本發(fā)明涉及鑒定處于慢性損傷風(fēng)險(xiǎn)中的腎異體移植物(allograft)接受者的方法和用于本發(fā)明的試劑盒。所述方法包括分析從穩(wěn)定功能腎異體移植物的早期活檢物獲得的轉(zhuǎn)錄組標(biāo)志，以鑒定和治療此類患者。
背景技術(shù)：
：腎移植是美國(guó)進(jìn)行的最常見的實(shí)體器官移植；在2010年進(jìn)行了超過16,000例移植(2011SRTR數(shù)據(jù)報(bào)告)。盡管急性排斥的發(fā)生率降低了，尚沒有實(shí)現(xiàn)在長(zhǎng)期的異體移植物存活方面的進(jìn)步(1-2)。慢性異體移植物損壞(CAD)，或未知原因的間質(zhì)性纖維化和腎小管萎縮(IF/TA)是移植第一年后移植物損失的主要決定因素(3)。與IF/TA相關(guān)的臨床和組織學(xué)事件對(duì)于移植物損失的預(yù)示性不好(4)，使得難以鑒定可受益于早期介入以防止纖維化發(fā)展的異體移植物。響應(yīng)于腎功能障礙的異體移植物活檢仍然是當(dāng)前對(duì)慢性損傷的診斷途徑，在這個(gè)階段已經(jīng)發(fā)展了不可逆的纖維化。有確實(shí)證據(jù)的是，腎異體移植物中的病理改變發(fā)生于功能改變之前(5)。程序性活檢(protocolbiopsies)已經(jīng)提示，具有穩(wěn)定腎臟功能的移植物的百分之五十以上在1年時(shí)有IF/TA的跡象(6)。開發(fā)在移植后早期鑒定有風(fēng)險(xiǎn)移植物的預(yù)測(cè)性分析對(duì)于設(shè)計(jì)有目標(biāo)的治療介入是必不可少的。本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，從移植后早期進(jìn)行的程序性活檢獲得的分子改變發(fā)生于纖維化發(fā)展之前。根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)開發(fā)了鑒定有漸進(jìn)性損傷風(fēng)險(xiǎn)的異體移植物的預(yù)測(cè)性的基因集。這一發(fā)現(xiàn)允許在治療性介入可預(yù)防IF/TA的時(shí)候鑒定有移植物損失風(fēng)險(xiǎn)的接受者。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：已經(jīng)鑒定了13個(gè)基因的集，其對(duì)于1年時(shí)纖維化的發(fā)展和早期移植物損失是獨(dú)立地有預(yù)測(cè)性的。所述基因集的高預(yù)測(cè)能力(AUC0.947)優(yōu)于臨床指標(biāo)(AUC0.78)。常規(guī)組織學(xué)參數(shù)不能鑒定出纖維化進(jìn)展的組織學(xué)正常的異體移植物，而所述預(yù)測(cè)性的基因集精確地辨別和鑒定了纖維化最終進(jìn)展的組織學(xué)正常的異體移植物(AUC＝0.987)。該13個(gè)基因也精確地預(yù)測(cè)了早期移植物損失(2年和3年AUC分別為0.86和0.83)。使用獨(dú)立的群組和兩個(gè)獨(dú)立的公眾可獲得的表達(dá)數(shù)據(jù)集驗(yàn)證了這一基因集的預(yù)測(cè)價(jià)值。在3個(gè)月時(shí)從穩(wěn)定功能的腎異體移植物獲得的基因集，與12個(gè)月時(shí)對(duì)慢性異體移植物損壞建立的標(biāo)志物的發(fā)展是相關(guān)的，并被證明了優(yōu)于鑒定有異體移植物損壞和損失風(fēng)險(xiǎn)的腎移植接受者的臨床實(shí)踐中當(dāng)前使用的臨床-病理變量。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了鑒定處于慢性異體移植物損壞風(fēng)險(xiǎn)的腎異體移植物接受者的方法，包括提供在移植后3個(gè)月從腎異體移植物獲得的活檢樣本的步驟。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了用于選定的13基因標(biāo)志集的引物，所述基因標(biāo)志集包含基因KLHL13、KAAG1、MET、SPRY4、SERINC5、CHCHD10、FJX1、WNT9A、RNF149、ST5、TGIF1、RXRA和ASB15。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了為治療選擇腎異體移植物接受者以降低慢性異體移植物損壞或IF/TA風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法通過將從異體移植物獲得的預(yù)選的基因標(biāo)志集的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)比表達(dá)文庫(kù)的轉(zhuǎn)錄水平比較，以及如果所述預(yù)選的基因標(biāo)志集的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄水平，選擇所述患者來(lái)治療異體移植排斥或損壞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中提供了用于鑒定處于慢性腎損害或IF/TA風(fēng)險(xiǎn)的患者的基因標(biāo)志集，所述基因標(biāo)志集包含基因KLHL13、KAAG1、MET、SPRY4、SERINC5、CHCHD10、FJX1、WNT9A、RNF149、ST5、TGIF1、RXRA和ASB15。在更進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了用于鑒定處于慢性異體移植物損壞風(fēng)險(xiǎn)的腎異體移植物接受者的試劑盒，該試劑盒在獨(dú)立的容器中包含13成員的基因標(biāo)志集的引物、緩沖劑、三種持家基因和陰性對(duì)照以及使用說(shuō)明書。根據(jù)本說(shuō)明書、權(quán)利要求和附圖，本發(fā)明的這些和其他方面對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言將是顯而易見的。具體實(shí)施方式定義如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”通常是指對(duì)于值的類型和測(cè)量方法處于可接受的誤差范圍內(nèi)。例如，它可意指在給定值或范圍的20％之內(nèi)，更優(yōu)選10％之內(nèi)，還最優(yōu)選在5％之內(nèi)。可選地，特別是在生物系統(tǒng)中，術(shù)語(yǔ)“約”是指在約一個(gè)log(即，一個(gè)數(shù)量級(jí))之內(nèi)，優(yōu)選的在給定值的兩個(gè)因數(shù)之內(nèi)。