-抗體對(duì)的抗原，或鏈霉親和素對(duì)的生物素)、可檢測(cè)部分、或其他涂層物質(zhì)，其可以是相同或不同的蛋白質(zhì)或不同類型，例如，多糖或合成聚合物。

本文所用術(shù)語“側(cè)流試驗(yàn)”和“條試驗(yàn)”等價(jià)指代試驗(yàn)?zāi)Ｊ?，通常是免疫試?yàn)，其中測(cè)試樣品通過毛細(xì)管作用從樣品施加區(qū)沿著固相基材(通常是膜，如硝酸纖維素，其可粘附至試驗(yàn)中使用的液體不可滲透的背襯材料)流動(dòng)到流體接收器中。樣品通常遇到檢測(cè)試劑(通常在樣品施加區(qū)下游的試劑墊中干燥；通常是有色試劑)，其與樣品混合并且通過遇到一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)用合適的特異性結(jié)合部分(一般是抗體或抗原)預(yù)處理的線或區(qū)的固相基材。

根據(jù)樣品中存在的分析物，檢測(cè)試劑可在測(cè)試線或區(qū)處結(jié)合。在通過檢測(cè)線或區(qū)之后，流體進(jìn)入流體接收器中(通常是吸收性材料)。

術(shù)語“分析物”在本文中以體外生物試驗(yàn)的通常方式使用，是指物質(zhì)，例如離子、分子或復(fù)合物，其在試驗(yàn)中被檢測(cè)和/或定量或至少旨在被檢測(cè)和/或定量。

本文所用術(shù)語“分析物-特異性結(jié)合試劑”和“分析物-結(jié)合劑”是指特異性結(jié)合所需分析物的復(fù)合物或分子，并且還可包括具有其他功能的部分，如標(biāo)記分子或復(fù)合物。在一些但不是所有實(shí)施方式中，分析物-結(jié)合劑在結(jié)合分析物后經(jīng)過可檢測(cè)結(jié)構(gòu)變化(例如，變構(gòu)結(jié)構(gòu)變化)。

術(shù)語“抗體”在本文中以最寬泛的含義使用并且旨在包括完整單克隆抗體和多克隆抗體，及其衍生物、變體、片段和/或其他修飾，至少它們顯示出所需的結(jié)合活性?？贵w包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即包含特異性結(jié)合抗原(與其免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。這些包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈、Fc、Fab、Fab′、和Fab2片段，以及Fab表達(dá)文庫?？贵w分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的任何種類，它們之間的差異在于分子中重鏈的特性。這些也包括亞類，如IgG1、IgG2等。輕鏈可以是κ鏈或λ鏈。本文引用抗體包括引用所有種類、亞類和類型。

抗體可來自多種來源，例如，人、山羊、小鼠、兔、大鼠、綿羊、駝科和鯊魚等。還包括嵌合抗體，例如，對(duì)超過一種來源，例如，小鼠或人序列有特異性的單克隆抗體或其修飾形式。還包括駝科抗體或納米抗體?？贵w也包括多特異性，例如雙特異性(例如，多價(jià)或多聚)抗體及其功能性片段。將理解在本文中每次引用“抗體”或任意類似術(shù)語包括完整抗體，及其任意修飾形式。

與本發(fā)明聯(lián)用的術(shù)語“糖化”和“糖化的”或類似術(shù)語是指非酶促糖基化。

引用“樣品中糖化蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)”和類似術(shù)語表示，對(duì)于具體鑒定的蛋白質(zhì)，糖化蛋白質(zhì)水平與總蛋白質(zhì)水平的比率，或者糖化蛋白質(zhì)與未糖化蛋白質(zhì)的比率?？梢远喾N方式表示這種比率，例如，表示成常規(guī)分?jǐn)?shù)、小數(shù)或百分比。在許多情況中，使用蛋白質(zhì)的肽片段來進(jìn)行對(duì)糖化蛋白質(zhì)、未糖化蛋白質(zhì)、和/或總蛋白質(zhì)水平的確定。

與本發(fā)明的試驗(yàn)相關(guān)的術(shù)語“總蛋白質(zhì)”是指具體蛋白質(zhì)的水平，無論蛋白質(zhì)被糖化與否，并不指樣品中或來自取樣的生物體中所有蛋白質(zhì)的合并水平。

