本公開涉及細菌內(nèi)生孢子分離和分析。

背景

細菌孢子通常被認(rèn)為是用于驗證無菌性(sterility)的指示劑物種(indicator species)，因為它們是針對滅菌方案的最有恢復(fù)力(resilient)的生命形式。傳統(tǒng)的細菌孢子分析是勞動密集和耗時的過程。例如，孢子分析可以涉及熱激活，連續(xù)稀釋，在合適的生長培養(yǎng)基上鋪板，和孵育兩至三天，直到可以進行計數(shù)。該分析過程可能需要幾天時間，要求進行分析的產(chǎn)品的制造商在接收無菌性測試結(jié)果之前持有顯著量的產(chǎn)品，所述無菌性測試結(jié)果允許制造商將產(chǎn)品投放到市場。此外，在存在無菌性問題的情況下，缺乏實時信息可能導(dǎo)致消耗幾天以確認(rèn)產(chǎn)品超出規(guī)范，并且需要被丟棄或重新使用。

在提供更快分析的嘗試中，設(shè)計者已經(jīng)利用光學(xué)分析技術(shù)，所述光學(xué)分析技術(shù)檢測與細菌孢子相關(guān)的光學(xué)發(fā)射信號，然后將這些信號與孢子計數(shù)相關(guān)聯(lián)。然而，這些技術(shù)對于需要分析細菌孢子計數(shù)的許多類別的材料具有有限的用途。例如，含有少量細菌孢子或在光學(xué)干擾與孢子相關(guān)的發(fā)射的周圍流體內(nèi)含有細菌孢子的材料可能難以使用光學(xué)分析技術(shù)來評價。作為一個實施例，監(jiān)測其產(chǎn)品中的細菌孢子計數(shù)的乳制品生產(chǎn)設(shè)施(facilities)通常不能使用光學(xué)發(fā)射分析技術(shù)。這是因為乳制品中的蛋白質(zhì)和其他分子可以光學(xué)干擾細菌孢子產(chǎn)生的發(fā)射。

概要

一般而言，本公開涉及用于分析流體內(nèi)的細菌內(nèi)生孢子的技術(shù)和系統(tǒng)。根據(jù)應(yīng)用，含有細菌內(nèi)生孢子的流體可以是或可以不是光學(xué)活性的，使得內(nèi)生孢子的周圍流體光學(xué)地干擾對應(yīng)于內(nèi)生孢子的光學(xué)發(fā)射。在任一情況下，流體可以通過疏水篩以幫助將內(nèi)生孢子與周圍流體分離。疏水篩可以由疏水性材料制成并且具有允許基本上所有流體穿過疏水篩的多孔結(jié)構(gòu)。由于當(dāng)流體穿過篩時，包含在流體內(nèi)的內(nèi)生孢子接近疏水性材料，內(nèi)生孢子可以通過疏水性吸引力粘附到疏水篩的表面。圍繞內(nèi)生孢子的流體可以繼續(xù)穿過疏水篩。以這種方式，細菌內(nèi)生孢子可以基本上與載流體分離。

一旦從周圍載流體分離，通過疏水性吸引力在疏水篩的表面上捕獲的細菌內(nèi)生孢子可以被處理以定性和/或定量評價流體內(nèi)的內(nèi)生孢子的特征。在一些實施例中，疏水篩用光學(xué)惰性沖洗流體例如水沖洗以從細菌內(nèi)生孢子中除去殘余的載流體。另外或可選地，可以向疏水篩中加入萌發(fā)流體以使捕獲的細菌內(nèi)生孢子萌發(fā)，并從孢子核釋放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)。當(dāng)將鑭系元素離子源加入萌發(fā)流體中時，鑭系元素離子可以與DPA結(jié)合以形成當(dāng)光學(xué)激發(fā)時發(fā)熒光的鑭系元素-DPA絡(luò)合物。該熒光可以被檢測并與由疏水篩捕獲的細菌內(nèi)生孢子的濃度相關(guān)，由疏水篩捕獲的細菌內(nèi)生孢子的濃度又可以與原始載流體中的細菌內(nèi)生孢子的濃度相關(guān)。

由于各種原因，使用疏水性材料例如疏水篩，幫助從周圍流體中分離細菌內(nèi)生孢子是有用的。在周圍流體具有光學(xué)活性的情況下，疏水性材料可以幫助將細菌內(nèi)生孢子與光學(xué)活性流體分離。這可以去除否則會在細菌內(nèi)生孢子光學(xué)分析期間干擾鑭系元素-DPA絡(luò)合物產(chǎn)生的發(fā)射的光學(xué)發(fā)射源。作為另一個實施例，疏水性材料可用于增加可用于分析的細菌內(nèi)生孢子的濃度，這可增加可分析的細菌內(nèi)生孢子濃度的范圍和/或減少與低內(nèi)生孢子濃度流體相關(guān)的誤差效應(yīng)。例如，由疏水性材料捕獲的內(nèi)生孢子的數(shù)量可以與穿過材料的流體的體積成比例。在這些應(yīng)用中，可用于分析的細菌內(nèi)生孢子的濃度可以通過增加通過(passed over)疏水性材料的載流體的體積而增加。然后可以通過控制加入疏水性材料中的萌發(fā)流體的量來控制可用于隨后的光學(xué)分析的細菌內(nèi)生孢子的濃度。當(dāng)加入疏水性材料中的萌發(fā)流體的體積小于穿過材料的載流體的體積時，與原始載流體中的濃度相比，細菌內(nèi)生孢子的濃度可以增加以用于隨后的光學(xué)分析。當(dāng)分析具有相對低濃度的細菌內(nèi)生孢子的流體時，這可能是有幫助的。

在一個實施例中，描述了一種方法，其包括使含有細菌內(nèi)生孢子的流體穿過疏水性收集材料，從而在疏水性收集材料上收集細菌內(nèi)生孢子。該方法還包括從收集的細菌內(nèi)生孢子釋放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)，并將鑭系元素源加入從收集的細菌內(nèi)生孢子釋放的吡啶(-2,6-)二羧酸以形成鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物。該方法還包括基于鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的光學(xué)響應(yīng)來確定流體中的細菌內(nèi)生孢子的濃度。

在另一個實施例中，描述了一種系統(tǒng)，其包括待評價的含水液體，萌發(fā)流體，鑭系元素源，疏水性收集材料和光學(xué)傳感器。疏水性收集材料構(gòu)造成接收含水液體并從其中捕獲細菌內(nèi)生孢子，接收萌發(fā)流體以從捕獲的細菌內(nèi)生孢子釋放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)，并接收鑭系元素源以在萌發(fā)流體中形成鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物。光學(xué)傳感器被構(gòu)造為將光能發(fā)射到萌發(fā)流體中，從而從鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物產(chǎn)生光學(xué)發(fā)射，檢測由鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物發(fā)射的光學(xué)發(fā)射，并由此確定含水液體中細菌內(nèi)生孢子的濃度。

在另一個實施例中，描述了一種方法，其包括使含水液體穿過疏水篩，從而通過疏水篩和細菌內(nèi)生孢子之間的疏水性吸引在疏水篩的表面上捕獲存在于含水液體中的細菌內(nèi)生孢子。該方法包括向疏水篩添加萌發(fā)流體，以從在疏水篩上捕獲的細菌內(nèi)生孢子中釋放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)，并提供鑭系元素源以與從在疏水篩上捕獲的細菌內(nèi)生孢子釋放的吡啶(-2,6-)二羧酸形成萌發(fā)流體中鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物。該方法還包括對萌發(fā)流體進行熒光分析以確定含水液體中細菌內(nèi)生孢子的濃度。