本文公開的是一項(xiàng)使用唯一的和詳細(xì)的臨床、組織學(xué)和分子數(shù)據(jù)集，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)的系列程序性活檢的前瞻性研究。已經(jīng)鑒定并驗(yàn)證了在移植后3個(gè)月從穩(wěn)定功能的腎異體移植物獲得的基因集(基因標(biāo)志集，KLHL13、KAAG1、MET、SPRY4、SERINC5、CHCHD10、FJX1、WNT9A、RNF149、ST5、TGIF1、RXRA、ASB15)。這個(gè)基因集可以用于預(yù)測(cè)慢性異體移植物損壞的進(jìn)展。對(duì)于在幾個(gè)患者群組中移植物損傷的組織學(xué)進(jìn)展，以及在公眾可獲得的群組中的移植物損失，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種分子性風(fēng)險(xiǎn)基因標(biāo)志在鑒定有風(fēng)險(xiǎn)的腎移植接受者方面優(yōu)于臨床-病理的變量。本發(fā)明提供了鑒定處于慢性異體移植物損傷風(fēng)險(xiǎn)的腎異體移植物接受者的方法，該方法采用了如本文描述的選定的基因標(biāo)志集。具有13成員標(biāo)志集表達(dá)升高的異體移植物接受者處于慢性異體移植物損傷的風(fēng)險(xiǎn)中。本發(fā)明提供了鑒定本文描述的此類患者的材料和方法。慢性異體移植物損傷的自然史已經(jīng)揭示了移植后十二個(gè)月的早期和快速的組織學(xué)衰退(3)。在標(biāo)準(zhǔn)的和低風(fēng)險(xiǎn)腎臟中12個(gè)月時(shí)有害的組織學(xué)改變(纖維化和/或炎癥)的存在與有害的長(zhǎng)期異體移植物結(jié)局相關(guān)聯(lián)(14-16)。具體地，12個(gè)月時(shí)慢性異體移植物損壞指數(shù)分值(CADI-12)≥2已在本文描述的群組和來(lái)自先前公開的群組中鑒定了3年時(shí)移植物損失風(fēng)險(xiǎn)的接受者(5,17)。由于在12個(gè)月后異體移植物中觀察到的更多逐步的組織學(xué)衰退，一旦慢性異體移植物損壞已經(jīng)建立，免疫治療的介入很少會(huì)改變結(jié)局(3)。雖然更早時(shí)點(diǎn)的異體移植物組織學(xué)已經(jīng)與慢性異體移植物神經(jīng)病變(CAN)的進(jìn)展和異體移植物損失(18)相關(guān)聯(lián)，但將異體移植物分類為面臨早期組織學(xué)衰退風(fēng)險(xiǎn)和后期移植物損失的、甚至是具有中度敏感性的臨床-病理變量還未能被鑒定出來(lái)。例如，雖然群組的60％在3個(gè)月時(shí)具有低的CADI分值(0-1)，到12個(gè)月時(shí)，具有異體移植物損壞的組織學(xué)進(jìn)展的患者的超過一半屬于這個(gè)組，并且不能在3個(gè)月時(shí)單獨(dú)通過組織學(xué)鑒定出來(lái)。也已經(jīng)注意到在第一年內(nèi)Banff分值(6)進(jìn)展而沒有肌酐的可檢測(cè)的改變(19)。反之，已經(jīng)報(bào)道了在3個(gè)月時(shí)觀察到的組織學(xué)改變被12個(gè)月的評(píng)估逆轉(zhuǎn)(20)。在本文公開的群組中，具有高CADI-3的異體移植物的40％改善為0-1的CADI-12。因此，本發(fā)明的13成員基因標(biāo)志集的重要的臨床應(yīng)用是在適合介入的階段鑒定有CAN發(fā)展和進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的腎臟的能力，該風(fēng)險(xiǎn)當(dāng)前單獨(dú)通過臨床-病理參數(shù)是不可鑒別的。此外，與“一刀切(onesizefitsall)”免疫抑制策略相反，本文的基因集有潛力區(qū)分低風(fēng)險(xiǎn)的異體移植物接受者，所述受試者此后可從降低的免疫抑制受益。如許多個(gè)小組所顯示的，慢性腎異體移植物損傷的原因是多樣的和累加的(3，15)。這反映在相對(duì)大數(shù)量的基因上，所述基因在2個(gè)現(xiàn)有技術(shù)驗(yàn)證的群組中與有害的異體移植物結(jié)局相關(guān)。Einecke等人鑒定了組織基因標(biāo)志(與組織損傷、TGF-β效應(yīng)相關(guān)的886個(gè)基因)，對(duì)于移植后1-31年之間進(jìn)行的因故異體移植物活檢中的移植物損失是預(yù)測(cè)性的(8)。在低風(fēng)險(xiǎn)兒科接受者中來(lái)自6個(gè)月程序性活檢的601探針集標(biāo)志顯示了，相比沒有組織學(xué)進(jìn)展的患者，在有組織學(xué)進(jìn)展的患者中免疫應(yīng)答基因的上調(diào)(9)。本發(fā)明的13基因的標(biāo)志集以高預(yù)測(cè)值在所有這些群組中被驗(yàn)證，具有預(yù)測(cè)異體移植物結(jié)局的能力，而不論人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、移植后活檢時(shí)間、先有纖維化的存在、以及各自的研究終點(diǎn)的不同(表9)。另外，這兩項(xiàng)現(xiàn)有技術(shù)研究使用了基于早先的數(shù)據(jù)或預(yù)測(cè)的病理途徑的有限的基因集。相比之下，采用了全包含的、非假說(shuō)驅(qū)動(dòng)的方法，其由樣本大小來(lái)推動(dòng)并基于慢性損傷的多層面的性質(zhì)。由于CADI-12m是有序變量，基于相關(guān)性的信號(hào)、在3個(gè)月時(shí)更高的基因表達(dá)以及與CADI-12的相關(guān)性，而不是基于早先的研究中2個(gè)明確定義的臨床群組之間基因表達(dá)的比較，來(lái)得出初始的基因列表。本發(fā)明的方法提高了鑒別出的關(guān)系的健壯性，并增強(qiáng)了在未定義的群組中的臨床應(yīng)用。添加預(yù)測(cè)高CADI-12的臨床預(yù)測(cè)因子(供體年齡、接受者性別、死亡的供體器官和移植3個(gè)月內(nèi)的急性排斥)不會(huì)顯著增強(qiáng)所述基因集在預(yù)測(cè)CAN方面的性能。主要位于邊界上的亞臨床的排斥存在于20例3個(gè)月的活檢中。其中排除了患者具有急性細(xì)胞排斥(ACR)或i+t(炎癥(i)和小管炎(t)的組合計(jì)分)>2的額外的分析清楚地表明，對(duì)于鑒定AUC剩余1的13基因標(biāo)志集，炎癥不是主要的驅(qū)動(dòng)因素(數(shù)據(jù)未顯示)。