專利名稱：基于補(bǔ)體因子h對(duì)腦膜炎奈瑟球菌血清殺菌活性的鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)抗體殺菌活性的鑒定。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是常見于健康青少年咽喉的一種共生生物(Maiden, Μ. C.等(2008) J Infect Dis. ；Mueller，J. Ε.等(2007)Emerg Infect Dis 13 :847-854 ；Trotter,C. L. ^ (2006)Epidemiol Infectl34 :556-566 ；Bogaert,D.等 (2005)Clin Infect Dis 40 :899-902 ；Verdu, Μ. E.等(2001)Epidemiol Infect 127 245-259 ；Ala' Aldeen, D. Α.等(2000) J ClinMicrobiol 38 :2311-2316)。在很少的情況下，該生物體侵入血流，并引起腦膜炎或迅速致死的膿毒癥。
據(jù)目前已知，確定該生物體為人病原體。腦膜炎球菌疾病的可靠動(dòng)物模型難以開發(fā)(Lewis, Τ.等(1943) J Clin Invest 22 :375-385 ；Ashton, F. Ε.等(1989)Microb Pathog 6 :455-458 ；Zarantonelli, M. L.等(2007) Infect Immun75 :5609-5614)。在人體中具有高致病性的很多腦膜炎奈瑟球菌包囊菌株易于從常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如兔(Lewis， Τ.等(1943) J Clin Invest 22 :375-385)、小鼠(Zarantonelli, Μ. L.等(2007) Infect Immun 75 :5609-5614 ；Oftung, F.等(1999)FEMS Immunol Med Microbiol 26:75-82; Holbein, B. Ε.等(1979nnfect Immun 24 =545-551)或大鼠(易變不定，參見下文)的血流中清除。此外，據(jù)報(bào)道，腦膜炎球菌菌株在年幼大鼠中引起菌血癥的能力不同(參見例如，Welsch，J. A.等(2004) J Immunol 172 :5606-5615, Hou, V. C.等(2005) J Infect Dis 192 :580-590 ；Toropainen, M.等(2005)Vaccine23 :4821-4833 ；Toropainen, M.等(2005) Infect Immun 73:4694-4703 ；Toropainen, Μ.等(2001)Microb Pathog 30 :139-148 ； Toropainen, Μ.等(2006)Infect Immun 74:2803—2808)。
腦膜炎奈瑟球菌與人的補(bǔ)體因子H(fH)結(jié)合(khne ider，Μ. C.等Q006) J Immunol 176 :7566-7575 ；Madico, G. ^ (2006) JImmunol 177 :501-510)，補(bǔ)體因子 H 是下調(diào)補(bǔ)體激活作用的分子。與fH的結(jié)合增強(qiáng)該生物體對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌作用的抗性，可能是使腦膜炎奈瑟球菌避開先天宿主防御的重要機(jī)制。淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)與fH 的結(jié)合限于人fH，這可部分解釋天然淋球菌感染的種特異性限制(Ngampasutadol，J.等 (2008) JImmunol 180 =3426-3435)。血清fH對(duì)人的腦膜炎球菌疾病易感性的重要性得到了強(qiáng)調(diào)，近來(lái)的流行病學(xué)觀察到，在CfH基因的啟動(dòng)子區(qū)中推定的NF-K B-應(yīng)答元件內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性(C-496T)與較高的血清fH水平OVC純合基因型)和增大的患腦膜炎球菌疾病風(fēng)險(xiǎn)(Haralambous, E.等(2006) Scand J Infect Dis 38 :764-771)相關(guān)。
相當(dāng)多的數(shù)據(jù)顯示，血清補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌抗體具有針對(duì)腦膜炎球菌疾病的保護(hù)作用(Goldschneider,I.等(1969) J Exp Med 129 :1307-1326 ；，I.等(1969) J Exp Med 129 1327-1348 ；Borrow，R.等(2005)Vaccine 23 :2222-2227 ；Balmer,P.等(2004)Expert Rev Vaccines 3 :77-87 ；Andrews, N^ (2003)ClinDiagn Lab Immunol 10 :780-786 ；Borrow, R. ^ (2001) Infect Immun69 :1568-1573)。在用人補(bǔ)體測(cè)定時(shí)，估計(jì)最小保護(hù)血清效價(jià)在 1 4到1 8之間。評(píng)價(jià)殺菌抗體效價(jià)已成為評(píng)價(jià)人對(duì)象是否具有針對(duì)奈瑟球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的黃金標(biāo)準(zhǔn)。
然而，人補(bǔ)體難以獲得(很大程度上由于大多數(shù)人血清具有對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的自然獲得抗體，使它們不適合作為人補(bǔ)體的來(lái)源)。必須對(duì)大量健康捐贈(zèng)者進(jìn)行篩選，其中顯示缺乏抗體的血清可提供合適的補(bǔ)體用于鑒定。因此，用于血清群A和C殺菌鑒定的若干標(biāo)準(zhǔn)化方案采用幼兔血清代替人血清作為補(bǔ)體來(lái)源(MaslankhS.E.等(1997)Clin Diagn LabImmunol 4 156-167 Jodar，L.等(2000)Biologicals 28:193-197)。采用兔血清作為補(bǔ)體來(lái)源的鑒定已廣泛用于推斷疫苗有效性并作為新腦膜炎球菌疫苗頒發(fā)許可的根據(jù)。雖然由于較易進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化而選擇兔補(bǔ)體用于這些方案，但多年來(lái)已知與用人補(bǔ)體測(cè)定的效價(jià)相比，兔補(bǔ)體會(huì)增大血清殺菌效價(jià)(Zollinger, W. D.等(1983) Infect Immun 40 :257-264 ； Santos, G. F.等(2001)Clin Diagn Lab Immunol 8:616-623)。雖然用兔補(bǔ)體測(cè)定的血清殺菌效價(jià)與引入大量人群的腦膜炎球菌疫苗接種的有效性相關(guān)聯(lián)(Borrow，R.等Q005) Vaccine 23 :2222-2227 ；Balmer,P.等(2004)Expert Rev Vaccines 3 :77-87 ；N等(2003) Clin Diagn Lab Immunol 10 :780-786)，但如果用人補(bǔ)體進(jìn)行測(cè)試，很多這些血清均缺乏殺菌活性。
因此，用兔補(bǔ)體觀察到的相關(guān)性可能無(wú)法精確或完全反映疫苗誘導(dǎo)抗體賦予的保護(hù)作用的實(shí)際機(jī)制。例如，在存在人補(bǔ)體且抗體濃度或質(zhì)量不足以引發(fā)殺菌活性但足以支持調(diào)理吞噬作用時(shí)，用兔補(bǔ)體測(cè)定的陽(yáng)性效價(jià)可以是清除腦膜炎奈瑟球菌替代機(jī)制的代替物(ffelsch,J. Α.等(2007)ClinVaccine Immunol 14 :1596-1602 ；Plested,J. S.等(2008) Clin Vaccine Immunol15 :799-804)。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了采用介導(dǎo)與奈瑟球菌H因子結(jié)合蛋白(fhBp)結(jié)合的具有人氨基酸序列的H因子多肽來(lái)檢測(cè)殺菌性抗奈瑟球菌抗體的鑒定方法，還提供了奈瑟球菌感染的非人動(dòng)物模型。
因此，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中殺菌性抗奈瑟球菌抗體的方法，所述方法包括將疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品、包含人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的 fH多肽、非人補(bǔ)體來(lái)源和奈瑟球菌在反應(yīng)混合物中混合，通過評(píng)價(jià)奈瑟球菌的生存力來(lái)檢測(cè)樣品中存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體，其中所述樣品存在下的奈瑟球菌生存力減小表示所述樣品包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述fH多肽是人fH多肽。 在其它實(shí)施方式中，所述fH多肽是包含非人動(dòng)物內(nèi)源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽， 所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人補(bǔ)體可以是例如兔補(bǔ)體、大鼠補(bǔ)體或小鼠補(bǔ)體。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌，其可來(lái)自任何莢膜群，例如群A、B、C、X、Y或W-135。在感興趣的實(shí)施方式中，所述樣品是人血清。
本發(fā)明還提供反應(yīng)混合物，其包含疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品、包含人保守序列重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子(fH)多肽(即不是可天然存在于待測(cè)樣品中的fH)、非人補(bǔ)體和奈瑟球菌。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述fH多肽是人fH多肽。在其它實(shí)施方式中，所述fH多肽是包含非人動(dòng)物內(nèi)源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人補(bǔ)體可以是例如兔補(bǔ)體、 大鼠補(bǔ)體或小鼠補(bǔ)體。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌，其可來(lái)自任何莢膜群，例如群A、B、C、X、Y或W-135。在感興趣的實(shí)施方式中，所述樣品是人血清。
本發(fā)明還提供包含一個(gè)或多個(gè)小瓶的試劑盒，所述小瓶包含包含人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子(fH)多肽和非人補(bǔ)體。所述試劑盒還包含奈瑟球菌的培養(yǎng)物作為檢測(cè)殺菌抗體的靶。在相關(guān)實(shí)施方式中，所述fH多肽是人fH多肽，且 /或可以是包含非人動(dòng)物內(nèi)源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述試劑盒的非人補(bǔ)體可以是例如兔補(bǔ)體、大鼠補(bǔ)體或小鼠補(bǔ)體。
本發(fā)明還提供非人動(dòng)物，其編碼含人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的H 因子(fH)多肽的基因組整合核酸，其中所述轉(zhuǎn)基因操作性連接于啟動(dòng)子以提供所述核酸在非人動(dòng)物中的表達(dá)，所述核酸在非人動(dòng)物中的表達(dá)提供結(jié)合奈瑟球菌的fH多肽的產(chǎn)生。 在相關(guān)實(shí)施方式中，所述fH多肽是人fH多肽，且/或可以是包含非人動(dòng)物內(nèi)源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人動(dòng)物可以是例如大鼠或小鼠。在一些實(shí)施方式中，用奈瑟球菌例如腦膜炎奈瑟球菌感染所述非人動(dòng)物。這樣的非人動(dòng)物模型可用于篩選對(duì)奈瑟球菌具有活性的候選試劑的方法，其中這樣的方法通常包括在用奈瑟球菌進(jìn)行感染之前、期間或之后將候選試劑給予所述非人動(dòng)物，檢測(cè)存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體的產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供奈瑟球菌感染的非人動(dòng)物模型，其包含包含人短同源重復(fù)序列 6 (SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的非人動(dòng)物宿主，其中所述fH多肽存在于非人動(dòng)物宿主的血流中；用奈瑟球菌進(jìn)行細(xì)菌感染，其中所述fH多肽存在于非人動(dòng)物的血清中。所述fH多肽可由整合到非人動(dòng)物基因組中的核酸編碼(因此表達(dá)到血流中)，且/或可通過對(duì)非人動(dòng)物宿主的血流從外源給藥而提供。所述fH多肽可以是人fH多肽或包含非人動(dòng)物內(nèi)源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。所述非人動(dòng)物宿主可以是例如大鼠或小鼠。所述奈瑟球菌可以是感興趣的腦膜炎奈瑟球菌菌株。
本發(fā)明還提供使用本文所述奈瑟球菌感染的非人動(dòng)物模型的方法，以篩選候選試劑用于促進(jìn)抗奈瑟球菌活性，所述方法包括將候選試劑給予用奈瑟球菌感染的非人動(dòng)物， 檢測(cè)候選試劑對(duì)所述非人動(dòng)物中奈瑟球菌的生存力存在或缺乏作用。
通過閱讀本發(fā)明，普通技術(shù)人員不難理解其它的方面和實(shí)施方式。
附圖簡(jiǎn)要說明


圖1的A-C顯示fH與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合的種特異性。(
圖1A)通過Western印跡測(cè)定的靈長(zhǎng)動(dòng)物fH與腦膜炎奈瑟球菌菌株H44/76的結(jié)合?？谷薴H抗體識(shí)別來(lái)自黑猩猩、狒狒和獼猴血清的fH的能力顯示于標(biāo)記為“僅血清”的泳道中，其包含來(lái)自所述各種靈長(zhǎng)動(dòng)物的以1 100稀釋的熱失活血清。標(biāo)記為“血清+細(xì)菌”的泳道包含用所述各種靈長(zhǎng)動(dòng)物血清培育的H44/76，具有H44/76而無(wú)血清(“無(wú)”)的泳道僅包含細(xì)菌。(