在附圖和下面的描述中闡述了一個或多個實施例的細節(jié)。根據(jù)說明書和附圖以及根據(jù)權(quán)利要求，其它特征，目的和優(yōu)點將是顯而易見的。

附圖簡要說明

圖1是說明用于從被評價的流體捕獲和分析細菌內(nèi)生孢子的實施例過程的流程圖。

圖2是實施例系統(tǒng)的概念圖，所述實施例系統(tǒng)可用于根據(jù)圖1的實施例技術(shù)來確定流體中的細菌內(nèi)生孢子計數(shù)。

圖3是顯示通過使乳樣品穿過疏水性材料制備的流體的實施例光學(xué)響應(yīng)的圖。

圖4是顯示所捕獲的內(nèi)生孢子的實例數(shù)量與實施例疏水性材料的表面積的圖。

圖5是顯示在使乳通過材料之后在1毫米的分辨率下的一種實施例疏水性材料的顯微照片。

圖6是圖5的顯微照片的100倍放大圖，其顯示內(nèi)生孢子粘附到材料的表面。

詳細說明

本公開一般涉及來自其中攜帶內(nèi)生孢子的流體的細菌內(nèi)生孢子的分離，濃縮和分析。在一些實例中，細菌內(nèi)生孢子包含在光學(xué)活性流體中，所述流體在與從細菌內(nèi)生孢子釋放的鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物發(fā)射的波長重疊的波長內(nèi)發(fā)射光學(xué)發(fā)射。這由于光學(xué)干擾可以阻止載流體內(nèi)的細菌內(nèi)生孢子的直接原位光學(xué)分析。在根據(jù)本公開的一些實施例中，載流體穿過疏水性收集材料以幫助將細菌內(nèi)生孢子與剩余的載流體分離。疏水性收集材料可以是載流體流過的多孔篩，定位成與載流體接觸的疏水性材料片，或者例如通過疏水性吸引力吸引并保持細菌內(nèi)生孢子的另一結(jié)構(gòu)。不管結(jié)構(gòu)如何，疏水性收集材料可以從載流體中捕獲和收集細菌內(nèi)生孢子。

可以使用多種不同的技術(shù)分析從周圍載流體收集的細菌內(nèi)生孢子。在一些實施例中，將萌發(fā)流體加入疏水性收集材料中以使收集的細菌內(nèi)生孢子萌發(fā)，并從內(nèi)生孢子中釋放吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA)。可以將鑭系元素離子試劑加入萌發(fā)流體中以形成鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物。當(dāng)用適當(dāng)波長的光照射時，該鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物可以發(fā)射可以被檢測和定量的熒光。鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物發(fā)射的光的大小和/或波長對應(yīng)于萌發(fā)流體中的鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的濃度，其反過來對應(yīng)于載流體中的細菌內(nèi)生孢子的濃度。

用于分離、濃縮和/或分析細菌內(nèi)生孢子的所公開的系統(tǒng)和技術(shù)可以與可以含有細菌內(nèi)生孢子的任何所需流體一起使用?？梢允褂迷撓到y(tǒng)和技術(shù)的實施例工業(yè)包括食品工業(yè)，飲料工業(yè)，制藥工業(yè)，化學(xué)工業(yè)，保健工業(yè)，水凈化工業(yè)以及其他針對細菌內(nèi)生孢子檢查材料的工業(yè)。在食品和飲料工業(yè)的情況下，可以分析細菌內(nèi)生孢子的流體包括從哺乳動物可消費的(例如，人類可消費的)食品和飲料獲得的那些，例如但不限于乳制品(例如，生奶，全脂和脫脂乳，煉乳，奶油(cream)，乳清和乳清衍生物，酪乳)，汁(例如果汁，例如橙子和其他柑橘屬果汁，蘋果汁和其他蘋果類(pomaceous)果汁，紅莓(red berry)果汁，椰子乳和熱帶水果果汁，蔬菜汁例如番茄汁，甜菜根汁，胡蘿卜汁，和草汁)，和罐裝食品(例如罐裝水果，罐裝蔬菜，罐裝肉)?？赡墚a(chǎn)生需要分析的內(nèi)生孢子的細菌的類型包括但不限于，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)，短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)，蕈狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides)，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，耐熱芽孢桿菌(Bacillus sporothermodurans)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringensis)，魏登施泰芽孢桿菌(Bacillus weihenstephanensis)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)，酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)，脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)，難辨梭菌(Clostridium difficile)和炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)。

通常，包含用于分析的細菌內(nèi)生孢子的流體將是液體，例如含水液體(例如，水基液體)，但是也可以使用系統(tǒng)和技術(shù)來評價含有細菌內(nèi)生孢子的氣體載流體。流體可以直接從分析中的產(chǎn)品樣品獲得，或者可以通過將產(chǎn)品樣品與載流體組合以從樣品提取細菌內(nèi)生孢子而形成。例如，在潛在地含有細菌內(nèi)生孢子的產(chǎn)品樣品是固體的情況下，可以將固體研磨或與載流體混合以提取細菌內(nèi)生孢子用于分析。

術(shù)語細菌內(nèi)生孢一般是指在細菌內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)生孢子。術(shù)語內(nèi)生孢子不包括分生孢子(conidio spore)和真菌的子囊孢子(ascospores)。內(nèi)生孢子通常是非生殖結(jié)構(gòu)，其主要功能是確保細菌在環(huán)境應(yīng)激(environmental stress)期間的存活。內(nèi)生孢子可以耐受極端的干旱，熱和饑餓。它們受到蛋白質(zhì)和碳水化合物的硬殼的保護，并且通過細菌中的二分裂形式產(chǎn)生。內(nèi)生孢子可以包含其親本細菌的DNA，核糖體和大量的吡啶(-2,6-)二羧酸。例如，吡啶(-2,6-)二羧酸可以占內(nèi)生孢子干重的大于5重量％，例如至少10重量％或至少15重量％，例如5重量％至20重量％，或7重量％至16重量％。吡啶(-2,6-)二羧酸是被認(rèn)為幫助內(nèi)生孢子維持其休眠的化學(xué)品。

因為內(nèi)生孢子可以在惡劣環(huán)境中存活并且對于滅菌方案是有恢復(fù)力的，所以內(nèi)生孢子可以是用于驗證產(chǎn)品無菌性的良好指示劑物種。產(chǎn)品樣品內(nèi)不存在內(nèi)生孢子和/或產(chǎn)物內(nèi)低含量內(nèi)生孢子的檢測可表明產(chǎn)品對于市場釋放是合適地?zé)o菌的。盡管這樣的信息對于各種產(chǎn)品是有用的，但是該信息對于可消費產(chǎn)品(例如可攝入的食物和飲料)可能是特別有價值的。事實上，在將產(chǎn)品出售給公眾之前，政府監(jiān)管制度可能要求遵守某些無菌性標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)本公開的一些實施例，基本上實時地測量產(chǎn)品內(nèi)的內(nèi)生孢子計數(shù)的能力可以使制造商能夠基本上實時地監(jiān)視他們的產(chǎn)品的質(zhì)量，并且如果檢測到無菌性問題，則快速響應(yīng)。