本文使用的新的無(wú)偏差的方法由此鑒定出風(fēng)險(xiǎn)基因標(biāo)志，其區(qū)分群組中有組織學(xué)進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的異體移植物。在多個(gè)患者群組中預(yù)測(cè)異體移植物損傷和衰竭時(shí)的確認(rèn)表明，本發(fā)明對(duì)于鑒定有風(fēng)險(xiǎn)的腎臟具有更廣泛的適用性，這些患者的活檢物有或沒有預(yù)先存在的損害，在移植后不同時(shí)點(diǎn)采集。對(duì)功能穩(wěn)定的異體移植物的程序性活檢提供了一窺致病機(jī)制的窗口，所述機(jī)制在可檢測(cè)的異體移植物功能障礙發(fā)展之前啟動(dòng)。可以鑒定出進(jìn)行中的亞臨床的排斥、多瘤病毒BK感染、鈣調(diào)磷酸酶抑制物(CNI)毒性和抗體介導(dǎo)的損壞，這些過程對(duì)CAN有貢獻(xiàn)，CAN在檢出之時(shí)可被介入(24-26)。然而，其他研究還不能展現(xiàn)在對(duì)檢出的亞臨床現(xiàn)象進(jìn)行介入時(shí)異體移植物結(jié)局中的顯著差異(27)。這種不一致可能反映了在解釋程序性活檢時(shí)單獨(dú)使用組織學(xué)的限制，這可能受到內(nèi)部觀察者和采樣變異性的影響。另一方面，與12個(gè)月時(shí)異體移植物組織學(xué)相關(guān)的3個(gè)月和6個(gè)月的程序性活檢轉(zhuǎn)錄組改變(11，28)，以及與異體移植物損失相關(guān)的12個(gè)月異體移植物基因標(biāo)志(15)都已經(jīng)被報(bào)道。如本文公開的，通過Spearman相關(guān)性分析(Spearmancorrelationsanalysis)鑒定出其表達(dá)與3個(gè)月或12個(gè)月CADI相關(guān)的基因，然后進(jìn)行總體的基因本體(GeneOntology)富集。來(lái)自相關(guān)性分析的與CADI相關(guān)基因相關(guān)的基因本體(GeneOntology，GO)功能/途徑也用基因集富集分析(GeneSetEnrichmentAnalysis，GSEA)進(jìn)行驗(yàn)證(9)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及對(duì)于13成員基因標(biāo)志序列的RT-PCR的引物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于鑒定有腎異體移植物損傷風(fēng)險(xiǎn)的異體移植物接受者的試劑盒，其包含容器，其中有對(duì)于13成員基因標(biāo)志集的RT-PCR的引物和使用說(shuō)明書。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述試劑盒包含第一容器，其中具有對(duì)于13成員基因標(biāo)志的RT-PCR的引物，第二容器，其中具有用于持家基因的引物，第三容器，其中具有緩沖溶液，以及使用說(shuō)明書。根據(jù)表達(dá)將患者分層，13基因標(biāo)志集的高表達(dá)的患者被診斷為處于慢性異體移植物損壞的風(fēng)險(xiǎn)，此后進(jìn)行治療來(lái)預(yù)防這種損壞。按照本發(fā)明，具有13種基因的高表達(dá)的患者可以使用例如實(shí)時(shí)PCR、Nanostring或miSeq來(lái)鑒定。在每種情況下，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)物作為基線，用于鑒定處于慢性異體移植物損壞或IF/TA風(fēng)險(xiǎn)的患者。使用RT-PCR、nanostring和miSeq的診斷截?cái)嘀档拇_定使用患者的訓(xùn)練集，將對(duì)來(lái)自活檢樣品的mRNA分析13基因標(biāo)志集的表達(dá)水平。根據(jù)這種表達(dá)數(shù)據(jù)，將開發(fā)數(shù)學(xué)模型來(lái)評(píng)估一年時(shí)患者發(fā)展纖維化的概率。將根據(jù)這種計(jì)分敏感性/特異性來(lái)將患者分層，確定陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)。根據(jù)PPV和NPV，將建立最佳截?cái)嘀担渥詈玫貧w類患者的排斥風(fēng)險(xiǎn)。這可以清楚地截?cái)酁閮蓚€(gè)組，如果他們處于頂部組，他們的表達(dá)水平顯著更高，他們有更高的可能性發(fā)展纖維化，并且測(cè)試確定為陽(yáng)性，但如果他們處于底部，他們有極低的可能發(fā)展纖維化，測(cè)試確定為陰性。在可選擇的實(shí)施方式中，可以根據(jù)如上確定的他們的概率分值將患者分入三分位(tertiles)。在這種情況下，如果患者處于(1)頂部三分位，他們的表達(dá)水平顯著更高，他們具有很高可能性發(fā)展纖維化，且測(cè)試確定為陽(yáng)性；(3)如果他們處于第二三分位或中間組，他們的風(fēng)險(xiǎn)不能精確地確定；以及(3)如果他們處于底部三分位，他們有極低的可能發(fā)展纖維化，測(cè)試確定為陰性。RT-PCR分析試劑盒包括：1)引物容器(16個(gè)試管，每管一個(gè)qPCR分析，對(duì)16個(gè)基因，包括本發(fā)明的13個(gè)面板基因標(biāo)志集和持家基因(ACTB和GAPDH)以及對(duì)照探針18s)。分析購(gòu)自LifeTech。引物如下。2)UniversalMasterMixII：用于qPCR反應(yīng)的試劑3)ARRAY96-孔板6x164)AgilentAffinityScriptQPCRcDNA合成試劑盒：用于最高效率地將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，并且是為實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)應(yīng)用完全優(yōu)化的*INV＝存貨實(shí)驗(yàn)過程和數(shù)據(jù)分析：使用Allprep試劑盒(QIAGEN-ALLprepkit,Valencia,CAUSA)從異體移植物活檢樣品中提取總RNA。以oligodt引物用AffinityScriptRT試劑盒(AgilentInc.SantaClara,CA)合成cDNA。13基因標(biāo)志集、2個(gè)持家基因(ACTB、GAPDH)和18s的TaqManqPCR分析購(gòu)自ABILifeTechnology(GrandIsland,NY)。