本申請涉及包括用于特異性結(jié)合至補體因子B蛋白的抗體和用于特異性結(jié)合至糖類抗原19-9蛋白的抗體的胰腺癌診斷試劑盒，利用其提供用于診斷胰腺癌的信息的方法以及利用其的胰腺癌診斷方法。

背景技術(shù)：

胰腺癌作為世界上發(fā)病率第九高的主要的癌癥，是死亡率第四高的惡性腫瘤(Lowenfels，A.B.等，Best Pract Res Clin Gastroenterol(臨床胃腸病學(xué)最佳實踐與研究)，197-209，2006)。在大多數(shù)國家中，胰腺癌在所有惡性腫瘤發(fā)病中所占的比重不超過2％-3％，但是死亡人數(shù)在所有腫瘤相關(guān)死亡中所占的比重高達6％。這是因為預(yù)后不良的程度為胰腺癌的兩年生存率低至只有10％左右，5年生存率也不超過5％(Lee，C.N.等，Pancreas(胰腺)，94-94，2012)。

由于在大多數(shù)情況下胰腺癌在晚期之前沒有癥狀，因此經(jīng)常一旦診斷出胰腺癌，則已經(jīng)到非常晚期，因而無法進行手術(shù)。此外，即使在能夠進行手術(shù)的情況下，手術(shù)后的患者中的80％-90％的患者因復(fù)發(fā)而死亡。為了治療胰腺癌，除了手術(shù)治療之外，還在進行放射治療、化學(xué)治療等，但是在大多數(shù)情況下對患者的生存期的效果仍有限。因此，在早期診斷胰腺癌是至關(guān)重要的。

作為診斷胰腺癌的方法，目前有使用計算機斷層掃描(Computed Tomography，CT)或磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)的活組織檢查，而且最近，作為能夠診斷胰腺癌的臨床樣品，同時測量諸如血漿的體液中的蛋白分析，以判斷是否存在胰腺癌或發(fā)病可能性。目前，與胰腺癌相關(guān)的最常用的腫瘤標志物是糖類抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)，但是已知CA 19-9在除了胰腺癌以外的包括膽道在內(nèi)的所有消化系統(tǒng)癌的患者的血漿中也會上升，此外已知在患有沒有惡性腫瘤的膽管炎和膽道閉塞的情況下也會上升，因此其特異性低(資料來源：韓國國家健康信息門戶網(wǎng)站)。此外，在早期癌中，CA 19-9標志物的血中濃度經(jīng)常顯示為正常，因此CA 19-9標志物無法用于早期診斷。

此外，補體因子B(Complement factor b，CFB)作為也稱作CFB的蛋白質(zhì)，是補體活化的替代途徑中的重要成分中的一者。替代途徑由病原體細胞表面的糖結(jié)構(gòu)激活，而與抗原-抗體復(fù)合體的形成無關(guān)。首先，血液中少量存在的C3b結(jié)合至微生物的表面，從而誘導(dǎo)活化。若C3b與血液中的補體因子B結(jié)合，則C3b被補體因子D分解為C3bBb和Ba，而丙哌利定使C3bBb穩(wěn)定以使C3bBb成為替代途徑的C3轉(zhuǎn)化酶，并進入制備更多C3b的擴增階段。其結(jié)果是生成更多的C3轉(zhuǎn)化酶，所生成的C3轉(zhuǎn)化酶和C3b結(jié)合至微生物細胞表面，從而形成C3bBb3b復(fù)合體。所形成的C3bBb3b復(fù)合體起到替代路徑的C5轉(zhuǎn)化酶的作用，以將C5分解為C5a和C5b，最終在細菌表面形成MAC(膜攻擊復(fù)合體)。其結(jié)果是，殺死細菌且去除抗原。已知補體因子B是通過與作為該替代路徑的初始步驟的c3b蛋白結(jié)合而對c5的生成起到重要作用的分泌性蛋白，其作為糖蛋白而具有五個糖基化位點(glycan site)。

已知在卵巢癌(Wu.J.等，JPR，4541-52，2012)、上咽癌(Seriramalu，R.等，Electrophoresis(電泳)，2388-95，2010)、乳腺癌(Doustjalali，S.R.等，Electrophoresis(電泳)，2392-401，2004)等各種患者的血清中會分泌補體因子B。然而，到目前為止，沒有嘗試過組合補體因子B和糖類抗原以診斷胰腺癌。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