圖1是說明用于從被評價的流體捕獲和分析細菌內(nèi)生孢子的實施例過程的流程圖。該方法包括使待評價的流體穿過疏水性材料(10)，從而例如通過疏水性吸引力將內(nèi)生孢子捕獲在疏水性材料的表面上，從流體收集細菌內(nèi)生孢子。在從流體捕獲細菌內(nèi)生孢子后，任選沖洗(12)細菌內(nèi)生孢子以除去光學(xué)干擾載流體，然后處理細菌內(nèi)生孢子以釋放吡啶(-2,6-)二羧酸(14)。此外，將鑭系元素離子源加入吡啶(-2,6-)二羧酸(16)中以形成鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物，然后可以對鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物進行光學(xué)分析(18)以確定所評價的流體中的細菌內(nèi)生孢子的濃度。如下面更詳細地描述的，多種不同的處理參數(shù)和條件可以用于利用圖1的實施例過程來捕獲和分析細菌內(nèi)生孢子。

為了從被評價的流體中濃縮和/或分離細菌內(nèi)生孢子，流體可以通過疏水性材料(10)。參照圖2更詳細地描述了可用于濃縮和/或分離內(nèi)生孢子的疏水性材料的實施例。然而，一般來說，疏水性材料可以是被選擇為選擇性地與被分析的流體中的內(nèi)生孢子結(jié)合的材料或材料的組合，同時所述材料或材料的組合允許攜帶內(nèi)生孢子的周圍流體穿過疏水性材料而不結(jié)合。當(dāng)這樣構(gòu)造時，存在于被分析的流體中的內(nèi)生孢子可以附著到疏水性材料的表面，而流體的剩余部分繼續(xù)穿過疏水性材料而不粘附。這可以允許存在于被分析的流體中的內(nèi)生孢子聚集在疏水性材料的表面上，就此從周圍載流體中濃縮并分離內(nèi)生孢子。

疏水性收集材料可以是疏水性的，因為其不結(jié)合或吸收水。例如，疏水性收集材料可以排斥極性分子，例如水和可溶于水的分子，同時允許至少一些類型的非極性分子結(jié)合到材料的表面。非極性分子可以通過疏水性吸引粘附到疏水性材料的表面。具有極性和非極性官能團的分子可以或可以不粘附于疏水性材料，例如，取決于所使用的材料的疏水性、將極性官能團與非極性官能團分開的碳鏈的長度、和/或分子的凈極性。

當(dāng)使用時，疏水性收集材料可以通過疏水性吸引從通過材料的流體中捕獲并收集內(nèi)生孢子。由于含有內(nèi)生孢子的流體穿過疏水性收集材料，因此內(nèi)生孢子可以在疏水性收集材料的表面附近通過并且在一些實施例中與疏水性收集材料的表面接觸。由于存在于流體內(nèi)的細菌內(nèi)生孢子可以是非極性的和/或含有非極性官能團，因此內(nèi)生孢子可以吸引并附著到疏水性材料的表面。這些內(nèi)生孢子可以通過疏水性吸引力(例如熵界面力)結(jié)合到疏水性材料的表面。這些力的大小可以取決于相互作用基團(例如，內(nèi)生孢子和疏水性材料)的疏水性以及間隔它們的距離。在一些實施例中，疏水力隨著間隔距離的減小而近似指數(shù)地增加。

圍繞內(nèi)生孢子的載流體可以繼續(xù)穿過疏水性收集材料，而不結(jié)合到材料的表面。例如，當(dāng)載流體是含水流體時，疏水性材料可以排斥存在于載流體中的極性水分子，導(dǎo)致載流體流過(flow past)疏水性材料而不附著到材料的表面。以這種方式，疏水性材料可以捕獲經(jīng)過材料的流體樣品中的內(nèi)生孢子，并在表面材料上收集內(nèi)生孢子，產(chǎn)生積累的大量內(nèi)生孢子以用于隨后的分析。在不同的實施例中，已經(jīng)穿過疏水性材料的流體可以被處置或再循環(huán)并且再次穿過疏水性材料。例如，流體可以穿過疏水性材料兩次，三次或更多次，以增加疏水性材料從流體中收集的內(nèi)生孢子的數(shù)量。

穿過疏水性材料的流體體積可以變化，例如，取決于所使用的疏水性材料的尺寸和被分析的樣品中內(nèi)生孢子的預(yù)期濃度。在一些實施例中，穿過疏水性材料的流體體積等于或大于疏水性材料本身的體積。例如，穿過疏水性材料的含有內(nèi)生孢子的流體的體積可以是疏水性材料本身的體積的至少10倍，例如材料體積的至少100倍，材料體積的至少1000倍或材料體積的至少10,000倍。通常，增加穿過疏水性材料的流體的體積增加了捕獲在材料表面上并可用于分析的內(nèi)生孢子的數(shù)量。

可以使用各種不同的技術(shù)使被分析的流體穿過疏水性收集材料(10)。在一些實施例中，將疏水性收集材料浸入或浸漬入含有被分析的流體的儲存器中，然后從儲存器中取出，以提供疏水性結(jié)合在材料表面上并可用于分析的內(nèi)生孢子。在其它實施例中，移動的流體流流動穿過疏水性材料的表面，允許流體流中的內(nèi)生孢子附著到材料的表面，而流體的剩余部分繼續(xù)流動通過和遠離疏水性材料。在這樣的實施例中，被分析的流體流可以大致平行于疏水性材料的平面表面和/或通常橫向于(例如，垂直于)疏水性材料的平面表面。例如，在關(guān)于圖2更詳細地描述的一些構(gòu)造中，疏水性材料可以是具有孔的多孔材料，孔的尺寸允許基本上所有被分析的流體流動穿過材料。當(dāng)這樣構(gòu)造時，被分析的流體可以一般地致橫向于疏水性材料的外表面流動。內(nèi)生孢子可以在材料的孔內(nèi)聚集，而流體的剩余部分繼續(xù)流動穿過材料并在疏水性材料的相對側(cè)上排出。

與用于收集細菌內(nèi)生孢子的疏水性材料的具體構(gòu)造無關(guān)，圖1的實施例技術(shù)包括任選地用沖洗流體(12)沖洗收集的內(nèi)生孢子。在使待評價的流體穿過疏水性材料(10)之后，可以終止流體流(例如其中流體流動穿過材料)，以留下在其表面上具有收集的內(nèi)生孢子的疏水性材料。這種疏水性材料還可以包含攜帶內(nèi)生孢子的殘留流體，例如被捕獲在收集材料的表面上和/或材料的孔內(nèi)(在材料是多孔的情況下)的收集的內(nèi)生孢子之間和周圍的流體。在一些應(yīng)用中，如果在分析前流體沒有從內(nèi)生孢子中除去，則該殘留流體可以光學(xué)干擾內(nèi)生孢子的后續(xù)光學(xué)分析。例如，攜帶內(nèi)生孢子的流體可以在范圍從250納米(nm)至300nm的波長內(nèi)的光撞擊流體時發(fā)射熒光發(fā)射。由載流體發(fā)射的這些發(fā)射可以在300nm至700nm的波長范圍內(nèi)，其可以與鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物發(fā)出熒光的例如450nm至650nm的波長重疊。結(jié)果，來自載流體的這些發(fā)射可能掩蓋和/或扭曲與內(nèi)生孢子相關(guān)的發(fā)射，抑制內(nèi)生孢子的準(zhǔn)確量化。