使用TAQMAN通用混合物在cDNA上進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，并且將用ABI7900HT系統(tǒng)監(jiān)視和獲取PCR反應(yīng)。樣品將測(cè)量三次。將對(duì)13成員標(biāo)志基因集以及2個(gè)持家基因產(chǎn)生循環(huán)時(shí)間(CT)值。通過從每個(gè)基因的CT值中減去持家基因的平均CT值來(lái)計(jì)算每個(gè)基因的ΔCT值，然后將使用logistfR包的懲罰型邏輯回歸擬合模型應(yīng)用在ΔCT值上來(lái)推導(dǎo)出統(tǒng)計(jì)模型，從其計(jì)算每個(gè)患者的高概率分值。其中(p(x)是高CADI的概率，β*i是懲罰系數(shù)，gi是基因i的表達(dá)ΔCT)基于概率分值、預(yù)測(cè)AUC、敏感性/特異性，確定陽(yáng)性(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)。在給定的特異性(90％)下建立最佳的截?cái)嘀担渥詈玫貧w類患者腎臟纖維化的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例A45人群組患者(18人：CADI≥2，27人：CADI<2)的獨(dú)立群組用作qPCR分析的訓(xùn)練集。提取RNA樣品并使用這種qPCR分析試劑盒進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。在數(shù)據(jù)獲取和標(biāo)準(zhǔn)化之后，構(gòu)建具有以下β值(表1)的懲罰型邏輯模型，且訓(xùn)練集上的預(yù)測(cè)AUC是0.866?；谟?xùn)練集的統(tǒng)計(jì)模型將用于預(yù)測(cè)新樣品的腎纖維化的概率，概率計(jì)分截?cái)嘀翟?0％特異性下是0.548。表1.來(lái)自qPCR訓(xùn)練集的用于懲罰型邏輯回歸模型的參數(shù)βsd(β)低95高95Chisq(截距)-0.3655.49998511.182610.412050.005216KLHL130.1213590.1216110.060460.5147911.642695MET-0.317350.2471570.938680.0667042.564086KAAG10.2791960.5326910.752991.401520.266769SERINC50.1103880.492916-0.7851.0222980.06097CHCHD100.5947930.5132210.320581.6374051.58411SPRY4-0.393340.7211532.262510.8394150.349045FJX10.2045010.339050.430740.9321290.403804RNF1490.069540.4574960.732840.8985950.03126ST50.7405910.7670470.482762.9308631.272416TGIF1-0.400040.4546921.328420.3446521.089256RXRA-0.287010.2374850.765940.0999582.098098ASB15-0.231060.173426-0.69740.0627752.251056Nanostring分析試劑盒：Nanostring分析試劑盒包括：1)訂制的CodeSet(用于13基因面板的條碼探針集，包括3個(gè)持家基因和陰性對(duì)照，由Nanostring提供)包2)Master試劑盒，包括nCounterCartridge、nCounterPlatePack和nCounterPrepPack3)用于提取高質(zhì)量總RNA的QIAGEN試劑盒Nanostring實(shí)驗(yàn)：遵照制造商的實(shí)驗(yàn)方案用QIAGEN試劑盒提取總RNA；使用主試劑盒在65℃下的溶液中使條碼探針與總RNA退火。捕獲探針將捕獲要被固定用于數(shù)據(jù)的目標(biāo)。在雜交之后，將樣品轉(zhuǎn)移到nCounterPreStation，探針/目標(biāo)固定在nCouterCartridge上，然后通過nCounter數(shù)字分析儀計(jì)數(shù)探針。mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析來(lái)自Nanostring分析儀的原始計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)在以下過程中處理，原始計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)首先相對(duì)于持家基因的計(jì)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)數(shù)低于陰性對(duì)照計(jì)數(shù)的中值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的mRNA將被濾出。由于來(lái)自試劑批次的數(shù)據(jù)變異，來(lái)自不同試劑批次的每個(gè)mRNA的計(jì)數(shù)將通過乘以在不同試劑批次上樣品的平均計(jì)數(shù)比例的因子來(lái)校準(zhǔn)。來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)批次的校準(zhǔn)的計(jì)數(shù)將進(jìn)一步通過ComBat程序包來(lái)調(diào)整。然后用logistfR程序包將懲罰型邏輯回歸擬合模型應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)數(shù)值來(lái)推導(dǎo)出統(tǒng)計(jì)模型，從所述統(tǒng)計(jì)模型計(jì)算每個(gè)患者的概率分值。來(lái)自Nanostring分析儀的原始計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)將按以下過程處理：原始計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)首先相對(duì)于持家基因的計(jì)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)數(shù)低于陰性對(duì)照計(jì)數(shù)的中值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的mRNA將被濾出。由于來(lái)自試劑批次的數(shù)據(jù)變異，來(lái)自不同試劑批次的每個(gè)mRNA的計(jì)數(shù)將通過乘以在不同試劑批次上樣品的平均計(jì)數(shù)比例的因子來(lái)校準(zhǔn)。