圖1B)和 (
圖1C)通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的加入大鼠(
圖1B)或兔(
圖1C)血清對(duì)生物素化人fH與腦膜炎奈瑟球菌細(xì)胞結(jié)合的作用。虛線表示不加生物素化人fH時(shí)的細(xì)菌細(xì)胞。實(shí)黑線表示不加血清時(shí)生物素化人fH的結(jié)合情況。實(shí)灰線表示存在40%熱失活人血清時(shí)生物素化人 fH的結(jié)合情況。填充的淺灰色區(qū)域表示存在40%熱失活大鼠或兔血清時(shí)生物素化人fH的結(jié)合情況。在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中均觀察到大鼠和兔血清而非人血清存在時(shí)生物素化人fH 的結(jié)合的類似抑制作用。
圖2顯示在年幼大鼠血清中加入人fH對(duì)腦膜炎奈瑟球菌存活率的作用。將細(xì)菌 (約10，000CFU/ml)懸浮在不同濃度的年幼大鼠血清中。將各血清分為兩等份，向其中加入50 μ g/ml或0 μ g/ml人fH。將血清和細(xì)菌在37°C培育1小時(shí)。虛線表示不加fH時(shí)血清中細(xì)菌存活率百分?jǐn)?shù)；實(shí)線表示包含人fH時(shí)血清中的存活率百分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)是來(lái)自每個(gè)菌株9-20個(gè)血清樣品的結(jié)果的平均值士95%置信區(qū)間。
圖3A和;3B顯示大鼠C3與腦膜炎奈瑟球菌的結(jié)合情況和人fH對(duì)大鼠C3結(jié)合的調(diào)控作用。(圖3A)大鼠C3與用年幼大鼠補(bǔ)體培育而不加人fH(Hu fH，實(shí)線)或包含25 μ g/ mi人fH(灰色陰影直方圖)的菌株H44/76和NZ98/2M的結(jié)合情況。(圖3B)人fH對(duì)大鼠 C3結(jié)合的濃度依賴性抑制作用。僅用10%年幼大鼠血清或用加入濃度范圍為50-6. 25 μ g/ ml的人fH的10%大鼠血清培育細(xì)菌。通過流式細(xì)胞術(shù)采用抗大鼠C3-FITC測(cè)定C3在細(xì)菌上的沉積。在類似條件下測(cè)定大鼠C3與作為替代途徑激活物的酵母聚糖的結(jié)合作為對(duì)照。X軸表示Iogltl度量的熒光，Y軸是事件數(shù)量。(圖3C)人fH與細(xì)菌的結(jié)合調(diào)控兔替代途徑激活作用。人fH(hfH)對(duì)兔C3結(jié)合腦膜炎球菌的劑量應(yīng)答性抑制作用。用包含劑量范圍為0-64 μ g/ml的hfH的經(jīng)Mg/EGTA處理的幼兔補(bǔ)體培育菌株A2594 (左圖)，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定與細(xì)菌結(jié)合的兔C3。將作為替代途徑激活物的酵母聚糖用作對(duì)照(右圖)， 以確保對(duì)兔C3結(jié)合的抑制作用不是非特異性補(bǔ)體抑制作用的結(jié)果。對(duì)照直方圖(不加血清)用虛線表示。
圖4顯示在用群B菌株H44/76對(duì)年幼大鼠進(jìn)行IP刺激之后人fH聯(lián)合給藥對(duì)菌血癥的作用。除給予動(dòng)物Oyg fH的動(dòng)物數(shù)量是10以外，各組均每組由15只大鼠組成。在細(xì)菌刺激后8小時(shí)獲得的血液培養(yǎng)物中測(cè)定菌血癥。用50 μ g人fH處理的大鼠的幾何平均CFU/ml高于用50 μ g人Cl酯酶抑制劑處理的對(duì)照(P < 0. 005)。給予每只大鼠50、10、 2或0 μ g人fH的四組的各自的幾何平均值具有顯著性(AN0VA測(cè)定P < 0. 02)。
圖5顯示加入人fH(25 μ g/ml)對(duì)用幼兔補(bǔ)體測(cè)定的血清群C血清殺菌效價(jià)的作用。在對(duì)用群C腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗免疫的11名成人或用四價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗免疫的19名4歲兒童進(jìn)行免疫之后獲得所述血清。
圖6顯示fH結(jié)合對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)殺死作用的抗性的作用。
圖7顯示人、黑猩猩、獼猴、大鼠和小鼠的fH的短同源重復(fù)序列6 (SCR6)的氨基酸序列。虛線表示的殘基與人fH氨基酸序列中的相應(yīng)殘基相同。
圖8顯示維斯達(dá)(Wistar)大鼠幼崽(F0代)中人fH表達(dá)的Western印跡。用抗人fH抗體探測(cè)所述印跡，加樣的人血清作為陽(yáng)性對(duì)照。
在描述本發(fā)明和本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于所述的具體實(shí)施方式
，因?yàn)樗鼈儺?dāng)然可能發(fā)生變化。還應(yīng)理解，本文所用術(shù)語(yǔ)的目的僅是描述具體實(shí)施方式
，不用來(lái)構(gòu)成限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求書的限制。
應(yīng)理解，提供數(shù)值范圍時(shí)，除非上下文中另有明確說明，該范圍上下限之間、以下限單位的十分之一為間隔的各間插數(shù)值，以及所述范圍的任何其它所述或間插數(shù)值均包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上下限可獨(dú)立地包括在所述較小范圍中，也包括在本發(fā)明內(nèi)， 除非所述范圍中存在任何明確排除的限值。所述范圍包括一個(gè)或兩個(gè)限值時(shí)，排除這一個(gè)或兩個(gè)所包括限值的范圍也包括在本發(fā)明中。
除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。雖然也可采用與本文所述的任何類似或等同的方法和材料實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但以下描述的是優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物均通過引用納入本文，以公開和描述與所引用出版物相關(guān)的方法和/或材料。這樣的出版物可列出與本發(fā)明明確或隱含的定義沖突的術(shù)語(yǔ)定義，該情況下以本發(fā)明的定義為準(zhǔn)。
必須注意到，本文和所附權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”、 “該”包括復(fù)數(shù)對(duì)象，除非上下文另有明確說明。因此，例如，提及“一個(gè)多肽”包括多個(gè)這樣的多肽，提及“所述細(xì)菌”包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌，等等。
提供本文討論的出版物僅因?yàn)槠涔_早于本申請(qǐng)的申請(qǐng)日。本文中所有內(nèi)容均不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明由于在先發(fā)明而不早于這樣的出版物。此外，所提供的出版日期可能與實(shí)際
公開日期不同，可能需要單獨(dú)確認(rèn)。
示例性實(shí)施方式的詳述 本發(fā)明提供了采用介導(dǎo)與奈瑟球菌H因子結(jié)合蛋白(fhBp)結(jié)合的具有人氨基酸序列的H因子多肽來(lái)檢測(cè)殺菌性抗奈瑟球菌抗體的鑒定方法，還提供了奈瑟球菌感染的非人動(dòng)物模型。
定義 “補(bǔ)體”指提供功能性補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的血清蛋白質(zhì)的集合，所述補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)是促進(jìn)細(xì)菌死亡的生化級(jí)聯(lián)系統(tǒng)。同樣地，本文所用的“補(bǔ)體”指可介導(dǎo)與經(jīng)典途徑、替代途徑或二者相關(guān)的功能性補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的血清蛋白質(zhì)的集合，還可包括可介導(dǎo)甘露糖結(jié)合凝集素途徑的血清蛋白質(zhì)。
“非人補(bǔ)體”指來(lái)自非人來(lái)源通常為哺乳動(dòng)物來(lái)源的補(bǔ)體，其包括但不一定限于嚙齒動(dòng)物補(bǔ)體(例如，大鼠補(bǔ)體、小鼠補(bǔ)體、兔補(bǔ)體)和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物補(bǔ)體(例如，黑猩猩補(bǔ)體、猴補(bǔ)體)等。
本文所用的“殺菌性抗體”指促進(jìn)補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)菌殺死作用的抗體。
“H因子結(jié)合蛋白”(fHBP)在文獻(xiàn)中也稱為GNA1870、GNA 1870、0RF2086、 LP2086(脂蛋白2086)，“741”指呈現(xiàn)在細(xì)菌表面的奈瑟球菌例如腦膜炎奈瑟球菌的多肽。 根據(jù)氨基酸序列可變性和免疫交叉反應(yīng)性(Masignani等J Exp Med 2003 ； 197 =789-99), 腦膜炎奈瑟球菌菌株已被細(xì)分為三個(gè)fHBP變體群(在一些報(bào)道(Masignani等2003，見上)中稱為變體1 (v. 1)、變體2 (v. 2)和變體3 (v. 3)，在其它報(bào)道(參見例如，F(xiàn)letcher等 2004 Infect Immun 2088-2100)中稱為家族A和B)。為清楚起見，本發(fā)明采用術(shù)語(yǔ)v. 1、 v. 2和v. 3。因?yàn)樽凅w2 (v. 2) fHBP蛋白(來(lái)自菌株8047)和變體3 (v. 3) fHBP蛋白(來(lái)自菌株M1239)的長(zhǎng)度與MC58的長(zhǎng)度分別具有_1和+7氨基酸殘基的差異，用來(lái)指代v. 2和 v. 3fHBP蛋白質(zhì)殘基的編號(hào)與基于這些蛋白質(zhì)實(shí)際氨基酸序列的編號(hào)不同。
“分離的”指感興趣的化合物(例如fH多肽)如果天然存在，其所在的環(huán)境與其可天然產(chǎn)生的環(huán)境不同?！胺蛛x的”用來(lái)包括充分富集感興趣的化合物和/或其中感興趣的化合物部分或充分純化的樣品內(nèi)的化合物。所述化合物不是天然存在時(shí)，“分離的”表示所述化合物已與由合成或重組手段對(duì)其進(jìn)行制備的環(huán)境隔離。
“富集”表示對(duì)樣品進(jìn)行非自然操作(例如通過實(shí)驗(yàn)者或臨床醫(yī)生)，使感興趣的化合物以大于(例如，至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍或更大)起始樣品如生物樣品(例如所述化合物天然產(chǎn)生或在給藥后存在于其中的樣品)或制備所述化合物的樣品(例如在細(xì)菌多肽、抗體、嵌合多肽等中的情況)中所述化合物的濃度存在。
“基本純”表示實(shí)體(例如多肽)的量大于組合物的總含量(例如組合物的總蛋白質(zhì))的約50%，通常大于總蛋白質(zhì)含量的約60%。更通常地說，“基本純”指組合物總量 (例如總蛋白質(zhì))的至少75%、至少75%、至少85%、至少90%或更多是感興趣的實(shí)體的組合物。優(yōu)選所述蛋白質(zhì)的量大于組合物中總蛋白質(zhì)的約90%，更優(yōu)選大于組合物中總蛋白質(zhì)的約95%。
術(shù)語(yǔ)“異源”指由來(lái)自不同來(lái)源的結(jié)構(gòu)定義的兩種組分。例如，在上下文中存在嵌合多肽而使用“異源”時(shí)，所述嵌合多肽包含可來(lái)自不同多肽的操作性連接的氨基酸序列 (例如，來(lái)自第一來(lái)源(例如人)fH多肽的第一組分和來(lái)自第二來(lái)源(例如兔)fH多肽的第二組分)。類似地，上下文中存在編碼嵌合多肽的多核苷酸時(shí)的“異源”包括可來(lái)自不同基因的操作性連接的核酸序列。其它示例性“異源”核酸包括表達(dá)構(gòu)建體，其中包含編碼序列的核酸操作性連接于來(lái)自不同于編碼序列來(lái)源的遺傳來(lái)源的調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)(例如，以提供在感興趣的宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述宿主細(xì)胞可來(lái)自相對(duì)于啟動(dòng)子、編碼序列或二者不同的遺傳來(lái)源)。例如，據(jù)稱，操作性連接于編碼fH多肽或其結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的T7 啟動(dòng)子是異源核酸。上下文中存在重組細(xì)胞時(shí)的“異源”可指存在與其存在的宿主細(xì)胞遺傳來(lái)源不同的核酸(或基因產(chǎn)物，如多肽)。
本文在上下文中存在嵌合fH多肽時(shí)所用的“異源”表示所述嵌合fH多肽包含操作性連接的至少兩個(gè)不同來(lái)源的不同fH多肽的結(jié)構(gòu)元件的鄰接氨基酸序列。例如，“異源 fH多肽”包括具有兔fH多肽氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列側(cè)接具有人CSR6序列的 CSR6結(jié)構(gòu)域。