為了幫助從內(nèi)生孢子中除去這種污染流體，可以用沖洗流體沖洗附著到疏水性材料的內(nèi)生孢子。沖洗流體可以是光學(xué)惰性的，例如使得殘留在內(nèi)生孢子上的殘留沖洗流體不干擾內(nèi)生孢子的隨后的光學(xué)分析。在一個實施例中，沖洗流體是或包括液體水(例如蒸餾水)。

在不同的實施例中，可以通過將含有孢子的疏水性材料浸漬入含有沖洗流體的儲存器中和/或使移動的沖洗流體流穿過疏水性材料的表面和其上含有的內(nèi)生孢子，沖洗疏水性材料。當(dāng)疏水性材料構(gòu)造為多孔材料時，加壓的沖洗流體流可以穿過材料(例如，一般地橫向地)，漂洗來自內(nèi)生孢子周圍和來自材料的孔的殘余的載流體。在實踐中，捕獲在疏水性材料的表面上的一些內(nèi)生孢子可以釋放到?jīng)_洗流體中。然而，當(dāng)例如通過在校準(zhǔn)運行和后續(xù)操作之間在一致的壓力條件下使用一致量的沖洗流體、校準(zhǔn)技術(shù)時，可以考慮這些損失的內(nèi)生孢子。

當(dāng)進行沖洗時，通過收集的內(nèi)生孢子和/或穿過疏水性材料的沖洗流體的量可以變化，例如，基于被分析的樣品中的內(nèi)生孢子的濃度和載流體的光學(xué)干擾影響。在一些實施例中，穿過疏水性材料和在其上收集的內(nèi)生孢子的沖洗流體的體積至少等于最初穿過疏水性材料的評價的流體的體積。例如，如果等于“X”的體積的含有內(nèi)生孢子的液體穿過疏水性收集材料，則疏水性材料可隨后用大于或等于“X”的沖洗流體體積沖洗，例如大于或等于1.5倍“X”、大于或等于2倍“X”或在“X”和5倍“X”之間的沖洗流體體積。作為一個具體和非限制性實施例，如果50毫升含有內(nèi)生孢子的流體穿過疏水性材料，當(dāng)使用2倍“X”的沖洗流體比時，該材料可隨后用100毫升沖洗流體沖洗。在一些實例中，使用足以從內(nèi)生孢子除去基本上所有(以及，在其它實例中，全部)光學(xué)干擾載流體的沖洗流體體積。

在從所評價的流體捕獲細菌內(nèi)生孢子并任選地沖洗含有捕獲的內(nèi)生孢子的疏水性材料以除去光學(xué)干擾載流體(12)之后，圖1的技術(shù)包括處理內(nèi)生孢子以釋放吡啶(-2,6-)二羧酸(14)。吡啶(-2,6-)二羧酸(DPA，2,6-吡啶二羧酸)通常以高濃度(例如，約1摩爾％或約15％干重％)存在于內(nèi)生孢子核中，通常為與Ca²⁺的1:1絡(luò)合物。吡啶(-2,6-)二羧酸也是具有以下特征的商購可得的產(chǎn)品：CAS#：499-83-2，同義詞：2,6吡啶二羧酸，分子式：C7H5NO4，分子量：167.12，說明：白色結(jié)晶粉末，硫酸灰分：最大0.3％，水分含量：最大0.5％，熔點：242.0至245.0℃。因為吡啶(-2,6-)二羧酸是與細菌內(nèi)生孢子唯一相關(guān)的指示劑，所以樣品中吡啶(-2,6-)二羧酸的濃度可以指示樣品中內(nèi)生孢子的數(shù)量。

為了檢測和定量根據(jù)圖1的實施例技術(shù)的樣品中存在的吡啶(-2,6-)二羧酸，收集在疏水性材料的表面上的細菌內(nèi)生孢子可以原位加工以從孢子的核釋放吡啶(-2,6-)二羧酸。在一些實施例中，將萌發(fā)流體加入收集在疏水性材料表面上的內(nèi)生孢子中，例如使內(nèi)生孢子轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)細胞并釋放吡啶(-2,6-)二羧酸。萌發(fā)涉及休眠的內(nèi)生孢子開始代謝活動，從而打破冬眠。它通常包括孢子外被的破裂或吸收，內(nèi)生孢子的膨脹，代謝活性的增加和對環(huán)境應(yīng)激的抗性的喪失。單獨或與加熱組合的萌發(fā)流體的添加可以引起內(nèi)生孢子的萌發(fā)。

在一些實施例中，圖1的技術(shù)包括向包含捕獲的內(nèi)生孢子的疏水性材料中加入萌發(fā)流體以釋放吡啶(-2,6-)二羧酸(14)。在不同的實施例中，可以通過將含有孢子的疏水性材料浸漬入含有萌發(fā)流體的儲存器中和/或使移動的萌發(fā)流體流穿過疏水性材料的表面和其上含有的內(nèi)生孢子，將萌發(fā)流體加入在疏水性材料上捕獲的內(nèi)生孢子。當(dāng)疏水性材料構(gòu)造為多孔材料時，加壓的萌發(fā)流體流可以穿過材料(例如，一般地橫向地)，使在疏水性材料的表面上收集的內(nèi)生孢子(例如，材料的外表面和孔壁)暴露于萌發(fā)流體。用于釋放吡啶(-2,6-)二羧酸的實施例萌發(fā)流體包括但不限于L-丙氨酸，L-天冬酰胺，D-葡萄糖，L-半胱氨酸，十二烷基胺和混合物AGFK(含有D-葡萄糖，D-果糖，KCl和L-天冬酰胺)。

當(dāng)使用時，加入疏水性材料中以引發(fā)捕獲在材料上的內(nèi)生孢子的萌發(fā)的萌發(fā)流體的量可以變化。在一些實施例中，加入疏水性材料和在其上收集的內(nèi)生孢子的萌發(fā)流體的體積小于最初穿過疏水性材料的評價的流體的體積。例如，如果含有等于“X”的內(nèi)生孢子的液體體積穿過疏水性收集材料，隨后加入疏水性材料和在其上包含的內(nèi)生孢子的萌發(fā)流體的量可以小于“X”，例如小于0.5倍“X”，小于0.2倍“X”或小于0.05倍“X”的沖洗流體的體積。例如，加入疏水性材料中的萌發(fā)流體的體積可以為0.001倍“X”至0.5倍“X”，例如0.01倍“X”至0.2倍“X”或0.025倍“X”至0.1倍“X”。作為一個具體且非限制性實施例，如果50毫升含有內(nèi)生孢子的流體穿過疏水性材料，則當(dāng)使用0.1倍“X”的萌發(fā)流體比時，可以將5毫升萌發(fā)流體加入疏水性材料中(例如，在用任何前述體積的沖洗流體任選地沖洗材料后)。

可以捕獲和/或保留加入疏水性材料和在其上收集的內(nèi)生孢子的萌發(fā)流體，用于隨后的光學(xué)分析。相比之下，在沉積內(nèi)生孢子和/或沖洗流體之后通過和/或穿過疏水性材料的殘留樣品流體可以在交叉疏水性材料之后處置。因此，與使用較大體積的萌發(fā)流體相比，向疏水性材料添加較小體積的萌發(fā)流體可增加萌發(fā)流體中的內(nèi)生孢子和/或吡啶(-2,6-)二羧酸的濃度，其用于隨后的分析。這在分析具有相對低濃度的細菌內(nèi)生孢子的流體時，可能是有幫助的。