來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)批次的校準(zhǔn)的計(jì)數(shù)將進(jìn)一步通過ComBat程序包來(lái)調(diào)整。然后用logistfR程序包將懲罰型邏輯回歸擬合模型應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)數(shù)值來(lái)推導(dǎo)出統(tǒng)計(jì)模型，從所述統(tǒng)計(jì)模型計(jì)算每個(gè)患者的高可能性的概率分值。其中(p(x)是高CADI的概率，β*i是懲罰系數(shù)，gi是基因i的計(jì)數(shù))基于概率分值、預(yù)測(cè)AUC、敏感性/特異性，確定陽(yáng)性(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)。在給定的特異性(90％)下建立最佳的截?cái)嘀担渥詈玫貧w類患者腎纖維化的風(fēng)險(xiǎn)。這可以清楚地截?cái)酁閮蓚€(gè)組，如果他們處于頂部組，他們有更高的可能性發(fā)展纖維化，并且測(cè)試確定為陽(yáng)性，但如果他們處于底部，他們有極低的可能發(fā)展纖維化，并且測(cè)試確定為陰性。可選擇的是，可以根據(jù)如上確定的他們的概率分值將患者分入三分位。在這種情況下，如果患者處于(1)頂部三分位，他們具有很高可能性發(fā)展纖維化，且測(cè)試確定為陽(yáng)性；(2)他們處于第二三分位或中間組，他們的風(fēng)險(xiǎn)不能精確地確定；以及(3)如果他們處于底部，他們有極低的可能發(fā)展纖維化，測(cè)試被確定為陰性。MiSEQ實(shí)驗(yàn)：MiSEQ分析試劑盒將包括：1)訂制分析(用于13基因面板的條碼探針集，包括5個(gè)持家基因面板)2)RNA樣品制備試劑盒v23)QIAGEN試劑盒，用于提取高質(zhì)量總RNAMiSEQ實(shí)驗(yàn)：使用QIAGEN試劑盒提取總RNA。遵照制造商的實(shí)驗(yàn)方案用RNA樣品制備試劑盒v2生成測(cè)序文庫(kù)：簡(jiǎn)要地，首先從總RNA純化含有polyA的mRNA并片段化。使用隨機(jī)六聚體引物和逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈cDNA合成，隨后是第二鏈cDNA合成。在將cDNA的突出端轉(zhuǎn)化為鈍端的末端修復(fù)過程之后，多個(gè)標(biāo)引銜接子添加到雙鏈cDNA的末端。接下來(lái)，使用對(duì)基因面板和持家基因特異的引物對(duì)進(jìn)行PCR來(lái)富集靶標(biāo)。最后，標(biāo)引的文庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證、標(biāo)準(zhǔn)化并集中，用于在MiSEQ測(cè)序儀上測(cè)序。mRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析MiSEQ測(cè)序儀產(chǎn)生的原始RNAseq數(shù)據(jù)將使用以下過程處理：使用公知的BWA比對(duì)算法，優(yōu)質(zhì)的讀出結(jié)果首先與包括hg19人類基因組、外顯子、剪接接點(diǎn)的幾個(gè)人類參考數(shù)據(jù)庫(kù)，以及包括核糖體和線粒體RNA序列的污染數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。在濾除了定位于污染數(shù)據(jù)庫(kù)的讀取結(jié)果之后，與期望的擴(kuò)增子區(qū)域最大2個(gè)堿基錯(cuò)配而獨(dú)特對(duì)齊的讀取結(jié)果被作為相應(yīng)基因的表達(dá)水平進(jìn)行計(jì)數(shù)，在log2變換之后進(jìn)一步進(jìn)行樣品間的分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。然后將logistfR程序包的懲罰型邏輯回歸擬合模型應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)數(shù)值來(lái)推導(dǎo)出統(tǒng)計(jì)模型，從所述統(tǒng)計(jì)模型計(jì)算每個(gè)患者的高可能性的概率分值。(其中(p(x)是高CADI的概率，β*i是懲罰系數(shù)，gi是基因i的計(jì)數(shù))?；诟怕史种?、預(yù)測(cè)AUC、敏感性/特異性，確定陽(yáng)性(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)。在給定的特異性(90％)下建立最佳的截?cái)嘀担渥詈玫貧w類患者腎纖維化的風(fēng)險(xiǎn)。這可以清楚地截?cái)酁閮蓚€(gè)組，如果他們處于頂部組，他們具有13成員基因標(biāo)志集的顯著更高的轉(zhuǎn)錄水平和高的可能性發(fā)展纖維化，并且測(cè)試被確定為陽(yáng)性，但如果他們處于底部，他們有極低的可能發(fā)展纖維化，并且測(cè)試被確定為陰性。可選擇的是，可以根據(jù)如上確定的他們的概率分值將患者分入三分位。在這種情況下，如果患者處于(1)頂部三分位，他們具有13成員基因標(biāo)志集的顯著更高的轉(zhuǎn)錄水平和發(fā)展纖維化的高可能性，并且測(cè)試被確定為陽(yáng)性；(3)如果他們處于第二三分位或中間組，他們的風(fēng)險(xiǎn)不能精確地確定；以及(3)如果他們處于底部三分位，他們有極低的可能發(fā)展纖維化，測(cè)試確定為陰性。鑒定移植后早期面臨漸進(jìn)性移植物損傷風(fēng)險(xiǎn)升高的患者的預(yù)測(cè)性基因集的開發(fā)具有若干種應(yīng)用：基于風(fēng)險(xiǎn)概況(riskprofile)的個(gè)體化治療，包括靶向“風(fēng)險(xiǎn)”個(gè)體用于早期，基于風(fēng)險(xiǎn)概況的個(gè)體化治療，包括靶向“風(fēng)險(xiǎn)”個(gè)體用于早期介入和在具有良好預(yù)后的個(gè)體中最小化治療。此外，它可以用于臨床試驗(yàn)中的風(fēng)險(xiǎn)分層，容許在目標(biāo)人群中測(cè)試新的治療方案。總之，已經(jīng)開發(fā)和驗(yàn)證了來(lái)自于3個(gè)月時(shí)功能穩(wěn)定的腎異體移植物的程序性活檢的基因標(biāo)志。所述基因標(biāo)志鑒定到12個(gè)月時(shí)有組織學(xué)衰退和功能下降風(fēng)險(xiǎn)的腎異體移植物接受者。