上下文存在氨基酸序列或多核苷酸序列(例如，“衍生自”人fH多肽的氨基酸序列)時(shí)的“衍生自”用來(lái)表示所述多肽或核酸的序列基于參考多肽或核酸(例如，天然產(chǎn)生的人fH多肽或編碼核酸)的序列，而不用來(lái)對(duì)所述蛋白質(zhì)或核酸制備的來(lái)源或方法構(gòu)成限制。上下文中存在細(xì)菌菌株時(shí)的“衍生自”用來(lái)表示通過體內(nèi)或體外培養(yǎng)親本菌株獲得的菌株和/或通過修飾親本菌株獲得的重組細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)“保護(hù)性免疫”指給予哺乳動(dòng)物的疫苗或免疫方案誘導(dǎo)防止、延遲由腦膜炎奈瑟球菌引起的疾病的發(fā)展、降低所述疾病的嚴(yán)重程度或減少或一并消除所述疾病癥狀的免疫應(yīng)答。保護(hù)性免疫可伴隨殺菌性抗體的產(chǎn)生。應(yīng)注意，針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的殺菌性抗體的產(chǎn)生在所述領(lǐng)域中被接受為預(yù)示疫苗在人中具有保護(hù)作用(Goldschneider等，1969， J. Exp. Med. 129 1307 ；Borrow φ 2001 Infect Immun. 69 156 。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”在本文中用來(lái)描述已被或即將被人工插入到非人動(dòng)物基因組特別是活的非人哺乳動(dòng)物(例如嚙齒動(dòng)物，如大鼠、小鼠)細(xì)胞中的遺傳材料。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”指具有整合到所述動(dòng)物一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞基因組中的轉(zhuǎn)基因元件的非人動(dòng)物。因此，本文所用的“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”包括所有或幾乎所有細(xì)胞包含遺傳修飾的動(dòng)物(例如，完全轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、具有可遺傳轉(zhuǎn)基因的特定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)，以及動(dòng)物中細(xì)胞亞組經(jīng)修飾包含基因組整合轉(zhuǎn)基因的嵌合轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
靶基因“敲除”指導(dǎo)致靶基因功能降低的基因序列的改變。特別感興趣的“敲除” 是指靶基因的表達(dá)不可檢測(cè)或不顯著的敲除。例如，受體基因的敲除指所述受體功能顯著降低，使結(jié)合其正常配體的受體活性不可檢測(cè)或處于不顯著水平。功能降低可由遺傳改變引起的全長(zhǎng)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生減少或相對(duì)于天然基因產(chǎn)物具有功能缺陷的改變的基因產(chǎn)物產(chǎn)生而造成。本發(fā)明的“敲除”轉(zhuǎn)基因?qū)W可以是雜合或純合敲除靶基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?！扒贸边€包括條件性敲除，其中靶基因的改變可由例如使動(dòng)物接觸促進(jìn)靶基因改變的物質(zhì)而發(fā)生。
基因“敲入”指向基因組加入編碼感興趣的基因產(chǎn)物的核酸，其可伴隨相應(yīng)內(nèi)源基因的敲除。可將這樣的“敲入”基因重組到基因組中，使其受調(diào)控的方式與內(nèi)源基因的方式相當(dāng)。所述轉(zhuǎn)基因可以是內(nèi)源基因的修飾形式(例如在嵌合fH多肽中的情況)?！扒萌搿鞭D(zhuǎn)基因?qū)W可具有雜合或純合的遺傳改變?！扒萌搿边€包括條件性敲入。
概述 本發(fā)明提供方法和組合物，其利用了關(guān)于人H因子(fH)可介導(dǎo)腦膜炎奈瑟球菌對(duì)非人補(bǔ)體(例如，兔補(bǔ)體、大鼠補(bǔ)體)的補(bǔ)體介導(dǎo)殺死作用的抗性的觀察。該觀察可用來(lái)提供可評(píng)價(jià)采用人fH和非人補(bǔ)體來(lái)源的抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的補(bǔ)體介導(dǎo)殺死作用的鑒定，以降低假陽(yáng)性結(jié)果(即鑒定顯示樣品包含殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌抗體而其實(shí)際并不包含，或顯示其包含的殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌水平高于其實(shí)際水平的結(jié)果)的發(fā)生率和 /或程度。向這樣的鑒定中加入人fH可更精確地模擬人體內(nèi)的情況，即fH與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合并抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)菌殺死作用，由此可能破壞人血清中可能存在的抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的殺菌活性。本發(fā)明的鑒定提供的額外優(yōu)點(diǎn)在于，采用非人補(bǔ)體(例如大鼠或兔補(bǔ)體)進(jìn)行這樣的鑒定，由此避免了采用人補(bǔ)體的需求。人補(bǔ)體來(lái)源價(jià)格昂貴，至少部分是由于這樣的鑒定需要人補(bǔ)體不含抗腦膜炎奈瑟球菌抗體，其可能增大假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生率。因此，利用關(guān)于分離的人fH可與非人補(bǔ)體因子協(xié)同發(fā)揮作用的發(fā)現(xiàn)，以提供對(duì)人免疫更為相關(guān)的反映和相比采用非人補(bǔ)體的常規(guī)鑒定方法價(jià)格更為低廉的鑒定。
本發(fā)明還利用了關(guān)于人fH可在非人補(bǔ)體存在時(shí)發(fā)揮作用的發(fā)現(xiàn)，以提供腦膜炎奈瑟球菌感染的非人動(dòng)物模型。由于非人fH不與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合，因此非人fH不提供對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)殺死作用的抗性，消除了腦膜炎奈瑟球菌對(duì)非人動(dòng)物的感染，由此破壞對(duì)提供感染的非人動(dòng)物模型的嘗試。本發(fā)明的非人動(dòng)物模型提供具有結(jié)合腦膜炎奈瑟球菌的 fH的非人動(dòng)物。所述“結(jié)合腦膜炎奈瑟球菌的fH”指包含介導(dǎo)與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合的人 fH的氨基酸序列即人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列，對(duì)其更詳細(xì)的描述見下文。 因此，所述結(jié)合腦膜炎奈瑟球菌的fH可以是人fH，可通過以下方式提供在例如被動(dòng)保護(hù)的體內(nèi)小鼠或年幼大鼠模型中給予奈瑟球菌(例如腦膜炎奈瑟球菌)接種物(例如，采用胃腸外(如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi))或鼻內(nèi)刺激)之前、同時(shí)或之后給予人fH(例如胃腸外給藥，如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下)；表達(dá)非人動(dòng)物中存在的人fH編碼轉(zhuǎn)基因；“人源化”非人動(dòng)物fH 編碼基因的SCR 6氨基酸序列；和/或表達(dá)來(lái)自非人動(dòng)物中存在的轉(zhuǎn)基因的這樣的“人源化” fH。
對(duì)示例性實(shí)施方式更詳細(xì)的描述見下文。
H 因子(FHBP)多肽 “ H因子多肽”、“ H因子”、“補(bǔ)體因子H”、“ H因子蛋白”、“ fH”、“ fH蛋白”和“ fH多肽”在本文中可互換使用以指代調(diào)節(jié)補(bǔ)體途徑的多肽，其在包含人fH多肽的短同源重復(fù)結(jié)構(gòu)域6(SCR6)時(shí)通過奈瑟球菌蛋白H因子結(jié)合蛋白(fHbp)與奈瑟球菌結(jié)合。在人中，H因子是補(bǔ)體激活作用調(diào)節(jié)子(RCA)基因簇的成員，編碼具有20個(gè)短同源重復(fù)序列(SCR)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在體內(nèi)，fH分泌到血流中，在調(diào)節(jié)補(bǔ)體激活中發(fā)揮作用，在清除細(xì)菌感染中具有特定作用。
“包含人短同源重復(fù)序列6 (SCR6)氨基酸序列的H因子(fH)多肽”指包含fH多肽氨基酸序列的多肽，其包含或經(jīng)修飾包含具有人fH多肽的人SCR6氨基酸序列的短同源重復(fù)結(jié)構(gòu)域6 (SCR6)。因此，“包含人SCR6氨基酸序列的fH多肽”包括完整的人fH多肽及其片段，以及包含操作性連接于非人fH氨基酸序列的人SCR6氨基酸序列的嵌合多肽，條件為所述多肽具有與奈瑟球菌(例如腦膜炎奈瑟球菌)H因子結(jié)合蛋白結(jié)合的活性。
術(shù)語(yǔ)“短同源重復(fù)結(jié)構(gòu)域6”在本文中也稱為“短同源重復(fù)序列6”和“SCR6”，三者可互換使用，指在人H因子中將H因子的結(jié)合能力賦予奈瑟球菌fHbp的H因子多肽結(jié)構(gòu)域?！叭薙CR6”指具有SEQ ID NO :1氨基酸序列的多肽(以及編碼這樣的多肽的核酸，從使用時(shí)的上下文不難理解)。圖7顯示黑猩猩(SEQ ID NO 2)、獼猴(SEQ ID NO 3)、大鼠 (SEQ IDNO 4)和小鼠(SEQ ID NO :5)SCR6的氨基酸序列。
可從任何合適的來(lái)源獲得適合用于本文所述方法的fH多肽。例如，所述fH多肽是人fH多肽時(shí)，可通過從天然產(chǎn)生所述多肽或經(jīng)遺傳修飾產(chǎn)生所述多肽的來(lái)源(例如重組來(lái)源)分離獲得所述人fH多肽。
已知各種哺乳動(dòng)物來(lái)源的編碼fH多肽的核酸，以及編碼的fH多肽的核酸序列和氨基酸序列。對(duì)人fH多肽及其編碼核酸的描述見例如GenBank登錄號(hào)NM_000186，對(duì)可變剪接多肽變體的描述見GenBank登錄號(hào)NM_001014975。其它示例性哺乳動(dòng)物fH多肽(核酸和多肽序列)為本領(lǐng)域已知，包括但不限于小鼠(GenBank登錄號(hào)NM_009888)、大鼠、靈長(zhǎng)動(dòng)物(例如，黑猩猩、猴(例如獼猴))和綿羊(GenBank登錄號(hào)EU888587)。
可通過本領(lǐng)域可利用和已知的任何合適的方法改造包含人CSR6氨基酸序列的嵌合fH多肽。例如，可采用本領(lǐng)域眾所周知的重組方法用編碼人SCR6的核酸片段代替編碼非人哺乳動(dòng)物fH多肽的核酸編碼序列。或者或此外，可通過定點(diǎn)突變修飾編碼序列來(lái)產(chǎn)生這樣的嵌合fH多肽，以編碼人SCR6的氨基酸殘基。其它可利用的技術(shù)包括對(duì)fH編碼DNA 進(jìn)行核酸擴(kuò)增，將擴(kuò)增的序列或消化的片段克隆到含啟動(dòng)子和PolyA尾的載體中以形成fH 編碼構(gòu)建體。在適合的情況下可通過合成技術(shù)產(chǎn)生包括嵌合fH多肽在內(nèi)的fH多肽。
可采用本領(lǐng)域眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)表達(dá)方法在體外或體內(nèi)將核酸構(gòu)建體表達(dá)為蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生包含人SCR6的嵌合多肽。也可將這樣的改造核酸構(gòu)建體引入到非人動(dòng)物的基因組中，以便表達(dá)為轉(zhuǎn)基因基因產(chǎn)物。
fH多肽的生產(chǎn)方法可包括任何合適的構(gòu)建體和任何合適的宿主細(xì)胞，其可以是原核或真核細(xì)胞，通常為哺乳動(dòng)物、細(xì)菌或酵母宿主細(xì)胞。將遺傳材料引入到宿主細(xì)胞中的方法包括例如，轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合、磷酸鈣法等?？蛇x擇轉(zhuǎn)移的方法以使引入的fH多肽編碼核酸穩(wěn)定表達(dá)?？梢钥蛇z傳的游離元件(例如質(zhì)粒)的形式提供這樣的核酸，或可對(duì)其進(jìn)行基因組整合。
轉(zhuǎn)移感興趣核酸的合適載體的組成可不同。整合載體可以是條件性復(fù)制或自殺質(zhì)粒、噬菌體等。所述構(gòu)建體可包括各種元件，包括例如，啟動(dòng)子、選擇性遺傳標(biāo)記(例如，具有抗生素抗性的基因(例如，卡那霉素、紅霉素、氯霉素或慶大霉素))、復(fù)制起點(diǎn)(以促進(jìn)在宿主細(xì)胞例如細(xì)菌宿主細(xì)胞中的復(fù)制)等。對(duì)載體的選擇取決于各種因素，如需要增殖的細(xì)胞類型和增殖的目的。某些載體可用于擴(kuò)增和制備大量所需DNA序列。其它載體適合用于在培養(yǎng)物的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。還有其它載體適合用于在整個(gè)動(dòng)物的細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)移和表達(dá)。對(duì)合適載體的選擇是本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)。很多這樣的載體可市售購(gòu)得。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述載體是表達(dá)載體，其基于包含選擇性藥物抗性標(biāo)記和提供在不同宿主細(xì)胞(例如在大腸桿菌(E.coli)和腦膜炎奈瑟球菌二者)中自主復(fù)制的元件的游離質(zhì)粒。這樣的“穿梭載體”的一個(gè)例子是質(zhì)粒PFPlO (Pagotto等Gene 2000244 13-19)。
可通過例如將感興趣的多核苷酸插入到構(gòu)建體主鏈中，通過采用DNA連接酶連接到載體中切割的限制性酶位點(diǎn)來(lái)制備構(gòu)建體?；蛘撸赏ㄟ^同源重組或位點(diǎn)特異性重組插入所需核苷酸序列。通常通過將同源區(qū)域與載體在所需核苷酸序列的側(cè)翼連接來(lái)完成同源重組，而通過采用促進(jìn)位點(diǎn)特異性重組的序列(例如，Cre-l0X、att位點(diǎn)等)來(lái)完成位點(diǎn)特異性重組?？赏ㄟ^例如連接寡核苷酸或采用同時(shí)包含同源區(qū)域和所需核苷酸序列一部分的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)加入包含這樣序列的核酸。
載體可在宿主細(xì)胞中保持處于染色體外，或可整合到宿主細(xì)胞基因組中。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的大量出版物詳細(xì)描述了載體，所述出版物包括例如，《分子生物學(xué)簡(jiǎn)明實(shí)驗(yàn)方案》(Short Protocols in MolecularBiology)，(1999) F. Ausubel 等編，韋利&森斯出版公司(Wiley&Sons)。載體可表達(dá)編碼嵌合fHBP的核酸，可擴(kuò)增所述對(duì)象核酸，或二者兼有。
可采用的示例性載體包括但不限于衍生自重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA的載體。例如，可采用質(zhì)粒載體如pBR322、pUC 19/18、pUC118、119和M13mp系列載體。pET21 也是可采用的表達(dá)載體。噬菌體載體可包括AgtlO、AgtlU Agtl8-23、λ ZAP/R和EMBL 系列噬菌體載體?？衫玫钠渌d體包括但不限于，pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、 pMCS、pNNL、pHSG274、C0S202、C0S203、pWE15、pffE16 和卡隆粒 9 系列載體。