指示蛋白質(zhì)或肽“對(duì)糖化易感”表示該蛋白質(zhì)或肽含有至少一個(gè)可在高血糖條件下在體內(nèi)被糖化的位點(diǎn)或參加，優(yōu)選地血糖在臨床顯著的范圍內(nèi)。這類糖化位點(diǎn)的非限制性示例是血紅蛋白β鏈的N-端氨基酸。在許多情況中，暴露的賴氨酸殘基的胺基側(cè)鏈可在體內(nèi)被糖化。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，引用從樣品蛋白質(zhì)切下的肽(其可被稱為“樣品肽”)和用于與樣品肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的肽(其可被稱為“競(jìng)爭(zhēng)肽”)。對(duì)于具體的樣品肽，競(jìng)爭(zhēng)肽不需要相同(例如，其可以有不同長(zhǎng)度)，但是相反，其在試驗(yàn)關(guān)鍵特性，例如抗體結(jié)合方面性質(zhì)基本相同。例如，從樣品蛋白質(zhì)切下的N-端肽可比相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)肽長(zhǎng)或短，和/或競(jìng)爭(zhēng)肽可經(jīng)生物素化而樣品肽未經(jīng)生物素化，但是兩者基本等價(jià)地結(jié)合相應(yīng)抗體。

對(duì)于具有不同同種型的蛋白質(zhì)或多肽，“特征性同種型肽”是包含對(duì)應(yīng)于具有特定同種型特征性的突變殘基的多肽序列的序列以及對(duì)應(yīng)于在突變殘基的一側(cè)或兩側(cè)上的多肽的其他氨基酸殘基的肽。例如，對(duì)于HbS，特征性HbS同種型肽將包括E6V殘基和在纈氨酸殘基的一側(cè)或兩側(cè)上相鄰的Hb氨基酸序列。該術(shù)語應(yīng)用于從全長(zhǎng)多肽和合成肽消化的肽。

本文中引用蛋白質(zhì)或肽的“未糖化形式”和蛋白質(zhì)或肽的“糖化形式”?！疤腔问健北硎咎腔木唧w蛋白質(zhì)或肽，而“未糖化形式”是指未糖化的，或至少在相關(guān)試驗(yàn)中待檢測(cè)的位點(diǎn)上未糖化的相同蛋白質(zhì)或肽。

在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語“競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合條件”是指其中特異性結(jié)合對(duì)的成員接觸溶液或懸浮液，和其中特異性結(jié)合對(duì)的兩種可區(qū)分成員存在使得它們互相有效競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性結(jié)合對(duì)的關(guān)聯(lián)成員的試驗(yàn)條件。例如，在Hb A1c肽競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中，條件使得來自樣品的N-端肽與固定或可固定的N-端肽有效競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相應(yīng)標(biāo)記的抗體。

說明書中引用的全部專利和其他參考文獻(xiàn)表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平，并且通過引用全文納入本文，包括任意表和圖，就如同各參考文獻(xiàn)單獨(dú)通過引用全文納入本文。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)易于理解本發(fā)明將充分調(diào)整以獲得所述的結(jié)果和優(yōu)勢(shì)，如同本文固有的那些那樣。本文優(yōu)選實(shí)施方式目前所代表的本文所述的方法、變異和組合物是示例性的，并不旨在顯示本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到其中的變化和其他用途，這將包括在由權(quán)利要求的范圍所限定的本發(fā)明的精神內(nèi)。

對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，顯而易見的是，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種取代和修改而不會(huì)偏離本發(fā)明的范圍和精神。例如，對(duì)使用的具體標(biāo)記物可進(jìn)行改變。因此，這種其他實(shí)施方式將在本發(fā)明和以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

在本文中適當(dāng)描述的本發(fā)明可以在本文中未具體揭示的任何元素、限制存在下實(shí)施。因此，例如，在本文的各種情況下，術(shù)語“包含”、“基本由……組成”和“由……組成”可相互替換。本文中已經(jīng)使用的術(shù)語和表達(dá)用作說明而非限制性的術(shù)語，這些術(shù)語和表達(dá)的使用并不排除所顯示和所描述的特征或其部分的任何等同特征或其部分，應(yīng)認(rèn)識(shí)到各種修飾都有可能落入本發(fā)明要求的范圍之內(nèi)。因此，應(yīng)理解盡管本發(fā)明通過優(yōu)選的實(shí)施方式和任選的特征進(jìn)行了具體地公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到本文所揭示的內(nèi)容的改變和變化，這些改變和變化應(yīng)認(rèn)為落在本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。

另外，當(dāng)按照馬庫什群(Markush group)或其他替代群描述本發(fā)明的特征或方面的時(shí)候，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明還可由此按照所述馬庫什群或其他群中的任意單獨(dú)組成部分或子群描述本發(fā)明。

同樣，除非有相反水平，在實(shí)施方式中提供各種數(shù)值或數(shù)值范圍端點(diǎn)的情況下，通過取任意兩個(gè)與范圍端點(diǎn)不同的值，或通過取2個(gè)與其他范圍的端點(diǎn)不同的范圍端點(diǎn)來描述其他實(shí)施方式。這種范圍也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，包括超過一的值的數(shù)值范圍的說明包括對(duì)該范圍內(nèi)各整數(shù)值的具體說明。

因此，其他實(shí)施方式將在本發(fā)明和以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。