這種基因標(biāo)志被外部證實(shí)了預(yù)測(cè)遭遇各種有害結(jié)局的異體移植物，呈現(xiàn)了中期和長(zhǎng)期有風(fēng)險(xiǎn)的腎臟。所述基因標(biāo)志還有潛力鑒定可以受益于較低強(qiáng)度的較低風(fēng)險(xiǎn)的異體移植物接受者。本發(fā)明涉及鑒定處于發(fā)展慢性異體移植物損傷風(fēng)險(xiǎn)中的腎異體移植物接受者的方法，所述損傷表現(xiàn)為間質(zhì)性纖維化和腎小管萎縮(IF/TA)。患者可以在3、6、9、12個(gè)月時(shí)監(jiān)測(cè)，此后每年監(jiān)測(cè)。當(dāng)患者被鑒定為處于發(fā)生慢性異體移植物損傷風(fēng)險(xiǎn)中時(shí)，本發(fā)明包括治療這樣的患者的方法。治療途徑可以是如下的：在通過參數(shù)確定為低免疫學(xué)風(fēng)險(xiǎn)的、被鑒定為慢性異體移植物纖維化高風(fēng)險(xiǎn)的患者中，所述參數(shù)包括沒有急性排斥、亞臨床的排斥，包括通過Banff標(biāo)準(zhǔn)(AmericanJournalofTransplantation2008；8:753–760)所定義的邊界線亞臨床排斥，供體特異性抗體，以及低的計(jì)算的面板反應(yīng)性抗體(PanelReactiveAntibodies，PRA-抗HLA抗體的度量)，所述方法包括但不限于，撤除鈣調(diào)磷酸酶抑制物(CNI)，例如環(huán)孢霉素或他克莫司，用較少產(chǎn)生纖維的免疫抑制藥物替代，例如，貝拉西普(belatacept)或西羅莫司；以及，在具有亞臨床的排斥，包括通過Banff指標(biāo)(AmericanJournalofTransplantation2008；8:753-760)所定義的邊界線亞臨床排斥，被鑒定為處于慢性異體移植物纖維化風(fēng)險(xiǎn)的那些患者中，所述方法包括但不限于，提高免疫抑制，例如，鈣調(diào)磷酸酶抑制物(CNI)如環(huán)孢霉素或他克莫司劑量的提高，或添加另一種藥劑，例如，潑尼松或嗎替麥考酚酯。此外，被鑒定為處于發(fā)生慢性異體移植物損傷風(fēng)險(xiǎn)的患者可以用抗纖維化藥劑治療，例如，吡非尼酮、松弛素、骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)、肝臟生長(zhǎng)因子(HGF)6。以下使用實(shí)施例描述本發(fā)明，所述實(shí)施例意圖進(jìn)一步描述本發(fā)明而不限制其范圍。在以下的實(shí)施例中，使用以下的材料和方法?；颊呷后w和活檢樣本本文描述的患者的排除指標(biāo)包括，陽(yáng)性的T/B-CDC交叉匹配，供體特異性抗體的脫敏作用，兒科接受者和不能給予知情同意的。程序性腎異體移植物活檢物在移植后0、3、12和24個(gè)月在3個(gè)位點(diǎn)獲取，在0和24個(gè)月在2個(gè)位點(diǎn)獲取。三個(gè)月的程序性活檢對(duì)244名患者進(jìn)行，其中的204人具有相應(yīng)的12個(gè)月活檢。對(duì)前159例3個(gè)月程序性活檢物(下文中，“m3_Bx”)進(jìn)行微陣列，其余45例用于驗(yàn)證。數(shù)據(jù)采集在基線采集供體和接受者數(shù)據(jù)。供體信息包括供體年齡、種族、性別、HLA、死亡原因、存活還是死亡的狀態(tài)(SCD、ECD或DCD)。接受者數(shù)據(jù)包括年齡、性別、種族、末期腎病(ESRD)的原因、HLA、PRA、抗-HLA抗體、冷缺血時(shí)間(CT)、延遲的移植物功能(DGF)、誘導(dǎo)和維持免疫抑制、巨細(xì)胞病毒(CMV)狀態(tài)、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)狀態(tài)，持續(xù)3、6、12和24個(gè)月，包括身體檢查、當(dāng)前的感染、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果(CBC、BUN、肌酐、代謝面板和免疫抑制水平)。此外，當(dāng)進(jìn)行臨床指示的活檢時(shí)采集臨床數(shù)據(jù)。HLA抗體篩選使用OneLambda珠子(OneLambdaInc,CanogaPark,CA)在基線時(shí)分析血清的循環(huán)抗-HLA抗體。平均熒光強(qiáng)度(MFI)>1000被認(rèn)為是陽(yáng)性的。使用HLAFusion軟件在LuminexLabScan200TM上分析樣品。使用供體和接受者HLA分型來(lái)確定供體特異性抗體(DSA)。在移植之前或之時(shí)具有預(yù)先形成的DSA而需要脫敏程序的患者被排除出這項(xiàng)研究。組織病理學(xué)和診斷分類從研究群組的3個(gè)月和1年程序性腎臟活檢物的每一個(gè)中采集兩個(gè)組織核心。處理一個(gè)核心用于組織學(xué)，處理另一個(gè)核心用于mRNA。當(dāng)僅可獲得一個(gè)核心時(shí)，優(yōu)先給予mRNA。處理腎臟活檢物，在中央進(jìn)行讀取。處理福爾馬林固定的、石蠟包埋的切片用于組織學(xué)染色(蘇木精和伊紅，高碘酸Schiff，三色和Weigerts彈性染料)。對(duì)用兔多克隆抗體(AmericanResearchProducts,Inc.)染色的石蠟切片在自動(dòng)化染色儀上進(jìn)行C3d的免疫組織化學(xué)。所有載玻片用全片掃描儀(AperioCS)進(jìn)行掃描，高分辨率的數(shù)字圖象歸檔于圖像數(shù)據(jù)庫(kù)中。由不了解臨床數(shù)據(jù)的2位腎臟病理學(xué)家，使用腎異體移植物病理學(xué)的公知的修訂Banff2007分類法獨(dú)立地對(duì)活檢物進(jìn)行評(píng)估和計(jì)分。當(dāng)診斷不一致時(shí)，與第三位病理學(xué)家會(huì)診取得一致的診斷。所有的病例在全載玻片圖像上進(jìn)行計(jì)分。分值輸入常規(guī)的FilemakerPro數(shù)據(jù)庫(kù)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算Banff類別和慢性異體移植物損壞指數(shù)(CADI)。微陣列實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)分析和交叉驗(yàn)證以下描述微陣列實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析的細(xì)節(jié)。