因此，本申請的目的是提供包括用于特異性結(jié)合至補體因子B蛋白的抗體和用于特異性結(jié)合至糖類抗原19-9蛋白的抗體的胰腺癌診斷試劑盒，利用其提供用于診斷胰腺癌的信息的方法以及利用其的胰腺癌診斷方法，其中，所述補體因子B蛋白是特異性和敏感性優(yōu)異的、用于胰腺癌診斷的新型生物標志物。

技術(shù)方案

本申請?zhí)峁┮认侔┰\斷方法和提供用于診斷胰腺癌的信息的方法，其中，該兩種方法均包括測量從個體分離出的血液樣品內(nèi)的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平。

此外，本申請?zhí)峁┭a體因子B作為胰腺癌診斷標志物的用途。具體地，本申請?zhí)峁┌ㄓ糜谔禺愋越Y(jié)合至補體因子B蛋白的抗體的用于胰腺癌診斷的試劑盒。

在一個實施方式中，補體因子B蛋白可以由序列號1的氨基酸序列形成。

序列號1：

MGSNLSPQLCLMPFILGLLSGGVTTTPWSLARPQGSCSLEGVEIKGGSFRLLQEGQALEYVCPSGFYPYPVQTRTCRSTGSWSTLKTQDQKTVRKAECRAIHCPRPHDFENGEYWPRSPYYNVSDEISFHCYDGYTLRGSANRTCQVNGRWSGQTAICDNGAGYCSNPGIPIGTRKVGSQYRLEDSVTYHCSRGLTLRGSQRRTCQEGGSWSGTEPSCQDSFMYDTPQEVAEAFLSSLTETIEGVDAEDGHGPGEQQKRKIVLDPSGSMNIYLVLDGSDSIGASNFTGAKKCLVNLIEKVASYGVKPRYGLVTYATYPKIWVKVSEADSSNADWVTKQLNEINYEDHKLKSGTNTKKALQAVYSMMSWPDDVPPEGWNRTRHVIILMTDGLHNMGGDPITVIDEIRDLLYIGKDRKNPREDYLDVYVFGVGPLVNQVNINALASKKDNEQHVFKVKDMENLEDVFYQMIDESQSLSLCGMVWEHRKGTDYHKQPWQAKISVIRPSKGHESCMGAVVSEYFVLTAAHCFTVDDKEHSIKVSVGGEKRDLEIEVVLFHPNYNINGKKEAGIPEFYDYDVALIKLKNKLKYGQTIRPICLPCTEGTTRALRLPPTTTCQQQKEELLPAQDIKALFVSEEEKKLTRKEVYIKNGDKKGSCERDAQYAPGYDKVKDISEVVTPRFLCTGGVSPYADPNTCRGDSGGPLIVHKRSRFIQVGVISWGVVDVCKNQKRQKQVPAHARDFHINLFQVLPWLKEKLQDEDLGFL

在一個實施方式中，個體可以是胰腺癌疑似患者。

在一個實施方式中，還可以包括如下步驟：將從個體分離出的血液樣品內(nèi)的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平與正常對照組內(nèi)的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平進行比較。在本說明書中，正常對照組指的是從沒有胰腺癌等疾病的健康的個體分離出的血液樣品。比較兩個胰腺癌樣品后，在胰腺癌疑似患者的樣品的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平高于正常對照組的樣品的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平的情況下，可以將所述疑似患者分類為胰腺癌患者。例如，在胰腺癌疑似患者的樣品的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平高于正常對照組樣品的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平兩倍以上的情況下，可以將所述疑似患者分類為胰腺癌患者。

在一個實施方式中，血液樣品可以是全血樣品、血漿樣品或血清樣品。

在本申請中，術(shù)語“診斷”指的是確認病理狀態(tài)的存在或特征。鑒于本申請的目的，診斷指的是確定胰腺癌是否發(fā)生和復(fù)發(fā)。

在本申請中，術(shù)語“用于診斷的標志物”或“診斷標志物”，作為能夠?qū)┘毎驼＜毎麉^(qū)分并診斷癌細胞的物質(zhì)，包括相比正常細胞在癌細胞中增加或減少的有機生物分子等，該有機生物分子諸如多肽或核酸(例如：mRNA等)、脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白或糖(單糖、二糖、寡糖等)等。鑒于本申請的目的，胰腺癌診斷標志物是相比正常胰腺組織細胞在胰腺癌細胞中示出高水平的特異性表達的CA 19-9和/或補體因子B的基因及由其編碼的蛋白質(zhì)。