就表達(dá)感興趣的fH多肽而言，可采用表達(dá)盒。因此，本發(fā)明提供包含對(duì)象核酸的重組表達(dá)載體。所述表達(dá)載體提供轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列，并可提供誘導(dǎo)型或組成型表達(dá)，其中在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)的轉(zhuǎn)錄控制下操作性連接編碼區(qū)。這些控制區(qū)可以是天然產(chǎn)生的fH多肽先天具有的，或可衍生自外源。通常，所述轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列可包括但不限于，啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強(qiáng)子或激活物序列。啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型，并可以是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子(例如 T7 等)。
表達(dá)載體通常具有位于啟動(dòng)子序列附近的方便的限制性位點(diǎn)，以便插入編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸序列。可存在在表達(dá)宿主中可操作的選擇性標(biāo)記以促進(jìn)對(duì)包含所述載體的細(xì)胞進(jìn)行選擇。此外，所述表達(dá)構(gòu)建體可包含其它元件。例如，所述表達(dá)載體可具有一個(gè)或多個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，由此使其能保持于用于表達(dá)的生物例如哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中和用于克隆和擴(kuò)增的原核宿主中。此外，所述表達(dá)構(gòu)建體可包含選擇性標(biāo)記基因以允許對(duì)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。選擇基因在本領(lǐng)域中眾所周知，隨采用的宿主細(xì)胞而變化。
應(yīng)注意，重組fH多肽可包含其它元件，如可檢測(cè)標(biāo)記，例如，放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記和免疫可檢測(cè)標(biāo)記(例如，HA標(biāo)簽、多組氨酸標(biāo)簽)等?？商峁┻@樣的其它元件以促進(jìn)通過各種方法(例如親和捕獲等)進(jìn)行分離(例如，生物素標(biāo)簽、免疫可檢測(cè)標(biāo)簽)。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法完成對(duì)感興趣多肽的分離和純化。例如，可通過免疫親和純化從經(jīng)遺傳修飾表達(dá)fH多肽的細(xì)胞的裂解物分離fH多肽，其通常包括使所述樣品接觸抗fH多肽抗體，洗滌以去除非特異性結(jié)合的材料，洗脫特異性結(jié)合的fH多肽。可通過透析和其它通常用于蛋白質(zhì)純化的方法來(lái)進(jìn)一步純化分離的fH多肽。可提供純化的fH多肽， 使所述多肽存在于基本不含其它表達(dá)多肽的組合物中，例如，所述組合物少于90%、通常少于60 %、更通常少于50 %的部分由其它表達(dá)多肽組成。
殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的檢測(cè)鑒定 如上所述，本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中殺菌性抗奈瑟球菌抗體的方法和組合物。采用包含人短同源重復(fù)序列6 (SCR6)氨基酸序列的分離的H因子多肽和非人補(bǔ)體來(lái)提供評(píng)價(jià)抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的補(bǔ)體介導(dǎo)殺死作用的鑒定。這樣的鑒定可降低假陽(yáng)性結(jié)果(即鑒定顯示樣品包含殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌抗體而其實(shí)際并不包含，或顯示樣品包含的殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌水平高于其實(shí)際水平的結(jié)果)的發(fā)生率和/或程度。向這樣的鑒定中加入包含人SCR6的分離的H因子多肽相比傳統(tǒng)鑒定可更精確地模擬人體內(nèi)的情況，因?yàn)槿薴H 的SCR6結(jié)構(gòu)域與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合并抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)菌殺死作用，由此可能破壞可能存在于人血清中的抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的殺菌活性。本發(fā)明的鑒定提供的額外優(yōu)點(diǎn)在于，采用非人補(bǔ)體(例如大鼠或兔補(bǔ)體)進(jìn)行這樣的鑒定，由此避免了采用人補(bǔ)體的需求。 因此，利用關(guān)于人fH可與非人補(bǔ)體因子協(xié)同發(fā)揮作用的發(fā)現(xiàn)，以提供相比采用人補(bǔ)體的常規(guī)鑒定方法更精確、價(jià)格更低廉的鑒定。
所述方法通常包括將疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品、包含人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子多肽、非人補(bǔ)體和奈瑟球菌在反應(yīng)混合物中混合，評(píng)價(jià)奈瑟球菌的生存力，其中所述樣品存在下的奈瑟球菌生存力減小表示所述樣品包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體。
人fH或包含人短同源重復(fù)序列(SCR 6)氨基酸序列的分離的H因子多肽也可用于采用非人補(bǔ)體評(píng)價(jià)抗奈瑟球菌抗體的調(diào)理吞噬(opsonophagocytic)活性。調(diào)理吞噬作用鑒定通常包括將疑似包含調(diào)理吞噬性抗奈瑟球菌抗體的樣品、作為吞噬作用效應(yīng)細(xì)胞的外周血單核白細(xì)胞或在組織培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的單核細(xì)胞細(xì)胞系、包含人短同源重復(fù)序列 6(SCR6)的氨基酸序列的分離的H因子多肽、非免疫非人補(bǔ)體和奈瑟球菌在反應(yīng)混合物中混合，評(píng)價(jià)奈瑟球菌的生存力，其中所述樣品存在下的奈瑟球菌生存力減小表示所述樣品包含調(diào)理吞噬性抗奈瑟球菌抗體。對(duì)測(cè)試樣品(即對(duì)調(diào)理吞噬性抗奈瑟球菌抗體的存在接受評(píng)價(jià)的樣品)進(jìn)行熱失活以去除任何內(nèi)部補(bǔ)體活性。對(duì)測(cè)定調(diào)理吞噬活性的鑒定及其在評(píng)價(jià)抗奈瑟球菌抗體中的應(yīng)用的描述見Plested J. S.和Granoff D. M. , Clin Vaccine Immunol2008,15(5) :799-804 和 GranoffDM，Vaccine, 2009 ( “補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌和調(diào)理活性對(duì)腦膜炎疾病保護(hù)作用的相對(duì)重要性(Relative importance ofcomplement-mediated bactericidal and opsonic activity for protection againstmeningococcal disease) ” Doi :10. 1016/j. vaccine. 2009. 04. 066)。
樣品 可鑒定疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的任何樣品，例如從對(duì)象(例如，血液或血液成分(例如血清)、粘膜分泌物、組織等)、從細(xì)胞培養(yǎng)物(例如從抗體分泌細(xì)胞(例如雜交瘤)的上清液)獲得的生物樣品。所述血清樣品可用緩沖液例如杜貝克(Dulbecco) 緩沖液稀釋，并可作為系列稀釋物進(jìn)行測(cè)試以促進(jìn)對(duì)抗體效價(jià)的評(píng)價(jià)。通常，所述樣品可能包含補(bǔ)體(例如在血清樣品中的情況)時(shí)，例如通過加熱(例如在56°C進(jìn)行約30分鐘)處理所述樣品以使內(nèi)源補(bǔ)體失活。樣品在使用前可以是新鮮的或冷凍的。評(píng)價(jià)樣品以確定疫苗引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體的有效性時(shí)，可在免疫對(duì)象之前和之后獲得所述樣品。
非人補(bǔ)體 用于所述鑒定的非人補(bǔ)體可來(lái)自任何合適的來(lái)源，通常為哺乳動(dòng)物來(lái)源。補(bǔ)體的示例性來(lái)源包括兔類動(dòng)物(例如兔)、嚙齒動(dòng)物(大鼠、小鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠等)、有蹄類動(dòng)物 (例如，牛、綿羊、山羊、豬)和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物(猴、猿、黑猩猩)，可以是年幼動(dòng)物(例如，幼兔、年幼大鼠等)。非人補(bǔ)體可市售購(gòu)得，或可根據(jù)本領(lǐng)域已知方法很容易地從血清獲得。所述非人補(bǔ)體通常不包含或經(jīng)處理而不包含可檢測(cè)的殺菌活性。這可通過例如采用來(lái)自年幼動(dòng)物的血清或處理來(lái)自年老動(dòng)物的非人血清以在用于鑒定之前消除抗體(例如采用抗IgG 親和柱)來(lái)完成。作為對(duì)照的樣品在鑒定中非人補(bǔ)體的量可不同，或可提供與各測(cè)試樣品 (例如作為標(biāo)準(zhǔn))中幾乎相同的量。例如，所述反應(yīng)混合物可在血清中包含約10%-25% (體積/體積)非人補(bǔ)體。
可向反應(yīng)混合物中加入不同量的非人補(bǔ)體，以提供具有不同已知量的非人補(bǔ)體的反應(yīng)樣品。可平行鑒定這樣的樣品以促進(jìn)對(duì)殺菌性抗體效價(jià)的檢測(cè)。
奈瑟球菌 任何合適的奈瑟球菌，特別是表達(dá)表面fHbp的奈瑟球菌均可用作本文所述鑒定中檢測(cè)殺菌性抗體的靶細(xì)菌。這樣的奈瑟球菌包括腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌?？筛鶕?jù)待鑒定的殺菌性抗體的特異性選擇所述靶細(xì)菌。例如，所述鑒定用來(lái)提供對(duì)殺菌性抗腦膜炎奈瑟球菌抗體的檢測(cè)時(shí)，所述靶細(xì)菌可以是任何合適的腦膜炎奈瑟球菌，例如，群A、B、 C、X、Y或W-135，或感興趣的任何其它莢膜群的腦膜炎奈瑟球菌、表達(dá)特定感興趣的抗原的腦膜炎奈瑟球菌菌株(例如，v. 1、v. 2或v. 3fHbp，包括fHbp亞變體，PorA型等)。所述鑒定可與經(jīng)遺傳修飾而表達(dá)感興趣的抗原的奈瑟球菌聯(lián)用。例如，可選擇所述靶細(xì)菌以促進(jìn)對(duì)用疫苗免疫之后殺菌性抗奈瑟球菌抗體的產(chǎn)生進(jìn)行分析。
在用于鑒定之前，可通過本領(lǐng)域已知方法，例如在肉湯(例如穆勒-辛頓 (Mueller-Hinton)肉湯)中或在瓊脂平板(例如巧克力瓊脂平板)上培養(yǎng)所述靶細(xì)菌。如果在瓊脂平板上培養(yǎng)，從所述瓊脂平板上去除所述細(xì)菌并將其重懸浮。如果在液體肉湯中培養(yǎng)，可離心所述細(xì)菌并將其重懸浮。通常提供所需細(xì)胞數(shù)量的細(xì)菌，并可提供細(xì)胞數(shù)量不同的樣品作為對(duì)照。例如，可以約IO5-IO8集落生成單位(CFU)/ml，通常為約切IO7CFU/ml的細(xì)胞密度重懸浮細(xì)菌。可選擇重懸浮溶液以可與檢測(cè)鑒定相容使用，所述溶液例如緩沖液，通常為補(bǔ)充有MgCl2和CaCl2 WHBSS(漢克斯堿性鹽溶液(Hanks Basic Salt Solution))或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。
在用于鑒定之前，可洗滌所述細(xì)菌一次或多次以去除配培養(yǎng)肉湯的組分。例如，可用緩沖液(例如包含牛血清白蛋白)和/或用熱失活血清(例如消除IgG，例如以使包含的 IgG不可檢測(cè))洗滌所述細(xì)菌。洗滌通常包括將所述細(xì)菌重懸浮在溶液中，通過離心沉淀所述細(xì)菌細(xì)胞，例如用反應(yīng)混合物緩沖液重懸浮所述細(xì)菌以便用于鑒定。
fH多月太 本文所述的具有人SCR6氨基酸序列的任何合適的fH多肽均可用于所述鑒定。特別感興趣的是采用完整的人fH多肽和其保持與fHbp結(jié)合和調(diào)節(jié)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的活性的片段。包括SCR6在內(nèi)的H因子若干結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)已被破解，可為產(chǎn)生感興趣的片段提供指導(dǎo)。可向反應(yīng)混合物中加入任何合適量例如約5-6μ g/ml、10y g/ml、12y g/ml、20y g/ ml,25 μ g/ml、50 μ g/ml或更多的fH多肽。采用的量根據(jù)反應(yīng)混合物是否包含鈣螯合劑而變化(例如，以檢測(cè)獨(dú)立于補(bǔ)體活性經(jīng)典途徑的替代途徑)。
反應(yīng)混合物 通過將鑒定試劑(包含含人SCR6氨基酸序列的分離的H因子多肽和非人補(bǔ)體)、 奈瑟球菌和測(cè)試樣品以任何合適的順序混合來(lái)制備所述鑒定的反應(yīng)混合物。可通過將這些組分在任何合適的容器，如試管、平板孔或毛細(xì)管中混合來(lái)產(chǎn)生所述反應(yīng)混合物。通常用緩沖液，特別是生理相容性緩沖液例如PBS或本文示例的其它合適的緩沖液懸浮所述反應(yīng)混合物。所述反應(yīng)混合物的反應(yīng)體積可不同，通常為數(shù)微升到數(shù)毫升(例如， οομ 1、500μ 1、 Iml等)?？商峁┰诜磻?yīng)混合物中具有不同稀釋度例如1 2、1 4、1 6、1 8、1 10、 1 12、1 14、1 16、1 18、1 20、1 22、1 24或更大以及類似稀釋度的樣品，，其中感興趣的是14和更大的稀釋度。