簡(jiǎn)要地，提取來(lái)自活檢樣品的總RNA樣品，使用Affymetrix人類外顯子1.0ST陣列進(jìn)行微陣列實(shí)驗(yàn)。用RMA算法7提取基因級(jí)別的強(qiáng)度數(shù)據(jù)，在質(zhì)量評(píng)估之后使用開源的ComBatR程序包8校正實(shí)驗(yàn)分批效應(yīng)。通過Spearman相關(guān)性分析鑒定出表達(dá)與3個(gè)月或12個(gè)月CADI相關(guān)的基因，然后進(jìn)行總體的基因本體(GeneOntology)富集。根據(jù)相關(guān)性分析與CADI相關(guān)基因有關(guān)的GO功能/途徑也使用基因集富集分析(GeneSetEnrichmentAnalysis，GSEA)進(jìn)行驗(yàn)證(9)。為了鑒定最小的基因集來(lái)預(yù)測(cè)未來(lái)的腎臟纖維化，采用焦點(diǎn)基因集。根據(jù)通過100次隨機(jī)化分析，隨后校正混雜的臨床參數(shù)(CIT、死亡供體、供體年齡、抗HLA抗體、急性排斥)所確定的，基因集與12個(gè)月CADI特異性地相關(guān)。在對(duì)焦點(diǎn)基因集進(jìn)行擬合罰分邏輯回歸模型的5000次迭代之后，鑒定出具有最佳的預(yù)測(cè)AUC分值的最優(yōu)基因集。在我們的數(shù)據(jù)上進(jìn)行100次迭代，使用3重交叉驗(yàn)證方法交叉驗(yàn)證了所述基因集。通過對(duì)獨(dú)立的患者群組進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)，也通過對(duì)來(lái)自不同陣列平臺(tái)的三個(gè)獨(dú)立的公眾可獲得的數(shù)據(jù)集(11-13)進(jìn)行分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了所述基因集。微陣列表達(dá)文件上傳到GeneExpressionOmnibus網(wǎng)站(GSE)上。臨床數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)(平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差)用于概述供體和接受者的基線特征，并使用卡方檢驗(yàn)和Fisher確切檢驗(yàn)在研究組(高CADI-12對(duì)比低CADI-12，發(fā)展者對(duì)比非發(fā)展者)之間進(jìn)行比較。使用非配對(duì)T-檢驗(yàn)(用于相應(yīng)的非參數(shù)分析的Mann-Whitney檢驗(yàn))進(jìn)行連續(xù)變量的單變量比較。對(duì)研究的持續(xù)期間標(biāo)繪Kaplan–Meier曲線，以移植物損失(未審查死亡)作為結(jié)局。使用Log秩檢驗(yàn)和Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗(yàn)比較不同群組的存活曲線。P<0.05被認(rèn)為是顯著的(GraphPadPrismversion5.03,Graphpadinc,LaJolla,CA)。為了確定在移植后十二個(gè)月具有高CADI(分值≥2)的預(yù)測(cè)因子，使用回溯預(yù)測(cè)子選擇進(jìn)行多重邏輯回歸。評(píng)估的預(yù)測(cè)子有：供體年齡、供體種族、供體性別、供體狀態(tài)、3個(gè)月之前的急性排斥、接受者種族、接受者性別、擴(kuò)展的指標(biāo)供體、誘導(dǎo)和維持免疫抑制治療、以及抗HLA抗體的存在。冷缺血時(shí)間和延遲的移植物功能在僅包括死亡供體的亞組分析中考慮。構(gòu)建使用相同預(yù)測(cè)子的邏輯模型來(lái)評(píng)估在全部移植群體中，以及在僅死亡供體的群體中12個(gè)月時(shí)進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子。所有的分析使用SAS9.2版(SAS,Cary,NorthCarolina)完成。補(bǔ)充方法臨床數(shù)據(jù)采集在基線采集供體和接受者數(shù)據(jù)。供體信息包括供體年齡、種族、性別、HLA基因分型、死亡原因，以及異體移植物狀態(tài)(即，SCD、ECD或DCD)。接受者數(shù)據(jù)包括年齡、性別、種族、ESRD的原因、HLA基因分型、PRA、抗-HLA抗體的存在和類型、交叉匹配狀態(tài)、冷缺血時(shí)間(CIT)、延遲的移植物功能(DGF)、免疫抑制療法、CMV狀態(tài)、HCV和HBV狀態(tài)、透析年期(dialysisvintage)、透析形式、輸血?dú)v史、妊娠歷史和早先的移植。組織病理學(xué)：從慢性異體移植排斥(GoCAR)群組的基因組的3個(gè)月和1年程序性腎臟活檢物的每一個(gè)中采集兩個(gè)組織核心。處理一個(gè)核心用于組織學(xué)，處理另一個(gè)核心用于mRNA。當(dāng)僅可獲得一個(gè)核心時(shí)，3個(gè)月的優(yōu)先給與mRNA，12個(gè)月的優(yōu)先給與組織學(xué)。處理腎臟活檢物，在中央進(jìn)行讀取。處理福爾馬林固定的、石蠟包埋的切片用于組織學(xué)染色(蘇木色素和曙紅，高碘酸Schiff，三色和Weigerts彈性染料)。對(duì)用兔多克隆抗體(AmericanResearchProducts,Inc.)染色的石蠟切片在自動(dòng)化染色儀上進(jìn)行C4d的免疫組織化學(xué)。所有載玻片用全片掃描儀(AperioCS)進(jìn)行掃描，高分辨率的數(shù)字圖象歸檔于圖像數(shù)據(jù)庫(kù)中。由不了解臨床數(shù)據(jù)的2位腎臟病理學(xué)家，使用腎異體移植物病理學(xué)1(SIS參考文獻(xiàn))的RevisedBanff2007分類法獨(dú)立地對(duì)活檢物進(jìn)行評(píng)估和計(jì)分。當(dāng)診斷不一致時(shí)，與第三位病理學(xué)家會(huì)診取得一致的診斷。所有的病例在全載玻片圖像上進(jìn)行計(jì)分。分值輸入計(jì)算Banff類別和慢性異體移植物損壞指數(shù)(CADI)的訂制FilemakerPro數(shù)據(jù)庫(kù)。CADI-分值是復(fù)合的計(jì)分，包括六個(gè)組織學(xué)部分——血管內(nèi)膜硬化(cv)、腎小管萎縮(ct)、間質(zhì)性纖維化(ci)間質(zhì)性炎癥(i)、腎小球膜基質(zhì)升高(mm)和腎小球硬化(g)。每個(gè)部分在0至3之間計(jì)分，最大可能的分值為18。程序性活檢物中的CADI-分值已經(jīng)由幾名作者2-3驗(yàn)證與結(jié)局直接相關(guān)。