在本申請中，術(shù)語“蛋白質(zhì)表達水平測量”作為為了診斷癌癥而在生物學(xué)樣品中確認是否存在由癌標志物基因表達的蛋白質(zhì)和該表達程度的過程，針對所述基因的蛋白質(zhì)利用特異性結(jié)合的抗體確認蛋白質(zhì)的量。作為其分析方法，有蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、放射免疫測定法(Radioimmunoassay，RIA)、放射免疫擴散法(Radioimmunodiffusion)、奧克特洛尼(Ouchterlony)免疫擴散法、火箭免疫電泳、免疫組織染色、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitation Assay)、補體結(jié)合試驗(Complement Fixation Assay)、FACS(熒光激活細胞分選)和蛋白質(zhì)芯片(protein chip)等，但不限于此。

在本申請中，“特異性結(jié)合”指的是相比其他物質(zhì)，對目標物質(zhì)的結(jié)合力優(yōu)異以至于能夠通過結(jié)合而檢測目標物質(zhì)是否存在。

在本申請中，“抗體”指的是能夠特異性結(jié)合至抗原或抗原決定基的、實質(zhì)上由一個或多個免疫球蛋白基因或從其片段衍生或仿效其制備的基因編碼的肽或多肽。在本申請中，抗體包括整個抗體或抗體片段，且包括不限于此的各種形式的抗體結(jié)構(gòu)?？贵w片段包括抗體的整體長度的一部分、抗體的可變區(qū)、或至少包括抗體的抗原結(jié)合部位?？贵w片段的示例包括雙價抗體(diabody)、單鏈抗體分子、以及從抗體片段形成的多特異性抗體。

在一個實施方式中，抗體可以為多克隆抗體或單克隆抗體。針對補體因子B蛋白的抗體可以通過本領(lǐng)域中通常實施的方法來制備，該方法諸如融合方法(Kohler和Milstein，European Journal of Immunology(歐洲免疫學(xué)雜志)，6：511-519(1976))、重組DNA方法(美國專利第4,816,56號)、或噬菌體抗體庫方法(Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)，222：58，1-597(1991))。在Harlow，E.和Lane，D.，Using Antibodies(抗體使用)：A Laboratory Manual(實驗指南)，Cold Spring Harbor Press(冷泉港實驗室出版社)，New York(紐約)，1999；Zola，H.，Monoclonal Antibodies(單克隆抗體)：A Manual of Techniques(技術(shù)指南)，CRC Press，Inc.(CRC出版公司)，Boca Raton(博卡拉頓)，F(xiàn)lorida(佛羅里達)，1984；和Coligan，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(現(xiàn)代免疫學(xué)實驗手冊)，Wiley/Greene，NY(紐約)，1991中詳細公開了針對抗體制備的一般過程。例如，生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細胞的制備通過使永生細胞株與抗體生產(chǎn)淋巴細胞融合來實現(xiàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知在該過程中所需的技術(shù)并可以容易地實施該技術(shù)。通過將補體因子B蛋白質(zhì)抗原注射到合適的動物中，從該動物收集抗血清，然后利用公知的親和技術(shù)，從抗血清分離抗體，以獲得多克隆抗體。

在本申請中，術(shù)語“敏感性”指當(dāng)患有相應(yīng)的疾病時其診斷檢查結(jié)果顯示陽性的概率，“特異性”是指在沒有患任何疾病時檢查結(jié)果為陰性的可能性。

作為用于胰腺癌診斷的標志物的候選物質(zhì)，選擇補體因子B蛋白，確認正常人和胰腺癌患者的血漿中補體因子B蛋白的存在并觀測變化。其結(jié)果是，可以確認到相比正常對照組，在胰腺癌患者的血漿中補體因子B的蛋白表達水平非常高(實施方式1和實施方式2)。此外，當(dāng)與作為現(xiàn)有已知的用于胰腺癌診斷的標志物的CA 19-9比較時，為了驗證CFB作為用于胰腺癌診斷的標志物的效用，執(zhí)行ELISA和受試者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲線分析，基于這些曲線的最佳截止值，分別分析CFB和CA 19-9的敏感性和特異性(實施方式3至實施方式6)。從其結(jié)果可知，除了胰腺癌之外，在肝癌、膽管癌和胃癌中，CA 19-9的表達同樣增加，因此特異性較差。也就是說，這意味著CA 19-9不適合單獨用作胰腺癌診斷標志物。然而，CFB的特異性表達僅在胰腺癌中增加，敏感性和特異性優(yōu)異，這意味著適合用作用于胰腺癌診斷的標志物。