在適合補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌性抗體活性的條件下培育所述反應(yīng)混合物。例如，可將所述反應(yīng)混合物在合適的溫度(例如環(huán)境溫度或生理學(xué)相關(guān)溫度(例如約37°C ))下培育一段時(shí)間，所述時(shí)間足以產(chǎn)生補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌性抗體活性(例如，約15分鐘-90分鐘、約30 分鐘-90分鐘等)。除測(cè)試樣品以外，可提供對(duì)照樣品。這樣的對(duì)照樣品可包括陰性對(duì)照樣品(例如與測(cè)試樣品條件平行但不加生物樣品、不加fH、不加非人補(bǔ)體或加入殺菌活性不可檢測(cè)的抗體的樣品)和/或陽(yáng)性對(duì)照樣品(例如與測(cè)試樣品條件平行但加入對(duì)靶細(xì)菌具有已知?dú)⒕钚缘目贵w的樣品)。
檢測(cè) 用測(cè)試樣品培育之后，通過評(píng)價(jià)反應(yīng)混合物中奈瑟球菌的生存力來(lái)檢測(cè)存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體。這可通過例如以下步驟完成將所述反應(yīng)混合物接種在合適的培養(yǎng)基(例如瓊脂平板)上，評(píng)價(jià)集落生成單位，在肉湯中培養(yǎng)所述反應(yīng)混合物，通過細(xì)胞密度、FACS(參見例如，Mountzouros等“在群B腦膜炎奈瑟球菌的基于熒光的血清殺菌鑒定中檢測(cè)補(bǔ)體介導(dǎo)的抗體依賴性殺菌活性(Detection of Complement MediatedAntibody-Dependent Bactericidal Activity in a Fluorescence-Based SerumBactericidal Assay for Group B Neisseria meningitidis)” (2000)J. Clin. Microbiol. 38 :2878-2884)等評(píng)價(jià)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況(例如通過分光光度吸收)。將殺菌效價(jià)定義為觀察到活奈瑟球菌減少(例如每毫升CFU降低)時(shí)的血清稀釋度，通常為與在零時(shí)間(或60分鐘之后或在陰性對(duì)照血清中培育)的對(duì)照相比引起生存力下降50%或90% (例如每毫升CFU降低50%)的稀釋度。結(jié)果也可描述為與零時(shí)間的存活率相比的50%存活率。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，需要使對(duì)照反應(yīng)混合物與實(shí)驗(yàn)反應(yīng)混合物的實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行。例如，可將包含已知?dú)⒕钥贵w效價(jià)(從低到高)的樣品作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行鑒定。 此外，應(yīng)進(jìn)行不加樣品的反應(yīng)混合物以及不加非人補(bǔ)體的反應(yīng)混合物的實(shí)驗(yàn)。也可平行進(jìn)行包含非人fH多肽代替包含人SCR6氨基酸序列的H因子多肽的反應(yīng)混合物的實(shí)驗(yàn)，以確認(rèn)包含人SCR6氨基酸序列的H因子(fH)多肽會(huì)減弱補(bǔ)體介導(dǎo)的對(duì)奈瑟球菌的毒性。
試劑盒 本發(fā)明還提供用于本文所述鑒定的試劑盒。這樣的試劑盒可包含例如，具有人 CSR6氨基酸序列的fH多肽(例如人fH多肽)、非人補(bǔ)體并任選包含靶奈瑟球菌?？捎锚?dú)立的小瓶提供所述試劑，或至少可用單個(gè)小瓶提供fH多肽和非人補(bǔ)體。所述試劑盒可任選包含用于上述對(duì)照鑒定的試劑。
除上述組分以外，所述試劑盒還可包括使用試劑盒組分實(shí)施本文所述鑒定的說明書。所述說明書通常記錄在合適的記錄媒介上。例如，所述說明書可印刷在基材如紙或塑料等上。同樣地，所述說明書在試劑盒中可作為包裝插入物存在、處于試劑盒或其組分的容器標(biāo)簽(即與包裝或分裝相關(guān))中等。可在存在于合適的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)例如⑶-ROM、 磁盤等上的電子存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件上提供所述說明書。在一些實(shí)施方式中，試劑盒中不存在實(shí)際的說明書，但提供從遠(yuǎn)程來(lái)源例如經(jīng)互聯(lián)網(wǎng)獲得說明書的手段。該實(shí)施方式的一個(gè)例子是包括網(wǎng)絡(luò)地址的試劑盒，可從所述網(wǎng)絡(luò)地址瀏覽說明書且/或可從所述網(wǎng)絡(luò)地址下載說明書。就說明書而言，獲得說明書的手段記錄在合適的基材上。
除說明書以外，所述試劑盒還包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)照試劑混合物，例如，具有已知的針對(duì)奈瑟球菌的補(bǔ)體介導(dǎo)殺菌活性的抗體(殺菌活性為陽(yáng)性或殺菌活性不可檢測(cè))等。
非人動(dòng)物模型 如上所述，本發(fā)明還利用了關(guān)于人fH可在非人補(bǔ)體存在時(shí)發(fā)揮作用的發(fā)現(xiàn)，以提供腦膜炎奈瑟球菌感染的非人動(dòng)物模型。由于非人fH不與腦膜炎奈瑟球菌發(fā)生可檢測(cè)或顯著的結(jié)合，因此非人fH不提供對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)殺死作用的抗性，消除了腦膜炎奈瑟球菌對(duì)非人動(dòng)物的感染，由此破壞對(duì)提供感染的非人動(dòng)物模型的嘗試。
本發(fā)明的非人動(dòng)物模型提供具有結(jié)合腦膜炎奈瑟球菌的fH的非人動(dòng)物。所述“結(jié)合腦膜炎奈瑟球菌的fH”指包含介導(dǎo)與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合的人fH的氨基酸序列即人短同源重復(fù)結(jié)構(gòu)域6(SCR 6)的氨基酸序列，對(duì)其更為詳細(xì)的描述見下文。因此，所述結(jié)合腦膜炎奈瑟球菌的fH可以是人fH，可通過給予fH(例如靜脈內(nèi)給藥)，從非人動(dòng)物中存在的人fH編碼核酸序列進(jìn)行表達(dá)，或表達(dá)經(jīng)“人源化”包含代替內(nèi)源SCR6結(jié)構(gòu)域或除內(nèi)源SCR6 結(jié)構(gòu)域以外的編碼人SCR6結(jié)構(gòu)域的序列的非人fH編碼核酸來(lái)提供?？刹捎靡陨嫌懻摰娜魏魏线m的技術(shù)獲得人fH編碼核酸以及嵌合fH多肽編碼核酸用于在非人動(dòng)物中表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 產(chǎn)生經(jīng)修飾表達(dá)fH多肽的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。示例性方法包括在以下出版物、專利和文獻(xiàn)中描述的方法《轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生和應(yīng)用》(TransgenicAnimal Generation and Use) L. Μ· Houdebine,哈伍德學(xué)術(shù)出版社(Harwood Academic Press) 1997 ;《轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理禾口方法》(Transgenesis Techniques =Principles and Protocols)D. Murphy 和 D. A. Carter 編(1993 年 6 月)胡馬納出版社(Humana Press)； 《轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(Transgenic Animal Technology :A LaboratoryHandbook) C. A. Pinkert編(1994年1月)學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)《轉(zhuǎn)基因動(dòng)物》(Transgenic Animals) F. Grosveld 和 G Kollias 編(1992 年 7 月)學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)和《胚胎干細(xì)胞將計(jì)劃的改變引入動(dòng)物種系》(Embryonal Stem Cells =Introducing Planned Changes into theAnimal Germline)M. L. Hooper (1993 年 1 月)戈登和布里奇科學(xué)出版社 (Gordon&Breach Science Pub)；美國(guó)專利第 6，344，596 號(hào)、美國(guó)專利第 6，271，436 號(hào)、美國(guó)專利第 6，218，596 號(hào)和美國(guó)專利第 6，204, 431 號(hào)；Maga 和 Murray (1995)Bio/technol. 13 1452-1457 ；Ebert 等(1991)Bio/Technol. 9 :835-838 ；Velander 等(1992)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :12003-12007；Wright 等(1991)Bio/technol。
也可通過核轉(zhuǎn)移或克隆方法采用胚胎或成體細(xì)胞系產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，如例如 Campbell 等(1996) Nature 380 :64-66 和 Wilmut 等(1997) Nature385 :810-813 中所述?？刹捎冒|(zhì)注射DNA，如美國(guó)專利第5，523，222號(hào)所述?？赏ㄟ^引入包含硬脂酰輔酶A去飽和酶編碼序列的構(gòu)建體獲得對(duì)象轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還包括體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如體細(xì)胞(而非生殖系細(xì)胞)中包含轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，用硬脂酰輔酶A去飽和酶轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化動(dòng)物的乳腺細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因在所述動(dòng)物的乳腺細(xì)胞中表達(dá)。本領(lǐng)域中描述了體細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法。參見例如Furth等 (1995)Mol. Biotechnol. 4 :121_127。
可采用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)對(duì)基因組易于修飾的任何非人動(dòng)物進(jìn)行遺傳修飾以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。所述非人動(dòng)物可以是脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物，可以是哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物(例如鳥類(例如雞))。示例性非人哺乳動(dòng)物對(duì)象包括但不一定限于非人靈長(zhǎng)動(dòng)物 (猴、猿、黑猩猩)、嚙齒動(dòng)物(大鼠、小鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠等)、兔類動(dòng)物(例如兔)和有蹄類動(dòng)物(例如，牛、綿羊、山羊、豬)。術(shù)語(yǔ)“有蹄類動(dòng)物”用來(lái)表示豬、牛、綿羊和山羊的任何種或亞種。
可采用本領(lǐng)域眾所周知的克隆方法對(duì)經(jīng)“人源化”包含用于在非人動(dòng)物中表達(dá)的編碼人SCR6結(jié)構(gòu)域的序列的非人fH編碼核酸序列進(jìn)行改造。例如，改造小鼠fH編碼核酸序列，使其包含編碼人SCR6結(jié)構(gòu)域而非小鼠SCR6的序列，可采用限制性消化酶將編碼小鼠 SCR6多肽的核酸序列從小鼠fH的⑶S (注釋于Genbank登陸號(hào)NM_009888)中去除，并采用連接酶用編碼人SCR6多肽的核酸序列代替。
為在非人動(dòng)物中表達(dá)而改造的核酸序列可設(shè)有操作性連接以調(diào)節(jié)其表達(dá)的序列如啟動(dòng)予序列。本文所述實(shí)施方式的核酸序列可經(jīng)改造而包含本領(lǐng)域已知各種啟動(dòng)子中的任何一種以調(diào)節(jié)所述核酸序列的表達(dá)。例如，可改造所述核酸序列使核酸序列表達(dá)受fH啟動(dòng)子、組織特異性或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、由信號(hào)傳導(dǎo)途徑例如雌激素受體激活作用或藥物例如四環(huán)素調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。
可將人fH編碼核酸序列或經(jīng)人源化包含編碼人SCR6結(jié)構(gòu)域的序列的嵌合fH編碼核酸序列引入非人動(dòng)物的基因組中，使其在非人動(dòng)物宿主中從與編碼內(nèi)源fH多肽的基因分離的基因組進(jìn)行表達(dá)。這樣的一個(gè)例子是轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其中向發(fā)育的囊胚提供編碼感興趣序列的改造DNA，并允許其隨機(jī)插入到囊胚細(xì)胞的DNA中。這樣的另一個(gè)例子是通過感染例如腺病毒或慢病毒感染提供DNA的動(dòng)物，可在胚胎發(fā)育、出生后發(fā)育過程中或成體中進(jìn)行。