在一些實施例中，萌發(fā)流體在加入疏水性材料之前和/或當(dāng)含有內(nèi)生孢子的疏水性材料浸漬入萌發(fā)流體中時被加熱。例如，包含捕獲的內(nèi)生孢子的疏水性材料可以浸沒在萌發(fā)流體中，或者可以將含有內(nèi)生孢子的疏水性材料的孔隙用萌發(fā)流體飽和，然后進行熱休克。加熱萌發(fā)流體可以幫助引發(fā)內(nèi)生孢子的萌發(fā)并加速吡啶(-2,6-)二羧酸的釋放。在一些實施例中，將萌發(fā)材料加熱至75攝氏度至90攝氏度的溫度，例如，加熱15分鐘至30分鐘的時間。

除了向細菌內(nèi)生孢子添加萌發(fā)流體之外或代替向細菌內(nèi)生孢子中添加萌發(fā)流體，內(nèi)生孢子可以通過用核壁破裂力沖擊內(nèi)生孢子而被破壞性裂解。實施例裂解方法包括但不限于：微波，等離子體清洗，干加熱，高壓滅菌，超聲處理和氯化氫氣體處理。裂解可破壞內(nèi)生孢子的核，釋放吡啶(-2,6-)二羧酸。

圖1的實施例技術(shù)還包括向從捕獲的內(nèi)生孢子釋放的吡啶(-2,6-)二羧酸中加入鑭系元素離子源以形成鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物(16)。吡啶(-2,6-)二羧酸是以高親和力結(jié)合金屬離子的化學(xué)配體。一旦結(jié)合，吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物可以在UV激發(fā)下發(fā)射強烈的綠色熒光。這種熒光的大小可以與吡啶(-2,6-)二羧酸的濃度相關(guān)，吡啶(-2,6-)二羧酸的濃度又可以與被分析的樣品中存在的內(nèi)生孢子的數(shù)量相關(guān)。

可以將鑭系元素離子源加入從捕獲在疏水性材料上的內(nèi)生孢子釋放的吡啶(-2,6-)二羧酸中，以形成發(fā)熒光的鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物?？梢约尤脒拎?-2,6-)二羧酸中的實施例鑭系元素離子包括但不限于：鋱(Tb³⁺)，銪(Eu³⁺)和鏑。在一個實施例中，使用鋱(Tb³⁺)離子，導(dǎo)致鋱-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的形成。通常，將過量的鑭系元素離子加入吡啶(-2,6-)二羧酸中，其足以絡(luò)合樣品中存在的所有吡啶(-2,6-)二羧酸分子。

為了向從收集在疏水性材料上的內(nèi)生孢子釋放的吡啶(-2,6-)二羧酸中加入鑭系元素離子，可以將鑭系元素離子引入到萌發(fā)流體或其他流體(例如，當(dāng)進行破壞性裂解時)，萌發(fā)流體或其他流體含有或?qū)⒑羞拎?-2,6-)二羧酸酸。在一個實施例中，在將萌發(fā)流體引入捕獲在疏水性材料上的內(nèi)生孢子之前，將鑭系元素離子加入萌發(fā)流體中。在這種應(yīng)用中，鑭系元素離子可以與吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合，因為酸在萌發(fā)期間從內(nèi)生孢子釋放。在另一個實施例中，在內(nèi)生孢子萌發(fā)并釋放其吡啶(-2,6-)二羧酸、例如形成含有釋放的吡啶(-2,6-)二羧酸的萌發(fā)流體后，將鑭系元素離子加入萌發(fā)流體中。因此，盡管圖1示出了在從捕獲的內(nèi)生孢子(14)中釋放吡啶(-2,6-)二羧酸后作為單獨的步驟添加鑭系元素離子(16)的實施例技術(shù)，應(yīng)當(dāng)理解，鑭系元素離子可以存在于萌發(fā)流體中，使得離子被加入并與吡啶(-2,6-)二羧酸合并，因為它在單個步驟中從內(nèi)生孢子釋放。

圖1的技術(shù)還包括對包含鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的流體進行光學(xué)分析，并由此確定被評價的流體(18)中的細菌內(nèi)生孢子的濃度。鑭系元素離子的熒光的特征在于長的壽命(例如，0.1至1毫秒)，小的消光系數(shù)和窄的發(fā)射帶。窄的發(fā)射帶出現(xiàn)，因為將化合價f軌道通過外s和p電子與環(huán)境屏蔽，并且由于防止了發(fā)射激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間的轉(zhuǎn)變而出現(xiàn)長壽命/小消光系數(shù)。因此，由于小的吸收截面，鑭系元素離子的直接激發(fā)導(dǎo)致弱的熒光。然而，有機發(fā)色團(如吡啶(-2,6-)二羧酸)與鑭系元素離子的配位觸發(fā)強烈的鑭系元素?zé)晒?。吡?-2,6-)二羧酸用作光收集中心，并且具有下坡能量學(xué)的強電子耦合允許以吡啶(-2,6-)二羧酸為中心的激發(fā)能量被有效地轉(zhuǎn)移到鑭系元素離子，其隨后發(fā)出亮綠色熒光。

在一個實施例中，使用熒光計對萌發(fā)流體或含有鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的其它流體進行光學(xué)分析。熒光計將光發(fā)射到被分析的流體中，并且響應(yīng)于接收發(fā)射的光，鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物發(fā)射熒光發(fā)射。熒光發(fā)射可以處于與由熒光計發(fā)射到含有鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的流體中的光的波長不同的波長。熒光計可以檢測熒光發(fā)射并基于光學(xué)響應(yīng)確定吡啶(-2,6-)二羧酸的濃度。

在另一個實施例中，使用分光光度計對萌發(fā)流體或含有鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的其它流體進行光學(xué)分析。分光光度計將一個或多個特定波長的光發(fā)射到含有鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的流體中，并檢測在那些一個或多個波長的穿過流體的光的量。流體樣品吸收的光的量可以與樣品中鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的濃度成比例。

與所使用的技術(shù)無關(guān)，包含鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的流體的光學(xué)響應(yīng)可以與流體中吡啶(-2,6-)二羧酸的濃度成比例。反過來，該吡啶(-2,6-)二羧酸與捕獲在疏水性材料上的內(nèi)生孢子的濃度成比例，所述捕獲在疏水性材料上的內(nèi)生孢子的濃度進一步與被分析的原始流體樣品中的內(nèi)生孢子的濃度相關(guān)。因此，含有鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的流體的光學(xué)響應(yīng)可以與校準(zhǔn)數(shù)據(jù)一起使用，以確定被分析的原始流體樣品中的內(nèi)生孢子的濃度。