此外，可知，在CA 19-9單獨用作胰腺癌診斷標志物的情況下，具有特異性較差的問題，但是在將CA 19-9和CFB一起使用時，敏感性和特異性最優(yōu)異。這意味著CA 19-9不適合單獨用作用于胰腺癌診斷的標志物，但是在與CFB一起使用的情況下，可以更準確地診斷胰腺癌。

因此，在一個實施方式中，所述試劑盒還可以包括用于特異性結(jié)合至糖類抗原19-9的抗體。

本申請還提供胰腺癌診斷方法和提供用于診斷胰腺癌的信息的方法，其均包括測量從個體分離出的血液樣品內(nèi)的補體因子B和糖類抗原19-9的蛋白質(zhì)表達水平。

在一個實施方式中，個體可以是胰腺癌疑似患者組。

在一個實施方式中，還可以包括如下步驟：將從胰腺癌疑似患者分離出的血液樣品內(nèi)的補體因子B和CA 19-9的蛋白質(zhì)表達水平與正常對照組內(nèi)的補體因子B和CA 19-9的蛋白質(zhì)表達水平進行比較。比較兩個樣品后，在胰腺癌疑似患者的樣品的補體因子B和CA 19-9的蛋白質(zhì)表達水平都高于正常對照組的樣品的補體因子B和CA 19-9的蛋白質(zhì)表達水平的情況下，可以將所述疑似患者分類為胰腺癌患者。例如，在胰腺癌疑似患者的樣品的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平高于正常對照組樣品的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平兩倍以上且胰腺癌疑似患者的樣品的CA 19-9的濃度為37U/ml以上的情況下，可以將胰腺癌疑似患者分類為胰腺癌患者。

在一個實施方式中，血液樣品可以是全血樣品、血漿樣品或血清樣品。

本申請還提供胰腺癌診斷方法，其包括利用用于胰腺癌診斷的生物標志物來測量補體因子B和糖類抗原19-9的蛋白質(zhì)表達水平，該胰腺癌診斷方法包括：

從個體收集血液樣品的第一步驟；

使所述血液樣品接觸用于特異性結(jié)合至生物標志物且被可檢測地標記的抗體，以形成所述抗體和所述生物標記物的復(fù)合體的第二步驟；

對不包括復(fù)合體的被標記的抗體和在所述第二步驟中形成的復(fù)合體進行分離的第三步驟；

對來自包括在所述第二步驟中形成的復(fù)合體的抗體的能夠檢測的標記的信號進行量化，以測量所述血液樣品內(nèi)的生物標志物的量的第四步驟；

將在所述第四步驟中測量的生物標志物的量和對照組的生物標志物的量進行比較的第五步驟；以及

當(dāng)在所述第五步驟中，樣品中的生物標志物的量多于對照組的生物標志物的量時，診斷為胰腺癌的第六步驟。

其中，生物標志物指的是補體因子B和糖類19-9。

在所述第四步驟中，由于來自生物標志物-抗體復(fù)合體的可檢測的標記的信號與血液樣品內(nèi)的生物標志物的量成比例，因此從其可知所述生物標志物的量。

在一個實施方式中，對照組的生物標志物的量是沒有患胰腺癌的個體的血液樣品內(nèi)的生物標志物的量。

在一個實施方式中，血液樣品可以是全血樣品、血漿樣品或血清樣品。

在一個實施方式中，在所述第一步驟和所述第二步驟之間還可以包括如下步驟：通過免疫沉淀使血液樣品內(nèi)的除生物標志物之外的蛋白質(zhì)與生物標志物分離。

在一個實施方式中，使除生物標志物之外的蛋白質(zhì)與生物標志物分離的步驟包括：

i)使從個體分離出的血液樣品與用于特異性結(jié)合至生物標志物的抗體接觸，以在所述抗體和所述生物標志物之間形成復(fù)合體的步驟；

ii)使在所述i)步驟中形成的復(fù)合體沉淀的步驟；

iii)對包括除生物標志物之外的其他蛋白質(zhì)以及沒有形成復(fù)合體的抗體的樣品的上清液和沉淀的復(fù)合體進行分離的步驟。

本發(fā)明還提供胰腺癌治療方法，其包括在根據(jù)上述方法診斷為胰腺癌的情況下，利用胰腺癌治療劑對個體進行處理。胰腺癌治療劑可以利用已知的具有胰腺癌治療效果的藥物，而沒有限制。