或者，可將改造的核酸序列引入基因組中，使其由基因組從特定的基因座例如以所需方式調(diào)節(jié)的基因座編碼，目的是限制轉(zhuǎn)基因的表達(dá)或用轉(zhuǎn)基因代替內(nèi)源基因，如“敲入”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的情況?？赏ㄟ^將編碼感興趣序列的改造核酸序列引入胚胎干(EQ細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生這樣的敲入轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，然后對(duì)其進(jìn)行篩選以鑒定改造DNA已代替基因組內(nèi)源序列的細(xì)胞。然后向所述ES細(xì)胞注射囊胚細(xì)胞或與囊胚細(xì)胞混合，以有利于發(fā)育的動(dòng)物。通常， 對(duì)引入以產(chǎn)生這樣的動(dòng)物的核酸進(jìn)行改造，使所述核酸序列受其所代替基因的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。本領(lǐng)域眾所周知，在這樣的情況中，不需要改造的核酸序列包含完整的非人fH，其中換入引入編碼人SCR6的序列以代替非人SCR6 ；而可采用直接側(cè)接SCR6的非人fH結(jié)構(gòu)域。
通過給予fH多肽產(chǎn)生的非人動(dòng)物模型 本發(fā)明還提供用作奈瑟球菌感染模型的非人動(dòng)物，其中將fH多肽(例如，人fH多肽或具有人SCR6氨基酸序列的其它fH多肽)從外源引入非人動(dòng)物的血流中。例如，可通過輸注將所述fH多肽引入血流中以使血流中的fH多肽水平模擬人中發(fā)現(xiàn)的水平。
使用方法 非人動(dòng)物模型可用于以下示例的各種背景中。通常，所述非人動(dòng)物模型可用來(lái)測(cè)試候選疫苗引發(fā)殺菌性抗奈瑟球菌抗體(例如抗腦膜炎奈瑟球菌抗體)的功效。在給予候選試劑之前或之后感染非人動(dòng)物模型時(shí)，所述模型可用于評(píng)價(jià)候選試劑(例如，候選抗生素、候選疫苗試劑)降低非人動(dòng)物中細(xì)菌接種量的能力。
通常，用感興趣的奈瑟球菌(例如，腦膜炎奈瑟球菌菌株、淋病奈瑟球菌菌株)接種非人動(dòng)物模型。從培養(yǎng)物(例如從肉湯培養(yǎng)物)中取出細(xì)菌時(shí)，通常在如上所述給藥之前洗滌所述細(xì)菌。接種物的密度可不同，例如，約102-109CFU/ml、約104_107CFU/ml、約 105-106CFU/ml 等。
篩選鑒定 可通過向本文所述的非人動(dòng)物模型給藥來(lái)篩選各種候選試劑中的任何一種。例如，所述動(dòng)物模型可用來(lái)鑒定例如抑制或防止奈瑟球菌(例如腦膜炎奈瑟球菌)感染、復(fù)制或其引起疾病癥狀的候選試劑。
“候選試劑”用來(lái)包括合成、天然產(chǎn)生或重組產(chǎn)生的分子(例如，小分子、藥物、多肽、抗體(包括抗原結(jié)合抗體片段，例如以提供被動(dòng)免疫)或其它免疫治療試劑，真核或原核細(xì)胞中存在的內(nèi)源因子(例如，多肽、植物提取物等)等)。
本文所述的非人動(dòng)物模型可用來(lái)評(píng)價(jià)用奈瑟球菌抗原免疫的人或非人動(dòng)物中產(chǎn)生的抗奈瑟球菌抗體提供的被動(dòng)免疫。本文所述的非人動(dòng)物模型也可用于測(cè)試針對(duì)表達(dá)低水平fHbp的奈瑟球菌菌株的被動(dòng)保護(hù)作用。例如，某些奈瑟球菌菌株如群C菌株4343可侵入年幼大鼠的血液并在其中復(fù)制(ffelsch JA和GranoffDM，Infect Immun.，2004，72 (10) 5903-9)。這些菌株還可在非免疫人血清中存活，與其結(jié)合的fH不可檢測(cè)(Welsch JA等 J. Infect. Dis. ,2008,197(7) :1053-61)。這樣的菌株傾向于表達(dá)低水平的fHbp。然而， 低fHbp表達(dá)子菌株的fHbp對(duì)所述菌株在人血液和人血清中的存活率具有重要作用Geib KL, Infect. Immun. 2009,77(1) :292-299)。因此，所述非人動(dòng)物模型可用于評(píng)價(jià)甚至針對(duì)fH低表達(dá)子的被動(dòng)免疫。
候選試劑包括多種類型的分子和大量化學(xué)類別，例如，多肽、核酸、有機(jī)分子(例如分子量大于50且小于約2500道爾頓的小有機(jī)化合物)?？蓮母鞣N來(lái)源包括合成或天然化合物文庫(kù)獲得候選試劑。
篩選候選抗奈瑟球菌試劑 可鑒定候選試劑以評(píng)價(jià)例如所述候選試劑降低細(xì)菌接種量、促進(jìn)抗奈瑟球菌抗體產(chǎn)生等方面的能力。通常，將所述候選試劑給予動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)候選試劑相對(duì)于對(duì)照(例如，相對(duì)于未感染動(dòng)物、相對(duì)于用抗菌作用已知的試劑處理的感染動(dòng)物等)的作用。例如， 可將所述候選試劑給予腦膜炎奈瑟球菌感染的動(dòng)物模型，將受處理動(dòng)物的細(xì)菌效價(jià)與處理之前和/或?qū)φ?、未處理?dòng)物的細(xì)菌效價(jià)進(jìn)行比較。通常，可檢測(cè)到用候選試劑處理之后感染動(dòng)物細(xì)菌效價(jià)顯著降低，這指示所述試劑的抗菌活性。
可以任何所需的和/或適合遞送所述試劑的方式給予所述候選試劑，以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果。例如，可通過注射(例如，靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或直接注射到需要達(dá)到所需效果的組織中)、口服或任何其它所需手段給予所述候選試劑。體內(nèi)篩選通常包括接受不同量和濃度的候選試劑(從無(wú)試劑到用量達(dá)到可成功遞送到動(dòng)物的上限量的試劑)的大量動(dòng)物，并可包括以不同制劑和途徑遞送所述試劑。所述試劑可單獨(dú)給藥或與兩種或更多種試劑聯(lián)合給藥，特別是在試劑聯(lián)合給藥可產(chǎn)生協(xié)同作用時(shí)。
可通過各種方式評(píng)價(jià)所述候選試劑的活性。例如，用奈瑟球菌感染宿主動(dòng)物時(shí)，可通過檢測(cè)血清樣品存在病原體(例如細(xì)菌效價(jià))或與病原體存在相關(guān)的標(biāo)記物(例如病原體特異性蛋白質(zhì)或編碼核酸等)來(lái)評(píng)價(jià)所述試劑的作用。檢測(cè)和評(píng)價(jià)細(xì)菌感染的存在和/ 或嚴(yán)重程度的定性和定量方法在本領(lǐng)域中眾所周知。在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過檢測(cè)血清樣品和/或組織切片存在細(xì)菌來(lái)評(píng)價(jià)針對(duì)奈瑟球菌感染的試劑活性。
如之前所述，所述候選試劑可以是來(lái)自用奈瑟球菌抗原免疫的人或非人動(dòng)物的測(cè)試血清，可鑒定所述測(cè)試血清賦予針對(duì)奈瑟球菌被動(dòng)免疫的能力?？蓪⑺鰷y(cè)試血清給予所述非人動(dòng)物模型?？蓪㈥幮詫?duì)照血清如來(lái)自非免疫動(dòng)物的血清或從免疫前動(dòng)物獲得的血清給予非人動(dòng)物模型作為陰性對(duì)照?？赏ㄟ^如上所述的各種方式評(píng)價(jià)所述測(cè)試血清賦予的被動(dòng)免疫。對(duì)評(píng)價(jià)針對(duì)奈瑟球菌的被動(dòng)免疫的方法的描述見例如，Welsch JA等(J. Infect. Dis.，2003，188(11) :1730-40)，Vu DM 等(J. Infect.Dis.，2006，193(6) :821-8)。
疫苗開發(fā) 本文所述動(dòng)物模型還可用來(lái)對(duì)候選疫苗防止或改善奈瑟球菌感染的能力進(jìn)行篩選。通常，“疫苗”是在給予之后促進(jìn)宿主獲得針對(duì)靶病原體的免疫應(yīng)答的試劑。引發(fā)的體液、細(xì)胞或體液/細(xì)胞免疫應(yīng)答可促進(jìn)對(duì)疫苗針對(duì)的病原體感染的抑制作用。特別感興趣的是引發(fā)抑制奈瑟球菌，例如腦膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌感染和/或復(fù)制的保護(hù)性免疫應(yīng)答的預(yù)防疫苗。同樣感興趣的還有提供針對(duì)例如殺菌性抗奈瑟球菌抗體產(chǎn)生引起的刺激的保護(hù)作用的治療疫苗。
可通過例如在用奈瑟球菌接種之前給予候選試劑來(lái)完成對(duì)候選疫苗的篩選。可通過快速灌注方式(例如，腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射)，并可在之后任選地進(jìn)行一次或多次加強(qiáng)免疫來(lái)給予所述候選試劑?？赏ㄟ^檢測(cè)抗體應(yīng)答例如采用常規(guī)鑒定或本文所述鑒定來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)作用?？捎媚紊蚓碳っ庖邉?dòng)物，然后觀察所述免疫動(dòng)物和所需非免疫對(duì)照動(dòng)物(如果有)的感染發(fā)展，評(píng)價(jià)感染的嚴(yán)重程度(例如通過評(píng)價(jià)存在的奈瑟球菌效價(jià))。將使感染顯著降低和/或殺菌性抗奈瑟球菌抗體顯著增加的疫苗候選物鑒定為活疫苗。
實(shí)施例 提供以下實(shí)施例以進(jìn)一步說明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特征，并不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。盡管它們是可能采用的典型實(shí)施例，但可代替采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方案、方法或技術(shù)。
材料和方法 細(xì)菌菌株 將腦膜炎奈瑟球菌群C菌株4243用于采用幼兔補(bǔ)體測(cè)定免疫人(接種疫苗者)血清的殺菌活性。之前已對(duì)該菌株的特征進(jìn)行了鑒定(Harris，S. L.等OOOiBnnfect Immun 71:275-286 ；D. M.等(2005)Vaccine 23 :4307-4314 ；ffelsch,J. Α.等(2004)Infect Immun 72 :5903-5909 ；Granoff, D. Μ.等(2005) Pediatr Infect Dis J 24:132-136)。所述測(cè)試菌株包括三個(gè)腦膜炎奈瑟球菌群B菌株H44/76、Cu385和NZ98/2M，所述三個(gè)菌株已用于制備顯示對(duì)人有效的外膜囊泡(OMV)疫苗(Sierra, G. V.等(1991) NIPHAnn 14 :195-207和 208-110 ；Bjune,G.等(1991)Lancet 338 :1093-1096 ；Kelly,C.等(2007)Am J Epidemiol 166 :817-823)。各菌株還廣泛用于測(cè)定接種疫苗的人中的腦膜炎球菌血清殺菌性抗體應(yīng)答(Tappero, J. W.等(1999)Jama281 :1520-1527 ；Perkins, B. Α.等(1998)J Infect Dis 177 :683-691 ；Μ.等(1999)Vaccine 17:2377-2383；Wong, S.等(2007)Pediatr Infect Dis J26 :345-350 ；ffedege,E.等(2007)Clin Vaccine Immunol 14 :830-838 ；Sandbu，S.等 (2007)Clin Vaccine Immunol 14 :1062-1069 ；0ster,P. ^ (2007)Vaccine25 :3075-3079 ； Thornton, V. ^ (2006) Vaccine 24:1395—1400)。測(cè)試年幼大鼠血清中所述三個(gè)群B菌株的存活率。此外，選擇三個(gè)菌株之一的H44/76來(lái)檢測(cè)給予人fH后年幼大鼠血流中的生物存活率。在之前的研究中，該菌株用于年幼大鼠菌血癥模型中以測(cè)定OMV疫苗引發(fā)抗體的被動(dòng)保護(hù)活性(Toropainen, M.等(1999)Vaccine 17 :2677-2689 ；Toropainen, M.等 (2005)Vaccine 23 :4821-4833 ；Toropainen, Μ. φ (2005)Infect Immun 73 :4694-4703 ； Toropainen, Μ.等(2001)Microb Pathog 30:139—148)。
菌株4243的血清型(PorB)、血清亞型(PorA)和序列型(ST)分別是2a、Pl. 5，2 和ST-11。菌株H44/76的相應(yīng)類別是15、Pl. 7，16和ST-32，菌株Cu385的相應(yīng)類別是4， 7P1. 19，15 和 ST-33，菌株 NZ98/254 的相應(yīng)類別是 4、P1. 4 和 ST-42。菌株 H44/76 和 Cu385 是變體1群中H因子結(jié)合蛋白(fHbp)的高表達(dá)子，具有與菌株MC58相同的fHbp氨基酸序列(Masignani, V.等(2003) J Exp Med 197:789-799)。菌株 4243 和 NZ98/254 表達(dá)較低量的變體1群中的亞變體fHbp (與菌株MC58的fHbp的氨基酸相同性具有< 12%的差異) (Welsch, J.A.等(2004)J Immunol172 :5606-5615；ffelsch, J. A.等(2008)J Infect Dis 197 :1053-1061)。
血清樣品 可從之前的研究獲得在對(duì)用四價(jià)腦膜炎球菌多糖免疫的4-5歲兒童接種疫苗之前和一個(gè)月之后立即獲得的冷凍血清，或來(lái)自用群C腦膜炎球菌寡糖-CRM197偶聯(lián)疫苗免疫的成人的血清(King, W. J.等(1996) J Pediatrl28 :196-202 ；Vu, D. Μ.等(2006) Clin Vaccine Immunol 13:605-610)。在本研究中，根據(jù)各體積血清的可用性選擇來(lái)自69名兒童和11名成人的方便血清樣品進(jìn)行鑒定。
靈長(zhǎng)動(dòng)物fH與腦膜炎奈瑟球菌的結(jié)合 從市場(chǎng)供應(yīng)商(紐約希克威爾的生物改造公司(Bioreclamation，Hicksville， NY))獲得黑猩猩、獼猴和狒狒的補(bǔ)體。從10名健康的成人志愿者獲得人血清(fH結(jié)合的陽(yáng)性對(duì)照)并進(jìn)行合并。將該鑒定所用的所有血清在56°C加熱30分鐘以防止補(bǔ)體激活和 C3b與細(xì)菌結(jié)合，從而可作為fH結(jié)合的另外配體。如之前采用也與靈長(zhǎng)動(dòng)物fH結(jié)合的多克隆抗人fH的淋病奈瑟球菌的情況所述，通過Western印跡測(cè)定黑猩猩、獼猴和狒狒的fH 與菌株H44/76的結(jié)合。在用各血清分別培育所述細(xì)菌之后，洗滌、溶解所述細(xì)菌，并通過 SDS-PAGE進(jìn)行分析。通過Western印跡檢測(cè)fH。