圖2是根據(jù)圖1的實施例技術(shù)可用于確定流體中的細菌內(nèi)生孢子計數(shù)的實施例系統(tǒng)20的概念圖示。系統(tǒng)20可以實現(xiàn)為在線監(jiān)測站，以連續(xù)監(jiān)測正在處理的流體中的細菌內(nèi)生孢子計數(shù)?；蛘?，系統(tǒng)20可離線實現(xiàn)，例如在實驗室環(huán)境中，以周期性地確定離散流體樣品中的細菌內(nèi)生孢子計數(shù)。系統(tǒng)20被示出為包括待評價的含水液體源22，任選的沖洗流體源24，萌發(fā)流體源26和鑭系元素離子源28。系統(tǒng)20還包含疏水性材料30。疏水性材料30可以接收來自液體源22的含水液體，來自源24的沖洗流體，來自源26的萌發(fā)流體，以及來自源28的鑭系元素離子。例如，疏水性材料30和/或包含該材料的殼體可經(jīng)由將流體輸送到疏水性材料的導(dǎo)管而流體連接到不同的源。在其他實施例中，疏水性材料30和/或包含該材料的殼體可以通過手動轉(zhuǎn)移接收流體，例如由實驗室技術(shù)人員執(zhí)行的手動轉(zhuǎn)移。

在操作中，疏水性材料30可以從含水液體源22接收液體并從液體中捕獲細菌內(nèi)生孢子。當(dāng)液體流動經(jīng)過和/或穿過材料時，細菌內(nèi)生孢子可疏水地結(jié)合并聚集在疏水性材料30的表面上。結(jié)果，已經(jīng)穿過疏水性材料30的殘留液體可以具有比來自源22的液體更低的內(nèi)生孢子濃度(例如，可以基本上沒有內(nèi)生孢子)。這種具有減少的內(nèi)生孢子數(shù)量的殘留液體在穿過疏水性材料30或在循環(huán)回來穿過材料后可以被處置至排液裝置32。

在終止來自液體源22的液體流之后，疏水性材料30可以具有收集并保持在其表面上的內(nèi)生孢子。如果需要，疏水性材料30可以隨后從沖洗流體源24接收沖洗流體。沖洗流體可以流動穿過疏水性材料30的表面和經(jīng)過捕獲在材料表面上的內(nèi)生孢子上，例如幫助從內(nèi)生孢子中除去光學(xué)干擾液體，為隨后的光學(xué)分析做準(zhǔn)備。已經(jīng)穿過疏水性材料30并且含有殘留載體液體(例如，光學(xué)干擾液體)的沖洗流體可以處置到排液裝置32。在其他應(yīng)用中，疏水性材料30在光學(xué)分析之前不用沖洗流體沖洗，因此，系統(tǒng)20不包括沖洗流體源24。

在終止來自沖洗流體源24(當(dāng)使用時)的沖洗流體的流動之后，疏水性材料30可以接收來自萌發(fā)流體源26的萌發(fā)流體。在一個實施例中，萌發(fā)流體流動穿過疏水性材料30的表面并經(jīng)過被捕獲在材料的表面上的內(nèi)生孢子，例如，收集在疏水性材料下游的儲存器中。在另一個實施例中，將萌發(fā)流體引入含有疏水性材料30的殼體中，導(dǎo)致疏水性材料和其上收集的內(nèi)生孢子部分或完全浸漬入萌發(fā)流體中。這可以允許由疏水性材料30捕獲的內(nèi)生孢子原位萌發(fā)，同時保留在材料的表面上。如上面關(guān)于圖1所討論的，內(nèi)生孢子可以在萌發(fā)期間釋放吡啶(-2,6-)二羧酸，增加萌發(fā)流體中吡啶(-2,6-)二羧酸的濃度(例如，從為零的原始濃度)。

為了確定加入疏水性材料30中的萌發(fā)流體中的吡啶(-2,6-)二羧酸的濃度，以及作為結(jié)果，含水液體源22中的內(nèi)生孢子的濃度，將鑭系元素離子加入來自鑭系元素離子源28的富含吡啶(-2,6-)二羧酸的萌發(fā)流體中。在一個實施例中，將鑭系元素離子加入富含吡啶(-2,6-)二羧酸的萌發(fā)流體中，而疏水性材料30部分或完全浸漬在萌發(fā)流體中。在另一個實施例中，在例如通過將材料下游的流體排出、除去疏水性材料30之后，將萌發(fā)流體加入富含吡啶(-2,6-)二羧酸的萌發(fā)流體中。在另一個實施例中，鑭系元素離子不與萌發(fā)流體分開添加，而是在被疏水性材料30接收之前與萌發(fā)流體混合，以便提供萌發(fā)流體和鑭系元素離子兩者的單一來源。鑭系元素離子可以與從內(nèi)生孢子釋放的吡啶(-2,6-)二羧酸結(jié)合以形成光學(xué)活性的鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物。

在圖2的實施例中系統(tǒng)20還包含光學(xué)傳感器34和控制器36。光學(xué)傳感器34被構(gòu)造為接收并光學(xué)分析包含由從疏水性材料30捕獲的內(nèi)生孢子產(chǎn)生的鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的萌發(fā)流體。光學(xué)傳感器34可包含一個或多個光學(xué)發(fā)射器和一個或多個光學(xué)檢測器。在操作中，一個或多個光學(xué)發(fā)射器將光引導(dǎo)到包含鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的流體中，并且一個或多個光學(xué)檢測器檢測由流體產(chǎn)生的熒光發(fā)射，特別是包含在流體內(nèi)的鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物產(chǎn)生的熒光發(fā)射。引導(dǎo)到流體中的光可以通過激發(fā)鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的電子而產(chǎn)生熒光發(fā)射，使得分子發(fā)射能夠被光學(xué)檢測器檢測到的能量(即，熒光)。在一些實施例中，一個或多個光學(xué)發(fā)射器以一個頻率(例如，紫外線頻率)將光引導(dǎo)到流體中，并使鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物以不同的頻率(例如，可見光頻率，不同的紫外線頻率)發(fā)射光能量。

例如，光學(xué)傳感器34可以包括發(fā)射紫外線(UV)光譜內(nèi)的光的一個或多個光學(xué)發(fā)射器，例如在從大約250nm到大約300納米的范圍內(nèi)的波長內(nèi)。例如，一個或多個光學(xué)發(fā)射器可以在從270nm到280nm的波長內(nèi)發(fā)射。響應(yīng)于該發(fā)射的光，流體內(nèi)的鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物可以在450nm至650nm的波長下產(chǎn)生熒光發(fā)射。光學(xué)傳感器34的一個或多個光學(xué)檢測器可以檢測由發(fā)熒光的鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物在這些波長發(fā)射的能量。

控制器36可以控制一個或多個光學(xué)發(fā)射器以將輻射引導(dǎo)到包含鑭系元素-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的流體中，并且還控制一個或多個檢測器以檢測由流體發(fā)射的熒光發(fā)射。在一些實施例中，控制器36(或系統(tǒng)20內(nèi)的另一控制器)處理光檢測信息以確定被分析的原始含水液體中的內(nèi)生孢子的濃度或計數(shù)。例如，控制器36可以通過比較以下來確定被分析的含水液體中的內(nèi)生孢子的濃度或計數(shù)：從具有未知濃度或計數(shù)的內(nèi)生孢子的源液體制備的萌發(fā)流體、由一個或多個光學(xué)檢測器檢測的熒光發(fā)射的大小與從具有已知濃度或計數(shù)的內(nèi)生孢子的萌發(fā)流體、由光學(xué)檢測器檢測的熒光發(fā)射的大小。未知流體可以使用與用于制備校準(zhǔn)流體的方法相同或基本相同的方法來制備。例如，相同體積的未知源流體可以穿過疏水性材料30，如用于產(chǎn)生校準(zhǔn)流體，隨后使用相同體積的沖洗流體，萌發(fā)流體和鑭系元素離子源。校準(zhǔn)信息可以存儲在與控制器36相關(guān)聯(lián)的非暫時性計算機可讀存儲介質(zhì)中。