有益效果

根據(jù)本申請，可以提供具有提高的敏感性和特異性的用于胰腺癌診斷的標志物。

附圖說明

圖1a示出針對正常人血漿的二維電泳圖像，圖1b示出針對胰腺癌患者的血漿的二維電泳圖像。由箭頭指示的點是指補體因子B蛋白。

圖2示出在正常人血漿和胰腺癌患者的血漿中的補體因子B的表達差異，即示出了圖1a和圖1b的點(黑點)部分的二維垂直電泳圖像。

圖3a示出了通過蛋白質(zhì)印跡法分析正常人血漿和胰腺癌患者血漿的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平的結(jié)果(N：正常人，C：胰腺癌患者)。

圖3b是示出圖3a的蛋白質(zhì)印記條帶的強度的圖。

圖4a示出了通過蛋白質(zhì)印跡法分析正常細胞株(HPDE)和胰腺癌細胞株(HPAC1、BXPC3、PANC1)中的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平的結(jié)果。

圖4b示出了通過RT(逆轉(zhuǎn)錄)-PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))分析正常細胞株(HPDE)和胰腺癌細胞株(HPAC1、BXPC3、PANC1)中的補體因子B的蛋白質(zhì)表達水平的結(jié)果。

圖4c是示出圖1b的譜帶強度的圖。

圖5a是通過蛋白質(zhì)印跡法分析補體因子B(CFB)的蛋白質(zhì)表達水平的結(jié)果。HD表示正常，CP表示胰腺炎，PC表示胰腺癌。

圖5b是示出圖5a的蛋白質(zhì)印記條帶的強度的圖。HD表示正常，CP表示胰腺炎，PC表示胰腺癌。

圖6示出通過ELISA分析在各種癌中CFB和CA 19-9的表達水平的結(jié)果(a：CFB，b：CA 19-9)。HD表示正常，CP表示胰腺炎，PC表示胰腺癌，HCC表示肝癌，CC表示膽管癌，GC表示胃癌。

圖7示出CA 19-9、CFB和CFB+CA 19-9的ROC曲線。

具體實施方式

以下通過實施方式詳細說明本發(fā)明。下列實施方式僅用于例示本申請，本申請的范圍不受限于下列實施方式。

[實施方式1]補體因子B(CFB)的蛋白質(zhì)表達水平分析

[實施方式1-1]通過電泳和質(zhì)譜法檢測血漿中的CFB蛋白質(zhì)

為了檢測正常人和胰腺癌患者的血漿中CFB的存在和量，執(zhí)行電泳和質(zhì)譜法。

血漿從西富蘭斯醫(yī)院基因庫和消化內(nèi)科獲得并遵照臨床實驗委員會(IRB)的規(guī)定。將血漿樣品按200ul分配，在-70℃下保存至實驗前并使用。補體因子B為分泌性蛋白，由于在血漿中存在已知的高豐度蛋白(high abundance proteins)，因此利用Hu-14(Agilent(安捷倫))去除除補體因子B之外的蛋白質(zhì)，然后執(zhí)行二維熒光電泳。為了執(zhí)行二維電泳，針對10名正常人血漿和10名胰腺癌患者血漿的樣品，在黑暗條件下利用作為熒光染料的400pmol(皮摩爾)的Cy3、Cy5、Cy2(GE Healthcare(通用醫(yī)療集團))對各分析樣品和對應(yīng)于其的標準樣品50μg進行標記30分鐘，利用1μL的10mM的賴氨酸使反應(yīng)停止。使分別利用熒光染料標記的3個樣品彼此混合后，添加樣品緩沖溶液[6M尿素、2M硫脲、4％CHAPS(3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽)、60mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、30mM三羥甲基氨基甲烷(TRIS)；pH 8.5]，直到最終變成450ul，并與2％的IPG 4-7NL的緩沖溶液一起在常溫下進行再水化16小時。利用Immobiline DryStrip pH 4-7NL(通用醫(yī)療集團)在MultiPhor II電泳系統(tǒng)(通用醫(yī)療集團)中升高至最佳條件的95000V而實施等電聚焦(Isoelectric Focusing，IEF)，并用三丁基膦緩沖溶液[6M尿素、2％硫酸鹽(十二烷基硫酸鈉，SDS)、30mM三羥甲基氨基甲烷、20％甘油(glycerol)、2.5％丙烯酰胺溶液(acrylamide solution)、5mM三丁基膦]進行一步還原和烷基化25分鐘。