大鼠和兔血清對(duì)人H因子與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合的抑制作用 因?yàn)閮H有多克隆抗人fH可作為測(cè)定fH與細(xì)菌直接結(jié)合的手段，所述試劑不與來(lái)自非靈長(zhǎng)動(dòng)物如大鼠或兔的fH交叉反應(yīng)，因此非靈長(zhǎng)動(dòng)物fH與腦膜炎奈瑟球菌的結(jié)合不可直接測(cè)定。而是通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定大鼠或兔血清抑制人fH與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合的能力。簡(jiǎn)單而言，將大鼠或兔血清和對(duì)照人血清在56°C加熱30分鐘以防止C3b與細(xì)菌結(jié)合。血清熱失活不影響補(bǔ)體抑制功能或fH的結(jié)合性質(zhì)(JarVa，H.等000 J Immunol 168 1886-1894 ；Ram,S.等(1998)J Exp Med 188 :671-680)。
在生長(zhǎng)6-8小時(shí)后從巧克力瓊脂平板收獲腦膜炎奈瑟球菌菌株H44/76，將其懸浮在包含ImM CaCljP ImM MgCl2 (HBSS2+)的漢克斯堿性鹽溶液(HBSQ中，達(dá)到約切IO7CFU/ ml。用40 μ 1熱失活的人、大鼠或兔血清將所述細(xì)菌懸浮液以100 μ 1反應(yīng)體積在37°C培育10分鐘，之后加入5 μ g生物素化的人H因子(根據(jù)制造商的說明書，采用NHS-LC-生物素(皮爾斯公司(Pierce))以20 1的生物素fH摩爾比進(jìn)行生物素化反應(yīng))。將所述反應(yīng)混合物(最終體積ΙΙΟμΙ)再培育15分鐘，之后通過流式細(xì)胞術(shù)采用抗生物素蛋白 (Extravidin)-FITC(西格瑪公司(Sigma))在1 100稀釋度下檢測(cè)結(jié)合的生物素化人fH。
異源C3在腦膜炎奈瑟球菌上的沉積和人fH的抑制作用 測(cè)定大鼠C3在用年幼大鼠血清培育(終濃度10% (體積/體積(ν/ν)))的菌株Η44/76和ΝΖ98/2Μ上的沉積。通過流式細(xì)胞術(shù)Q4)采用偶聯(lián)FITC的抗大鼠C3測(cè)定結(jié)合細(xì)菌的大鼠C3。采用流式細(xì)胞術(shù)，通過增大加入年幼大鼠血清的人fH濃度(范圍為 0-50 μ g/ml)來(lái)評(píng)價(jià)人fH限制大鼠C3在菌株H44/76上沉積的能力，之后用5 X IO7細(xì)菌培育血清(終濃度20% )和fH的混合物。在一些實(shí)施方式中，向所述大鼠血清中加入EGTA 和MgCl2 (二者終濃度均達(dá)到IOmM)以阻斷補(bǔ)體的經(jīng)典和凝集素途徑并選擇性地允許替代途徑激活。采用酵母聚糖作為補(bǔ)體替代途徑完整性的對(duì)照，其為補(bǔ)體替代途徑的有效激活物(Fearon，D. T.等(1977) Proc NatlAcadSci U SA74 :1683-1687)。將酵母聚糖(西格瑪公司)懸浮在PBS中，使?jié)舛冗_(dá)到10mg/ml。將10 μ 1該懸浮液加入如上所述的包含人fH 的年幼大鼠血清中，最終反應(yīng)體積為50μ 1。
年幼大鼠血清中腦膜炎奈瑟球菌的存活率 根據(jù)所述菌株，在9-20只年幼大鼠的血清中測(cè)試腦膜炎奈瑟球菌的存活率。通過對(duì)6窩幼崽進(jìn)行心臟穿刺獲得所述血清，將其儲(chǔ)存在-70°C以維持內(nèi)源補(bǔ)體。使用于鑒定的細(xì)菌在補(bǔ)充有0. 25%葡萄糖(重量/體積(wt/vol))和0.02mM胞苷-5，- 一磷-N-乙酰神經(jīng)氨酸(密蘇里州圣路易斯的西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich Co. , St. Louis, MO))的穆勒-辛頓肉湯(新澤西州富蘭克林拉克斯的BD公司(BD, Franklin Lakes, NJ)) 中生長(zhǎng)約2小時(shí)(A62tlnm達(dá)到約0.6)到對(duì)數(shù)期。如上所述在別處洗滌所述細(xì)菌(52)并將其重懸浮于包含0. 9mM Ca2+(CaCl2x2H20)和0. 5mM Mg2+(MgCl2x6H20)的杜貝克磷酸鹽緩沖鹽水 (DPBS，弗吉尼亞州赫恩頓的密迪亞泰克公司(Mediatech，Herndon，VA))和(wt/vol)牛血清白蛋白(BSA科恩組分V(Cohn Fraction V)，德克薩斯州科爾威爾的艾奇泰克生物公司 (Equitech-Bio, Inc. ,Kerrville, TX)) (DPBS/Ca2+/Mg2+-1 % BSA)中。最終的 40 μ 1 反應(yīng)混合物包含約400CFU細(xì)菌，20 %、40 %或60 %血清和0_50 μ g/ml純化的人fH (德克薩斯州泰勒的補(bǔ)體技術(shù)公司(ComplementTechnologies, Inc.，Tyler, TX))。通過將培育60分鐘之后存在的各CFU/ml與陰性對(duì)照反應(yīng)中在零時(shí)間的CFU/ml分別進(jìn)行比較來(lái)確定各反應(yīng)混合物中細(xì)菌的存活率百分?jǐn)?shù)。陰性對(duì)照包含細(xì)菌和來(lái)自非免疫成人的不具有針對(duì)任何測(cè)試菌株的內(nèi)源殺菌活性的20%或40%血清，其通常在37°C培育60分鐘之后可產(chǎn)生大于150% 的存活率。
補(bǔ)體介導(dǎo)的血清殺菌活性 對(duì)對(duì)數(shù)期經(jīng)洗滌的生物測(cè)定群C殺菌效價(jià)，所述生長(zhǎng)的生物已經(jīng)過洗滌，如上所述被重懸浮于DPBS/Ca27Mg2+-l% BSA中，以便進(jìn)行年幼大鼠血清中腦膜炎奈瑟球菌的存活率實(shí)驗(yàn)。補(bǔ)體來(lái)源是20%合并的幼兔血清代替非免疫人血清。所述兔血清合并物(阿肯色州羅杰斯的佩爾-弗里茲公司(Pel-Freeze，Rogers, Arkansas))未顯示出可檢測(cè)的殺菌活性(與零時(shí)間的CFU/ml相比，在1小時(shí)培育過程中，20%或40%血清中測(cè)試菌株CFU/ml 的增長(zhǎng)大于150%). 年幼大鼠中的菌血癥 獲得懷孕的遠(yuǎn)系繁殖維斯達(dá)大鼠(密歇根州波蒂奇的查爾斯河公司(Charles River, Portage, MI))，在出生后4_6天，將幼崽隨機(jī)重新分配給養(yǎng)母以防止實(shí)驗(yàn)不同處理中的母性偏向。采用CHORI IA⑶C(兒童醫(yī)院奧克蘭研究中心，研究動(dòng)物管理和使用委員會(huì))批準(zhǔn)的方案進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。如上所述使細(xì)菌生長(zhǎng)并進(jìn)行洗滌用于血清殺菌鑒定，將其重懸浮于包含10%合并熱失活年幼大鼠血清的DPBS/Ca2+/Mg2+中，所述年幼大鼠血清已通過ImL Hi1Trap蛋白G HP柱(新澤西州皮斯卡塔韋的通用醫(yī)療公司(GEHealthcare， Piscataway,NJ))以去除IgG。通過ELISA檢測(cè)不到消耗的血清中的IgG (大于99%的IgG 被去除)，在熱失活之前的血清中不存在可檢測(cè)的殺菌活性。
將所述細(xì)菌懸浮液分為五等份，置于試管中。向其中三等份加入純化的人fH(補(bǔ)體技術(shù)公司)以達(dá)到20 μ g/ml、100 μ g/ml或500 μ g/ml的濃度(以在100 μ 1中遞送2 μ g、 IOyg或50yg/只大鼠用于刺激)。向第四等份中加入(500 μ g/ml)純化的人Cl酯酶抑制劑(補(bǔ)體技術(shù)公司)作為陰性對(duì)照。僅含細(xì)菌的第五等份作為另外的陰性對(duì)照(Oyg fH或C 1酯酶抑制劑)。在零時(shí)間，用100μ1含經(jīng)洗滌的對(duì)數(shù)期腦膜炎奈瑟球菌(約7X 103CFU/只大鼠)連同劑量為0、2、10或50 μ g的人fH或50 μ g的C 1酯酶抑制劑對(duì)幼崽進(jìn)行IP刺激。細(xì)菌刺激后8小時(shí)，通過心臟穿刺獲得血液標(biāo)本，將1 μ L、10 μ L和100 μ L 的血液份涂布到巧克力瓊脂(堪薩斯州來(lái)尼克謝的瑞美爾公司(Remel，Lenexa, Kansas)) 平板上。在37°C的5% CO2中過夜培育平板之后確定血液的CFU/mL。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 求冪計(jì)算60分鐘時(shí)CFU/ml的各幾何平均數(shù)。在進(jìn)行Iogltl轉(zhuǎn)化時(shí)，對(duì)低于細(xì)菌檢測(cè)下限的樣品的賦值為下限的一半(即5CFU/ml)。通過單向ANOVA確定分別給予50 μ g、 10yg、2yg或Oyg fH/只大鼠的四組CFU/ml幾何平均數(shù)各差異的顯著性。通過T檢驗(yàn)確定從用50 μ g人fH相對(duì)于50 μ g人Cl酯酶抑制劑處理的動(dòng)物獲得的CFU/ml幾何平均數(shù)的差異顯著性。
fH轉(zhuǎn)基因盒的產(chǎn)生 采用含 cfH 的質(zhì)粒(pBluescript-cfH ；Ngampasutadol J.等 J. Immunol. 180 3426-35,2008)作為模板擴(kuò)增人H因子基因(cfH)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到載體 pCAGGS(pCAGGS 包含雞的 β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子=Niwa, H.，K.等 Gene 108 :193-9,1991)的 EcoRI限制位點(diǎn)中。用Mil和I3StI消化所得的載體pCAGGS-cfH，對(duì)包含啟動(dòng)子和cfH基因的約61Λ的轉(zhuǎn)基因盒進(jìn)行凝膠純化。將純化的盒用于維斯達(dá)大鼠胚胎的微注射。
實(shí)施例1 靈長(zhǎng)動(dòng)物fH與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合的種特異性 多克隆抗人fH識(shí)別來(lái)自人以及非人靈長(zhǎng)動(dòng)物的熱失活血清中的fH (
圖1A，標(biāo)記為 (“僅血清”)的泳道)，因此可用來(lái)測(cè)試靈長(zhǎng)動(dòng)物fH與細(xì)菌的結(jié)合。fH與靈長(zhǎng)動(dòng)物熱失活血清中的菌株H44/76的結(jié)合顯示于標(biāo)記為“血清+細(xì)菌”的泳道。熱處理不影響fH的結(jié)合性質(zhì)(Jarva, H.等(2002) JImmunol 168 :1886-1894 ；Ram, S.等(1998) J Exp Med 188 671-680)。用人血清培育的細(xì)菌(陽(yáng)性對(duì)照)顯示最多的fH結(jié)合，而黑猩猩血清中fH的結(jié)合處于低水平，狒狒和獼猴血清中檢測(cè)不到結(jié)合。
實(shí)施例2 大鼠或兔fH不與人fH形成結(jié)合腦膜炎奈瑟球菌的競(jìng)爭(zhēng) 采用間接流式細(xì)胞鑒定來(lái)確定熱失活大鼠或兔fH(在其各自的熱失活血清中)是否與生物素化的人fH形成結(jié)合活腦膜炎奈瑟球菌上相同配體的競(jìng)爭(zhēng)。加入40%熱失活的大鼠或兔血清(最高測(cè)試濃度)不會(huì)抑制生物素化的人fH與腦膜炎奈瑟球菌結(jié)合，而加入作為陽(yáng)性對(duì)照的40%熱失活的人血清會(huì)抑制生物素化的人fH的結(jié)合(圖IB和1C)。這些數(shù)據(jù)表示大鼠和兔fH在腦膜炎奈瑟球菌上結(jié)合的配體與人fH的不同。雖然不能排除大鼠和兔fH在腦膜炎球菌上的結(jié)合位點(diǎn)不同于人fH的結(jié)合位點(diǎn)的可能性，但人fH、獼猴fH和大鼠fH(來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù))的氨基酸序列比對(duì)顯示，與人和大鼠fH之間約64%的氨基酸序列相同性相比，人和獼猴fH具有約88 %的氨基酸序列相同性。因?yàn)楂J猴fH不與腦膜炎球菌結(jié)合(
圖1A)，大鼠或兔血清對(duì)人fH缺乏抑制作用與這些物種的fH也不與腦膜炎球菌結(jié)合相一致。
實(shí)施例3 加入年幼大鼠血清的人fH對(duì)腦膜炎奈瑟球菌存活率的作用 在37°C下對(duì)混合物中的腦膜炎奈瑟球菌三個(gè)菌株培育1小時(shí)時(shí)，測(cè)定向年幼大鼠血清加入人fH對(duì)其存活率的作用(圖幻。在濃度為20%、40%和60%的濃度下測(cè)試各血清。不加fH時(shí)，與各自的零時(shí)間存活率相比，NZ98/2M和Cu385兩個(gè)菌株(分別為圖2的上圖和中圖)的存活率在培育期間升高超過150%。相比之下，第三個(gè)菌株H44/76的存活率在所有三個(gè)血清濃度(圖2下圖)中均降低40% -60%。在向反應(yīng)加入濃度為50μ g/ml 的人fH時(shí)，菌株H44/76相應(yīng)的存活率升高> 150% (例如，相比不加人fH時(shí)的存活率，包含人fH的60%血清中的存活率為152%，P<0. 001)。兩個(gè)已對(duì)血清具有抗性的菌株中的一種(菌株NZ98/2M)的存活率不受加入人fH的影響，而第二個(gè)血清抗性菌株Cu385的存活率在40%和60%血清中進(jìn)一步升高(fH，P < 0. 001)。
雖然菌株H44/76在不加人fH的年幼大鼠血清中顯示很差的存活率，但該菌株在于來(lái)自缺乏自然獲得殺菌性抗體的成人的人血清中培育時(shí)可存活(在20%、40%或60% 血清中在37°C培育1小時(shí)的存活率> 130%，數(shù)據(jù)未顯示)，這一觀察強(qiáng)調(diào)了生理學(xué)相關(guān)水平的人fH的存在對(duì)血清中菌株H44/76存活率的重要性。這些結(jié)果與我們之前的研究類似，之前的研究顯示用來(lái)自健康成人的缺乏腦膜炎球菌殺菌性或調(diào)理性抗體的抗凝人全血或血漿培育的菌株H44/76的存活和生長(zhǎng)情況(Welsch, J. A.等(2008) J InfectDis 197 1053-1061)。
實(shí)施例4 大鼠C3與腦膜炎球菌的結(jié)合和人fH對(duì)其的調(diào)節(jié)作用 為研究各菌株中年幼大鼠血清殺死作用抗性差異的基礎(chǔ)，對(duì)大鼠C3與菌株 H44/76(對(duì)年幼大鼠血清的殺死作用敏感)和NZ98/2M(對(duì)殺死作用具有抗性)的結(jié)合進(jìn)行測(cè)定。在年幼大鼠血清中培育時(shí)，菌株NZ98/2M和H44/76結(jié)合類似量的大鼠C3 (圖3A， 實(shí)線顯示的直方圖)。因此，C3沉積(如總C3結(jié)合量所確定)時(shí)或其之前的調(diào)節(jié)作用無(wú)法解釋NZ98/2M對(duì)年幼大鼠血清殺菌活性的抗性和H44/76對(duì)其的易感性。向大鼠補(bǔ)體中加入25 μ g/ml人fH導(dǎo)致大鼠C3與兩個(gè)菌株的結(jié)合均降低(圖3A，陰影灰色直方圖)。確定大鼠C3通過人fH對(duì)菌株H44/76的調(diào)節(jié)效率以評(píng)價(jià)敏感性降低與大鼠血清的殺死作用可能的相關(guān)性。加入人fH以劑量反應(yīng)形式降低了大鼠C3與H44/76的結(jié)合(圖；在向大鼠血清加入25和50 μ g/ml的人fH時(shí)，可見幾乎完全的抑制作用，而大鼠血清中人fH濃度為6. 25 μ g/ml時(shí)可見部分抑制作用。排它性地采用補(bǔ)體替代途徑的實(shí)驗(yàn)(向補(bǔ)充有人H 因子的大鼠血清加入Mg-EGTA以阻斷補(bǔ)體的經(jīng)典途徑)顯示在缺乏經(jīng)典途徑時(shí)C3調(diào)節(jié)效率增強(qiáng)(C3結(jié)合降低)。圖3C顯示人fH與細(xì)菌的結(jié)合也以劑量依賴方式調(diào)節(jié)兔的替代途徑激活作用。