在一些實施例中，控制器36管理系統(tǒng)20的整體操作?？刂破?6可以通信地耦合到系統(tǒng)20內(nèi)的各種組件，例如經(jīng)由有線或無線連接，以便發(fā)送和接收電子控制信號和在控制器36和通信耦合的組件之間的信息。例如，控制器36可以電子地開動系統(tǒng)20內(nèi)的閥和/或控制泵，以控制不同流體向和從疏水性材料30的移動?？刂破?6可以包括處理器和存儲器。存儲器可以存儲由控制器使用或生成的軟件和數(shù)據(jù)。存儲器可以包括計算機可讀介質(zhì)，諸如隨機存取存儲器(RAM)，只讀存儲器(ROM)，非易失性隨機存取存儲器(NVRAM)，電可擦除可編程只讀存儲器(EEPROM)，嵌入式動態(tài)隨機存取存儲器(eDRAM)，靜態(tài)隨機存取存儲器(SRAM)，閃速存儲器，磁性或光學(xué)數(shù)據(jù)存儲介質(zhì)。存儲器可以是或可以不是可移除的。在本公開中，處理器可以運行存儲在存儲器中的軟件以執(zhí)行歸屬于光學(xué)傳感器34和控制器36的功能。處理器可以包括一個或多個處理器，例如一個或多個微處理器，數(shù)字信號處理器(DSP)，專用集成電路(ASIC)，現(xiàn)場可編程門陣列(FPGA)，可編程邏輯電路等，前述是單獨的或以任何合適的組合形式存在。

如上面關(guān)于圖1所討論的，疏水性材料30可以與被分析的流體中存在的內(nèi)生孢子疏水結(jié)合，以從內(nèi)部流體的剩余部分濃縮和/或分離內(nèi)生孢子。疏水性材料30可以具有各種不同的構(gòu)造，并且可以用作其上捕獲并萌發(fā)內(nèi)生孢子的支撐表面。在一些實施例中，疏水性材料30是非多孔(例如，基本上無孔)材料。當(dāng)這樣構(gòu)造時，含有內(nèi)生孢子的流體可以穿過無孔材料的外表面并且被收集在腸內(nèi)表面(enteral surface)上。在其他實施例中，疏水性材料30是具有空隙空間的多孔材料，液體可以通過該空隙空間穿過材料的橫截面。在這些構(gòu)造中，含有內(nèi)生孢子的流體可以穿過疏水性材料的外表面和/或材料的內(nèi)表面，所述表面結(jié)合并限定提供材料孔隙率的空隙空間。

多孔疏水性材料可用于增加可用于通過疏水性吸引將內(nèi)生孢子從被分析的流體中捕獲出來的表面積的量。通常，增加含有內(nèi)含子的流體通過的疏水性材料30的表面積增加了流體中的內(nèi)生孢子將疏水地結(jié)合到材料并與剩余流體分離的可能性。攜帶內(nèi)生孢子的剩余部分可以由水和其它極性分子組成，可以繼續(xù)流動穿過材料的孔或空隙空間，并在材料的相對側(cè)排出。以這種方式，內(nèi)生孢子可以粘附到限定疏水性材料30的各種孔的壁表面，而剩余的載流體流動穿過該材料，分離和集中內(nèi)生孢子。

當(dāng)使用多孔材料實現(xiàn)疏水性材料30時，材料的孔可以尺寸足夠大以允許被分析的流體中的基本上所有(以及在其他實施例中，所有顆粒)流動穿過材料的孔。例如，疏水性材料30的孔可以大于通過疏水性吸引從被分析的流體捕獲的內(nèi)生孢子。換句話說，代替用作通過尺寸排阻分離內(nèi)生孢子的過濾器，疏水性材料30的孔可以足夠大以允許內(nèi)生孢子穿過疏水性材料。疏水性材料30和內(nèi)生孢子之間的疏水性吸引力可以將內(nèi)生孢子結(jié)合到材料上，并且防止內(nèi)生孢子通過材料的孔流出，即使內(nèi)生孢子小于材料的孔。當(dāng)這樣構(gòu)造時，疏水性材料30可以提供延伸通過材料的曲折(例如非線性)流體流動路徑，并且具有相對高的表面積，流體在內(nèi)生孢子捕獲期間流動穿過該表面。

在一些實施例中，疏水性材料30具有大于被分析的流體中的細菌內(nèi)生孢子的平均尺寸的平均孔徑，例如為細菌內(nèi)生孢子的平均尺寸的至少5倍、至少10倍、或至少100倍、或至少1000倍的平均孔徑。在一些另外的實施例中，孔徑的分布使得至少75％的孔為被分析的流體中的細菌內(nèi)生孢子的平均尺寸的至少5倍(在一些實施例中至少10倍)，例如至少90％的孔、至少95％的孔或至少99％的孔為被分析的流體中的細菌內(nèi)生孢子的平均尺寸的至少5倍(在一些實施例中至少10倍)。

疏水性材料30的孔的尺寸也可以根據(jù)被分析的流體內(nèi)的內(nèi)生孢子以外的顆粒的尺寸而變化，這將取決于被分析的流體的組成。在乳的情況下，例如，乳可以含有尺寸為約0.1微米的蛋白質(zhì)膠束，0.2微米至15微米的脂肪球，0.6微米至1微米的內(nèi)生孢子，1微米至5微米的細菌，和10微米至15微米的體細胞，以及其它顆粒。疏水性材料30可以具有尺寸大于流體中基本上所有顆粒的孔，以試圖允許非內(nèi)生孢子顆粒流動穿過材料而不堵塞孔。在一些實施例中，疏水性材料30具有大于被分析的流體中的顆粒的平均尺寸的平均孔徑，例如平均孔徑為流體中最小顆粒的平均尺寸的至少5倍(例如，顆粒的種類)、至少10倍、或至少100倍、或至少1000倍。在一些另外的實施例中，孔徑分布使得至少75％的孔為被分析的流體中最小顆粒的平均尺寸的至少5倍(在一些實施例中至少10倍)，例如至少90％的孔，至少95％的孔或至少99％的孔為被分析的流體中最小顆粒的平均尺寸的至少5倍(在一些實施例中至少10倍)。在一個實施例中，至少95％的孔的范圍是比被分析的流體中的最小尺寸類別的顆粒大10倍至大1000倍。

盡管疏水性材料30的孔的絕對尺寸可以基于所需的應(yīng)用而變化，但是在一些實施例中，疏水性材料具有大于25微米、例如大于50微米、大于100微米、或大于125微米的平均孔徑。在一些實施例中，疏水性材料的孔隙率為疏水性材料總體積的20％至材料總體積的70％。