在圖1a中示出針對正常人血漿的二維電泳結(jié)果，在圖1b中示出針對胰腺癌患者的血漿的二維電泳結(jié)果。圖中的箭頭表示CFB。從其結(jié)果可知在胰腺癌患者中CFB表達增加。

此外，為了了解在正常人和胰腺癌患者的血漿中CFB的表達差異，執(zhí)行二次垂直電泳。在二次垂直電泳中，利用Ettan Dalttwelve電泳系統(tǒng)(通用醫(yī)療集團)并使用9％至16％的聚丙烯酰胺凝膠以進行分離，在結(jié)束電泳后，利用Typhoon 9400(通用醫(yī)療集團)掃描儀以對應(yīng)于Cy2、Cy3、Cy5的波長進行掃描。利用DeCyder 2-D分析軟件(通用醫(yī)療集團)分析各凝膠圖像。

從其結(jié)果可知，如同二維電泳結(jié)果，在胰腺癌患者中CFB表達同樣增加(圖2)。

在分析圖像后，為了確認CFB的存在，針對由圖1a和圖1b中的箭頭所指示的點執(zhí)行質(zhì)譜法。從利用考馬斯藍(Coomassie blue)染料染色的凝膠挑選(picking)蛋白質(zhì)點，在進行褪色并利用胰蛋白酶進行消化后，使用Poros R2和Oligo R3樹脂混合物對消化后形成的肽進行脫鹽。利用Q-TOF(Agilent)分析蛋白質(zhì)鑒定，利用MASCOT數(shù)據(jù)庫對通過Q-TOF-MS獲得的質(zhì)譜進行鑒定。

從其結(jié)果可以確認到，如下表1所示，由圖1a和圖1b中的箭頭所指示的點為CFB。

[表1]

[實施方式1-2]血漿內(nèi)的CFB蛋白質(zhì)表達水平分析

為了分析胰腺癌患者血漿中的CFB蛋白質(zhì)表達水平，執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡法。在10名正常人血漿和10名胰腺癌患者血漿中，利用抗體對相同量的蛋白質(zhì)執(zhí)行免疫印跡。利用10％SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝膠電泳)分析10μg血漿蛋白質(zhì)后，為了執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡法，將整個凝膠轉(zhuǎn)換成硝化纖維(nitrocellulose，NC)膜后，利用包括5％脫脂乳的TBS-T(三乙醇胺緩沖鹽水溶液-吐溫)緩沖溶液[20mM三羥甲基氨基甲烷、137mM氯化鈉、0.1％吐溫20(Tween-20)，pH 7.6]阻斷一小時。將抗-補體因子B抗體(CFB，Abcam(艾博抗公司))以1∶1000倍在包括5％的脫脂乳的TBS-T緩沖溶液中稀釋并進行第一次處理，將抗-小鼠的IgG-HRP(Santa Cruz公司)以1∶10000倍進行第二次處理。利用ECL Plus蛋白質(zhì)印跡試劑(通用醫(yī)療集團)使最終的NC膜反應(yīng)1分鐘，并利用Typhoon9400掃描器進行掃描并分析。

如圖3a所示，從其結(jié)果可知，在胰腺癌患者組中CFB表達增加。

在將圖3a的結(jié)果表示為通過譜帶強度(band intensity)分析成倍比率(fold ratio)的結(jié)果時，確認到相比正常組，在胰腺癌患者中CFB的表達更高(圖3b)。

[實施方式1-3]胰腺癌細胞內(nèi)的CFB表達水平分析

為了分析胰腺癌細胞株中的CFB表達水平，執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡法和RT-PCR。正常細胞株使用HPDE(人胰腺導(dǎo)管上皮細胞)，胰腺癌細胞株使用HPAC1(人胰腺腺泡上皮癌細胞)、BXPC3(人胰腺腺癌細胞)以及PANC1(人胰腺癌細胞)。使用1mg的各細胞裂解物(cell lysate)，使2ug抗-補體因子B抗體、10ul蛋白質(zhì)G瓊脂糖一起在1ml管中免疫沉淀2小時，然后通過蛋白質(zhì)印跡法確認正常細胞和胰腺癌細胞內(nèi)的CFB表達水平。從其結(jié)果確認到在正常細胞中沒有檢測到CFB，而僅在胰腺癌細胞中檢測到CFB(圖4a)。