為確保對(duì)大鼠C3與菌株H44/76結(jié)合的抑制作用并非由對(duì)補(bǔ)體激活的非特異性抑制作用產(chǎn)生，采用作為補(bǔ)體替代途徑有效激活物的酵母聚糖O^earon，D. Τ.等(1977)ft~OC NatlAcadSci USA 74 :1683-1687)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。替代途徑特異性補(bǔ)體激活作用和大鼠C3 與酵母聚糖的結(jié)合在補(bǔ)充有濃度增加的人fH(在較高濃度的fH下可見一些抑制作用，實(shí)驗(yàn)為顯示)的大鼠血清中以不受抑制的方式發(fā)生。
實(shí)施例5 人fH對(duì)年幼大鼠中腦膜炎球菌菌血癥的作用 為確定人fH是否增強(qiáng)了體內(nèi)腦膜炎奈瑟球菌球菌的存活率，將劑量為2、10或 50 μ g的人fH聯(lián)合給予每只大鼠用約7X IO3對(duì)數(shù)期CFU的菌株H44/76刺激的年幼大鼠 (N = 15/組)。作為陰性對(duì)照，給予一組大鼠不含人fH(Oyg)的細(xì)菌刺激，給予第二組含 50 μ g/只大鼠的人Cl酯酶抑制劑。刺激8小時(shí)后獲得血液培養(yǎng)物。從給予與感染接種物混合的、量減少(50、10、2或Oyg)的fH的動(dòng)物血液中分離的細(xì)菌數(shù)量(CFU/ml)降低(圖 4，由ANOVA得到P < 0. 02)。從給予人fH最高測(cè)試劑量50 μ g的動(dòng)物血液分離的幾何平均 CFU/ml顯著高于給予50 μ g人Cl酯酶抑制劑的對(duì)照分離的CFU/ml (1050vs. 43，P < 0. 005， T檢驗(yàn))。
實(shí)施例6 人fH對(duì)幼兔補(bǔ)體引發(fā)的免疫人血清殺菌效價(jià)的作用 采用兔補(bǔ)體測(cè)定來(lái)自用腦膜炎球菌多糖疫苗免疫的69名4-5歲兒童的免疫前和免疫一個(gè)月后的血清中群C殺菌效價(jià)。19名兒童的效價(jià)在免疫前血清中<1 16(測(cè)試最低稀釋度)，在免疫后血清中為1 64或更高。
用單獨(dú)的兔補(bǔ)體、用加入25 μ g/ml人fH的兔補(bǔ)體或作為對(duì)照的25 μ g/ml人補(bǔ)體 Cl酯酶抑制劑重新鑒定19例陽(yáng)性免疫后血清的效價(jià)。對(duì)來(lái)自用群C腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗免疫的11名成人的免疫后血清進(jìn)行類似的鑒定。結(jié)果總結(jié)在圖5中。在向反應(yīng)加入人fH 時(shí)，成人的血清殺菌幾何平均效價(jià)(GMT)下降超過8倍(P<0. 001)，兒童的血清殺菌幾何平均效價(jià)下降60倍(P<0. 001)。在加入人Cl酯酶抑制劑時(shí)，各GMT與不含抑制劑測(cè)定的各效價(jià)不具有顯著差異(P > 0. 5)。
實(shí)施例7 表達(dá)人fH的FO轉(zhuǎn)基因大鼠的產(chǎn)生 向大鼠胚胎注射純化的人fH轉(zhuǎn)基因盒(參見“材料和方法”)。將經(jīng)微注射的大鼠胚胎植入到假孕的雌性維斯達(dá)大鼠中。通過Western印跡采用親和分離的多克隆山羊抗人fH對(duì)FO代的一窩大鼠篩選人fH在血清中的表達(dá)(Granoff，D. M.，J.A. ^felsch和 S. Ram. 2009. Infect Immun 77 :764-9 ；Ngampasutadol J.等，J. Immunol. 180 :3426-35, 2008)。將0.5μ1來(lái)自16只FO大鼠幼崽的血清加樣到泳道中。將0. 06 μ 1人血清用作陽(yáng)性對(duì)照。16只動(dòng)物(F0代)中的兩只在其血清中表達(dá)人fH(圖8)。
實(shí)施例8 表達(dá)人fH的轉(zhuǎn)基因大鼠的產(chǎn)生 使表達(dá)fH的FO轉(zhuǎn)基因大鼠與野生型維斯達(dá)大鼠交配，并對(duì)來(lái)自該交配的幼崽(Fl 代)篩選如實(shí)施例7所述血清中的fH表達(dá)。通過PCR確定這些幼崽中存在CfH基因。將來(lái)自表達(dá)人fH的Fl代的大鼠鑒定為將人CfH整合到生殖系細(xì)胞中，用來(lái)進(jìn)一步繁殖育種以產(chǎn)生表達(dá)人fH的純合轉(zhuǎn)基因大鼠。
討論 以上內(nèi)容表明(a) fH與腦膜炎奈瑟球菌的結(jié)合對(duì)人fH而言是特異性的，(b)向年幼大鼠血清加入人fH增加了細(xì)菌對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)殺菌活性的抗性并降低了大鼠C3沉積，(c) 在用群B腦膜炎奈瑟球菌進(jìn)行腹膜內(nèi)刺激時(shí)將人fH給予年幼大鼠使生物的存活率升高超過llog1(1。此外，在向測(cè)試反應(yīng)混合物加入人H因子時(shí)，采用幼兔補(bǔ)體在免疫兒童和成人血清中測(cè)定的群C殺菌效價(jià)下降了 8-60倍。
近30年前首次報(bào)道了補(bǔ)體在宿主對(duì)腦膜炎奈瑟球菌防御中的重要作用 (Nicholson, A.等(1979) Science 205 :298-299)。Zollinger 和 Mandrell 在 25 年前報(bào)道， 用兔補(bǔ)體測(cè)定的血清殺菌效價(jià)遠(yuǎn)高于用人補(bǔ)體測(cè)定的各效價(jià)Zollinger，W. D.等(1983) InfectImmun 40 :257-264)，這一觀察被隨后的研究證實(shí)(Santos, G. F.等(2001)Clin Diagn Lab Immunol 8:616-623)。以上數(shù)據(jù)(圖5)顯示，加入人fH降低了采用兔補(bǔ)體在來(lái)自免疫兒童或成人的血清中測(cè)定的殺菌效價(jià)。因此，腦膜炎球菌選擇性與人fH結(jié)合的能力可能是用非人補(bǔ)體源測(cè)定的殺菌效價(jià)較高的一個(gè)原因。應(yīng)注意，在我們的研究中，在測(cè)試人血清的高稀釋度Ol 64)下，預(yù)期人fH是有限的。然而，在人血清的較低稀釋度下， 預(yù)期人fH的濃度足以下調(diào)兔C3，其可有利于用兔補(bǔ)體偶然觀察到的前區(qū)(即在人測(cè)試血清的低稀釋度下缺乏殺菌活性，但在兔C3激活作用不再受人fH的下調(diào)時(shí)在高稀釋度下存在殺菌活性)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中殺菌性抗奈瑟球菌抗體的方法，所述方法包括 將以下組分在反應(yīng)混合物中混合疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品；包含人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽， 非人補(bǔ)體來(lái)源，和奈瑟球菌；通過評(píng)價(jià)奈瑟球菌的生存力來(lái)檢測(cè)樣品中存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體， 其中所述樣品存在下的奈瑟球菌生存力減小表示所述樣品包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動(dòng)物內(nèi)源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人補(bǔ)體是兔補(bǔ)體。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述非人補(bǔ)體是大鼠補(bǔ)體或小鼠補(bǔ)體。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述腦膜炎奈瑟球菌是群A、B、C、X、Y或 W-135腦膜炎奈瑟球菌。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品包含人血清。
9.一種反應(yīng)混合物，其包含疑似包含殺菌性抗奈瑟球菌抗體的樣品；包含人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子(fH)多肽， 非人補(bǔ)體，和奈瑟球菌。
10.如權(quán)利要求9所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
11.如權(quán)利要求9所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動(dòng)物內(nèi)源 fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求9所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述非人補(bǔ)體是兔補(bǔ)體。
13.如權(quán)利要求9所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述非人補(bǔ)體是大鼠補(bǔ)體或小鼠補(bǔ)體。
14.如權(quán)利要求9所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌。
15.如權(quán)利要求13所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述腦膜炎奈瑟球菌是群A、B、C、 X、Y或W-135腦膜炎奈瑟球菌。
16.一種包括一個(gè)或多個(gè)小瓶的試劑盒，所述小瓶包含包含人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的分離的H因子(fH)多肽；和非人補(bǔ)體。
17.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含奈瑟球菌的培養(yǎng)物作為檢測(cè)殺菌性抗體的靶。
18.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
19.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動(dòng)物內(nèi)源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
20.如權(quán)利要求16所述的試劑盒，其特征在于，所述非人補(bǔ)體是兔補(bǔ)體。
21.一種非人動(dòng)物，其包含編碼含人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的基因組整合核酸，其中所述轉(zhuǎn)基因操作性連接于啟動(dòng)子以提供所述核酸在非人動(dòng)物中的表達(dá)； 其中所述核酸在非人動(dòng)物中的表達(dá)提供結(jié)合奈瑟球菌的fH多肽的產(chǎn)生。
22.如權(quán)利要求21所述的非人動(dòng)物，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
23.如權(quán)利要求21所述的非人動(dòng)物，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動(dòng)物內(nèi)源fH 多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
24.如權(quán)利要求21所述的非人動(dòng)物，其特征在于，所述非人動(dòng)物是大鼠或小鼠。
25.如權(quán)利要求21所述的非人動(dòng)物，其特征在于，用奈瑟球菌感染所述非人動(dòng)物。
26.如權(quán)利要求25所述的非人動(dòng)物，其特征在于，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌。
27.—種篩選候選奈瑟球菌疫苗的方法，所述方法包括 將候選試劑給予如權(quán)利要求21所述的非人動(dòng)物； 檢測(cè)存在或缺乏殺菌性抗奈瑟球菌抗體的產(chǎn)生。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將奈瑟球菌給予所述非人動(dòng)物。
29.一種奈瑟球菌感染的非人動(dòng)物模型，其包含包含人短同源重復(fù)序列6 (SCR 6)的氨基酸序列的H因子(fH)多肽的非人動(dòng)物宿主， 其中所述fH多肽存在于所述非人動(dòng)物宿主的血流中；和用奈瑟球菌進(jìn)行細(xì)菌感染； 其中所述fH多肽存在于非人動(dòng)物的血清中。
30.如權(quán)利要求四所述的非人動(dòng)物模型，其特征在于，所述fH多肽由整合到非人動(dòng)物基因組中的核酸編碼。
31.如權(quán)利要求四所述的非人動(dòng)物模型，其特征在于，對(duì)非人動(dòng)物宿主的血流從外源給予所述fH多肽。
32.如權(quán)利要求四所述的非人動(dòng)物模型，其特征在于，所述fH多肽是人fH多肽。
33.如權(quán)利要求四所述的非人動(dòng)物模型，其特征在于，所述fH多肽是包含非人動(dòng)物內(nèi)源fH多肽氨基酸序列的嵌合fH多肽，所述嵌合fH多肽經(jīng)修飾包含人SCR6的氨基酸序列。
34.如權(quán)利要求四所述的非人動(dòng)物宿主，其特征在于，所述非人動(dòng)物是大鼠或小鼠。
35.如權(quán)利要求四所述的非人動(dòng)物宿主，其特征在于，所述奈瑟球菌是腦膜炎奈瑟球菌。
36.一種篩選促進(jìn)抗奈瑟球菌活性的候選試劑的方法，所述方法包括將候選試劑給予如權(quán)利要求25所述的非人動(dòng)物或如權(quán)利要求四所述的非人動(dòng)物模型；檢測(cè)候選試劑對(duì)非人動(dòng)物中奈瑟球菌的生存力存在或缺乏作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了采用介導(dǎo)與奈瑟球菌H因子結(jié)合蛋白(fhBp)結(jié)合的具有人氨基酸序列的H因子多肽來(lái)檢測(cè)殺菌性抗奈瑟球菌抗體的鑒定方法，還提供了奈瑟球菌感染的非人動(dòng)物模型。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102203276SQ200980134145
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日
發(fā)明者D·M·格拉諾夫, J·A·韋爾施爾, S·拉姆 申請(qǐng)人:奧克蘭兒童醫(yī)院及研究中心, 馬薩諸塞州立大學(xué), 諾華疫苗和診斷公司