疏水性材料30可以通過疏水性吸引從通過材料的流體中捕獲并收集內(nèi)生孢子。因此，疏水性材料30可以表現(xiàn)出足夠的疏水性以選擇性地與被分析的流體中的內(nèi)生孢子結(jié)合，同時允許攜帶內(nèi)生孢子的周圍流體穿過疏水性材料而不結(jié)合。在一些實施例中，疏水性材料30具有足夠的疏水性，使得存在于被分析的流體中的基本上所有的內(nèi)生孢子在穿過材料時與疏水性材料結(jié)合。在不同的構(gòu)造中，疏水性材料30可以在材料表面上捕獲存在于被分析的流體中的大于30％的內(nèi)生孢子、例如大于50％的內(nèi)生孢子、大于70％的內(nèi)生孢子、大于90％的內(nèi)生孢子、或大于95％的內(nèi)生孢子。穿過疏水性材料30的所得流體可以包含小于50％的存在于最初接觸材料的原始流體中的內(nèi)生孢子、例如小于40％的內(nèi)生孢子、小于30％的內(nèi)生孢子或小于10％的內(nèi)生孢子。由疏水性材料捕獲的內(nèi)生孢子的百分比可以通過調(diào)節(jié)材料的疏水性和/或流體遇到的疏水性材料的量來改變。

因為疏水性材料排斥水，所以材料的疏水性可以通過放置在材料上的水微滴與材料的表面之間的接觸角來表征。例如，疏水性材料30的水接觸角可以通過將一微滴水置于材料的表面上并測量液滴和/或測量在液體-表面界面處形成的潤濕角來確定。用于測量水接觸角的一種標(biāo)準(zhǔn)方法是通過測量臥滴的最大高度和寬度?；谝旱胃叨扰c液滴寬度的比率，根據(jù)已知的方程計算液滴和表面之間的接觸角。在一些實施例中，疏水性材料30顯示出與水的接觸角大于80度，例如大于90度的接觸角。

疏水性材料30可以由各種不同的材料構(gòu)成?？捎糜谥圃焓杷圆牧?0的實施例材料包括但不限于聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(例如)，乙烯丙烯二烯(EPDM)，丁腈橡膠(例如Buna-N)，聚對苯二甲酸乙二醇酯，脂族聚酰胺(例如尼龍)，芳族聚酰胺織物(例如)和不銹鋼。例如，疏水性材料30可以由燒結(jié)金屬粉末或多孔塑料形成。疏水性材料30可以或可以不進行表面處理以增加材料的疏水性。

疏水性材料30可以具有任何所需的尺寸和形狀。通常，疏水性材料30的尺寸將基于要分析的流體的量而變化，對于較大體積的流體使用較大體積的疏水性材料。疏水性材料30可以實現(xiàn)為平面材料片(例如，盤)，材料球，材料圓柱體(例如環(huán)(annulus))或任何其它期望的形狀。在一些實施例中，疏水性材料30被實現(xiàn)為含有內(nèi)生孢子的流體通過和/或穿過的單一結(jié)構(gòu)(例如，片)。在其他實施例中，可以緊鄰使用多個疏水結(jié)構(gòu)，例如，以提供含有內(nèi)生孢子的流體流動穿過的疏水性材料的填充床、柱或筒。

一般來說，前述實施例描述了使用疏水性材料從流體樣品中濃縮和/或分離細菌內(nèi)生孢子，然后萌發(fā)和光學(xué)分析以確定流體樣品中內(nèi)生孢子的濃度或計數(shù)。被描述為適于從流體捕獲和收集內(nèi)生孢子的疏水性材料可以用于除了通過光學(xué)分析定量內(nèi)生孢子之外的其它應(yīng)用中。例如，疏水性材料可以用于制造設(shè)備中，以通過使流體穿過疏水性材料來純化含有內(nèi)生孢子的流體。疏水性材料可捕獲流體中的內(nèi)生孢子并凈化流體以用于下游加工或銷售。例如，疏水性材料可以除去流體中存在的大于80％的內(nèi)生孢子、例如大于90％的內(nèi)生孢子或大于99％的內(nèi)生孢子。在這樣的應(yīng)用中，可以周期性地沖洗疏水性材料以除去捕獲的內(nèi)生孢子并重新打開表面區(qū)域以用于內(nèi)生孢子結(jié)合。在其他實施例中，疏水性材料可以在實驗室環(huán)境中用于從流體樣品中濃縮和/或分離細菌內(nèi)生孢子，而不隨后萌發(fā)和/或光學(xué)分析捕獲的內(nèi)生孢子。相反，濃縮和/或分離的內(nèi)生孢子可用于進行其他類型的實驗室分析。

此外，雖然前述實施例描述了使用疏水性材料通過疏水性吸引從通過材料的流體中捕獲和收集內(nèi)生孢子，但是在其他實施例中，可以從流體樣品中分離內(nèi)生孢子，而不依賴于疏水性吸引力。例如，基于尺寸排阻，機械過濾器可用于從周圍流體中分離內(nèi)生孢子。在這些實施例中，機械過濾器可以或可以不由疏水性材料制成。

以下實施例可提供關(guān)于根據(jù)本公開的系統(tǒng)和技術(shù)的額外細節(jié)。

實施例1

將含有不同細菌內(nèi)生孢子計數(shù)的各種乳溶液穿過具有約50％孔隙率(例如，從25％空隙空間至75％空隙空間)的疏水性材料。使50毫升乳穿過疏水性材料，隨后兩次連續(xù)沖洗，每次50毫升水。隨后，將2毫升L-丙氨酸(10mM)型萌發(fā)流體加入疏水性材料中，并在75攝氏度的溫度加熱15分鐘。然后將鋱試劑加入萌發(fā)流體中以形成鋱-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物。通過將光發(fā)射到流體樣品中并產(chǎn)生和檢測來自流體的熒光發(fā)射，對含有鋱-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的萌發(fā)流體進行熒光分析。

圖3是顯示實施例乳樣品的光學(xué)響應(yīng)的圖。圖的X軸是乳樣品中的內(nèi)生孢子計數(shù)水平。Y軸是從乳樣品產(chǎn)生的含有鋱-吡啶(-2,6-)二羧酸絡(luò)合物的萌發(fā)流體的光學(xué)響應(yīng)，以相對熒光單位計。

實施例2

為了評價疏水性材料孔徑對內(nèi)生孢子捕獲的影響，制備具有不同平均孔徑的疏水性材料，包括平均孔徑為65微米的孔徑和平均孔徑為125微米的孔徑。隨后，將50毫升內(nèi)生孢子計數(shù)為1×10²的乳穿過各疏水性收集材料。認(rèn)為內(nèi)生孢子的尺寸范圍為約0.7微米至約1微米。從疏水性收集材料排出的殘留乳再循環(huán)穿過材料，使得乳穿過疏水性材料三次。圖4是顯示在該過程之后捕獲的內(nèi)生孢子的數(shù)量與疏水性材料的表面積的圖。較大的表面積對應(yīng)于具有小的平均孔徑的疏水性材料。測試顯示，在第三次通過乳后，疏水性材料捕獲約50％的孢子至約70％的孢子。

圖5是在將乳穿過材料三次之后，在1毫米的分辨率下疏水性材料之一的顯微照片。該圖顯示了材料的總體結(jié)構(gòu)和實施例孔結(jié)構(gòu)的相對尺寸。圖6是圖5的顯微照片的100倍放大圖，顯示了粘附到材料表面的內(nèi)生孢子50。圖像表明內(nèi)生孢子通過疏水性吸引而不是機械尺寸排阻(例如過濾)被捕獲。

在該實施例中，隨后用50毫升水沖洗疏水性材料。測試顯示，在沖洗后，大于約99％至約99.9％的內(nèi)生孢子保持粘附于疏水性材料的表面。