接著，利用RT-PCR確認CFB的mRNA表達水平。使用easy-BLUE(iNtRON公司，Gyeonggi(京畿道)，韓國)提取總RNA，使用omniscript RT kit(Qiagen公司，Hilden(希爾登)，德國)合成cDNA。所使用的引物如下：

CFB引物(序列號2)：5′-CAACAGAAGCGGAAGATCGTC-3′(正向)

CFB引物(序列號3)：5′-TATCTCCAGGTCCCGCTTCTC-3′(反向)

GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)引物(序列號4)：

5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(正向)

GAPDH引物(序列號5)：5′-TCCACCACCCTGTFGCTGTA-3′(反向)

PCR條件為執(zhí)行35個循環(huán)：在94℃下變性(denaturation)1分鐘，在59℃下退火1分鐘，在72℃下引物延伸(primer extension)1分鐘。從其結(jié)果可以確認如同蛋白質(zhì)印跡法數(shù)據(jù)，同樣在正常細胞中幾乎沒有檢測到CFB，且僅在胰腺癌細胞中檢測到CFB(圖4b)。將圖1b的結(jié)果表示為通過譜帶強度(band intensity)分析成倍比率的結(jié)果時，確認到相比正常細胞株，在胰腺癌細胞株中CFB的表達更高(圖4c)。

[實施方式2]利用多個樣品分析補體因子B(CFB)的蛋白質(zhì)表達水平

為了了解CFB作為候選生物標志物的確切的可能性，使用獨立的大規(guī)?；颊呷?large patient cohorts)進行附加的確認實驗。

使用44名正常人、12名胰腺炎患者、40名胰腺癌患者的血漿，作為標準，正常人血漿使用混合(pooling)的樣品，通過與實施方式1-3相同的方法，執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡法，從其結(jié)果可以確認到，相比于HD和CP，在PC中CFB的表達更高(圖5a)。以點示出該蛋白質(zhì)印跡條帶的強度的結(jié)果顯示，以p＜0.05相比于HD和CP在PC中CFB的表達更高(圖5b)。因此，在使用大規(guī)?；颊呷哼M行獨立實驗時，也能夠確認到在PC中的CFB的表達(以顯著的值)高于HD和CP中的CFB的表達約兩倍。

[實施方式3]通過ELISA分析各種癌患者中CFB和CA 19-9的蛋白質(zhì)表達水平

為了比較當(dāng)前被稱為胰腺癌生物標志物的CA 19-9和CFB的表達水平，使用HD、CP、PC、HCC、CC、GC的血漿執(zhí)行ELISA測試。CFB和CA 19-9ELISA試劑盒分別使用USCN公司產(chǎn)品和Panomics公司產(chǎn)品，針對每個產(chǎn)品，根據(jù)各自的實驗方法(protocol)進行實驗。

首先，針對CFB ELISA，將各個血漿以1∶10000稀釋后，在鋪放有針對CFB的抗體的孔中分別加入100ul稀釋后的血漿。在常溫下培養(yǎng)2小時。此后，從孔中去除血漿，并加入100ul的檢測試劑A工作液(working solution)，然后在常溫下培養(yǎng)1小時。1小時后，從孔中去除溶液，然后加入350ul的洗滌溶液，反復(fù)進行3次洗滌。此后，將100ul的檢測試劑B工作液加入各個孔中，在常溫下反應(yīng)30分鐘。利用洗滌溶液洗滌5次。此后，在各個孔中加入90ul的底物溶液(substrate solution)，在黑暗條件下反應(yīng)15分鐘，然后加入50ul的停止液(stop solution)，然后使用酶標儀在450mm下測量。在該組中CFB的表達水平示出為34.0(范圍：26.1-41.3)、73.5(范圍：62.3-77.1)、92.0(范圍：75.2-121.6)、37.0(范圍：28.8-47.5)、41.5(范圍：29.1-52.1)、63.0(范圍：56.3-72.9)ng/ml(圖6a)。

針對CA 19-9ELISA，在鋪放有CA 19-9抗體的孔板中分別加入10ul的各個血漿，并在其上加入100ul CA 19-9檢測緩沖液(assay buffer)。然后在充分混合30秒后在常溫下培養(yǎng)90分鐘。此后，從孔中去除緩沖液，使用洗滌緩沖液反復(fù)洗滌四次。然后，在各個孔中加入100ul工作結(jié)合試劑(working conjugate reagent)，在充分混合30秒后在常溫下培養(yǎng)90分鐘。從孔中去除試劑，使用洗滌緩沖液反復(fù)洗滌四次。然后，在各個孔中加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)，在混合10秒后，在黑暗環(huán)境下反應(yīng)20分鐘。然后，在加入100ul的停止液(stop solution)后混合30秒，然后使用酶標儀在450mm下測量。在該組中CA 19-9的水平分別示出為4.6(范圍：2.8-7.2)、10.2(范圍：6.0-21.4)、298.8(范圍：111.4-832.6)、50.5(范圍：18.1-159.5)、137.5(范圍：53.8-537.9)、10.0(范圍：9.4-16.7)U/ml(圖6b)。發(fā)現(xiàn)如同CA 19-9，相比非PC組(HD、CP、HCC、CC、GC)，在PC組中血漿內(nèi)的CFB表達水平同樣尤其高(p＜0.002)。此外，示出了，在CFB的情況下，與CA 19-9相比，更好地區(qū)分PC患者和非PC患者(p＜0.0001)。

這意味著，不適合將CA 19-9單獨用作胰腺癌診斷標志物，相反，適合將僅在胰腺癌中特異性表達增加的CFB用作胰腺癌診斷標志物。

[實施方式4]在胰腺癌診斷中通過ROC曲線分析CFB和CA 19-9的敏感性和特異性

為了確認CFB和CA 19-9區(qū)分胰腺癌患者和非胰腺癌患者(HD、CP、HCC、CC、GC)的程度，利用曼-懷氏等級和檢驗(Mann-Whitney rank sum test)程序執(zhí)行ROC曲線分析。通過AUC(曲線下面積)值比較CFB和CA 19-9。其結(jié)果是，CFB的AUC值為0.958(95％CI(置信區(qū)間)：0.956-0.959)，相比CA19-9的AUC值0.833(95％CI：0.829-0.837)，CFB的AUC值更高。當(dāng)組合CFB和CA 19-9時，AUC值為0.986(0.985-0.986)，相比單獨使用CFB和CA19-9(p＜0.01)時的AUC值，示出相當(dāng)高的AUC值(圖7)。

這意味著通過單獨的CFB或CFB和CA 19-9的組合可以診斷胰腺癌。

[實施方式5]CFB和CA 19-9基于最佳截止值的胰腺癌診斷

按各個組(HD：正常，CP：胰腺炎，PC：胰腺癌，HCC：肝癌，CC：膽管癌，GC；胃癌)確認CFB和CA 19-9的診斷效率。如下表2所示，其結(jié)果是CA 19-9和CFB在PC中示出近似的診斷效率(CA 19-9：80.5％，CFB：73.2％)。然而，在CA 19-9的情況下，在其他癌(HCC、CC、GC)中也示出高的診斷效率(HCC：61.3％，CC：77.2％，GC：17.1％)，相反，CFB在其他癌中示出低的診斷效率(HCC：0％，CC：0％，GC：8.6％)。這意味著與其他癌相比，針對PC，CFB比CA 19-9更具有特異性。

[表2]

[實施方式6]CFB和CA 19-9的敏感性和特異性確認

為了評估CFB、CA 19-9和CFB+CA 19-9作為胰腺癌診斷指標的準確性，根據(jù)通過最大約登指數(shù)(maximum Youden index)預(yù)測的最佳截止值，確認與其他疾病相比的CA 19-9、CFB和CFB+CA 19-9的胰腺癌診斷的敏感性和特異性(％)。其結(jié)果是，如下表3所示，將PC和其他組(HD、CP、HCC、CC、GC)比較時，CA 19-9的敏感性是80.4％，特異性是70.0％，CFB的敏感性是73.1％，特異性是97.9％。而且，在將CFB和CA 19-9組合時，敏感性是90.1％，特異性是97.2％。這意味著，相比單獨使用CA 19-9和CFB的情況，將CA 19-9和CFB組合時，示出更好的診斷效率。

[表3]