微陣列實(shí)驗(yàn)使用Allprep試劑盒(QIAGEN-ALLprepkit,Valencia,CAUSA)從移植后3個(gè)月獲得的經(jīng)皮異體移植物活檢樣品提取總RNA，并使用RNA-later(Qiagen,Inc)穩(wěn)定化。使用Bioanalyzer2100(AgilentTechnologies)評(píng)估RNA質(zhì)量。RNA完整性數(shù)大于八的樣品用于隨后的微陣列實(shí)驗(yàn)。根據(jù)廠家(AffymetrixInc.)提供的標(biāo)準(zhǔn)方案使用Affymetrix小鼠外顯子1.0ST陣列。簡(jiǎn)言之，ENCORE擴(kuò)增和標(biāo)簽試劑盒(NuGen,SanCarlos,CA)應(yīng)用于第一批樣品，從約100ng總RNA開始產(chǎn)生用于與芯片雜交的生物素標(biāo)記的RNA片段。對(duì)于低RNA濃度的樣品，使用NugenOvationPICO擴(kuò)增試劑盒(NuGen,SanCarlos,CA)。使用GeneChipScanner7G(AffymetrixInc.)掃描芯片。微陣列數(shù)據(jù)處理提取基因級(jí)別的微陣列實(shí)驗(yàn)的強(qiáng)度數(shù)據(jù)，用RMA算法4總和。使用AffymetrixExpressionConsole(AffymetrixInc)評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量。Affymetrix對(duì)照探針集和在所有樣品中低強(qiáng)度的探針集從下游分析中排除。使用ComBatR軟件包5調(diào)節(jié)分批效應(yīng)。生物信息分析使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的R程序包進(jìn)行生物信息分析的工作流程。分析的目標(biāo)是得到相對(duì)健壯的基因的集(～10-20個(gè))，其預(yù)測(cè)慢性異體移植物腎病的發(fā)生。異體移植物轉(zhuǎn)錄標(biāo)志的鑒定：在3個(gè)月的異體移植物基因表達(dá)數(shù)據(jù)上，為3個(gè)月異體移植物CADI分值(CADI-3)以及12個(gè)月CADI分值(CADI-12)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。對(duì)每個(gè)基因計(jì)算表達(dá)水平和CADI分值之間相關(guān)性的相關(guān)系數(shù)和p-值。還使用線性回歸模型計(jì)算基因表達(dá)相對(duì)于CADI分值的斜率。選擇p值<0.05的基因。相應(yīng)于3個(gè)月或12個(gè)月的CADI分值產(chǎn)生兩列p<0.05的基因?；贔isher確切檢驗(yàn)通過基因本體(GO)富集分析確定這兩列基因的注釋的功能和分子機(jī)制?？蛇x地，分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)集來(lái)確定在具有更高CADI分值的活檢物中富集的生物學(xué)功能。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，我們將基因集富集分析(GSEA)(6-7)應(yīng)用于整個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集，并確定與低CADI分值(CADI<2)對(duì)比在高CADI分值(CADI≥2)的樣品中富集的基因功能。確定與高CADI組和低CADI組都相關(guān)的高位的GO術(shù)語(yǔ)，與上文描述的從基因表達(dá)水平和CADI分值之間的相關(guān)性分析推導(dǎo)的GO富集分析結(jié)果相比較。預(yù)測(cè)分析：為了從與CADI分值具有統(tǒng)計(jì)上顯著相關(guān)性的大的基因列表中推導(dǎo)出更顯著的和焦點(diǎn)的基因集，通過應(yīng)用各種統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)模型來(lái)過濾基因列表。首先，患者的整個(gè)群組按1：1比例隨機(jī)分配到2個(gè)組中。應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析來(lái)確定表達(dá)水平與3個(gè)月和12個(gè)月的CADI分值的嚴(yán)重度相關(guān)的基因。所述1:1的隨機(jī)化重復(fù)100次，對(duì)100次迭代的每一次進(jìn)行基因表達(dá)與3個(gè)月和12個(gè)月的CADI分值的相關(guān)性分析。在隨機(jī)化的100次迭代中在兩個(gè)組中與CADI的相關(guān)性P<0.05發(fā)生超過兩次的基因被認(rèn)為是聚焦的基因集，從其中鑒定出最小的預(yù)測(cè)集用于預(yù)測(cè)腎臟纖維化。推導(dǎo)出專屬于CADI-12焦點(diǎn)基因集的基因(即不與CADI-3焦點(diǎn)基因集共有的基因)，通過校正臨床干擾因子(供體年齡、活的vs死的供體、供體性別和種族、CTImin、誘導(dǎo)治療、抗HLAI類和II類抗體)，使用多重線性回歸分析來(lái)進(jìn)一步過濾，并排除低的中值log2強(qiáng)度小于5的基因。最后，進(jìn)行迭代邏輯模型擬合(5000次迭代)來(lái)鑒定用于預(yù)測(cè)未來(lái)的腎臟纖維化的最佳和最小的基因集。起初，從過濾的CADI-m12焦點(diǎn)基因集中隨機(jī)選擇20個(gè)基因。20個(gè)基因的組的表達(dá)數(shù)據(jù)擬合到懲罰型邏輯回歸模型中，用于預(yù)測(cè)高(CADI≥2)和低(CADI<2)CADI。對(duì)20個(gè)基因的組的每一個(gè)，從回歸模型鑒定與高/低CADI顯著相關(guān)(p<0.05)的基因。上述步驟重復(fù)5000次。從每次迭代操作中鑒定出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的基因(P<0.05)。計(jì)算5000次迭代中顯著性基因的出現(xiàn)。最后，將通過出現(xiàn)數(shù)量排序的前40個(gè)基因應(yīng)用回懲罰型邏輯回歸模型，用于高vs.低CADI預(yù)測(cè)。使用這一模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的基因(P<0.05)被認(rèn)為是最終的最佳基因集。使用該最終的最佳基因集從邏輯回歸模型計(jì)算AUC值和敏感性和特異性。最終的最佳基因集的接收工作特性曲線與相等大小的隨機(jī)選擇的基因集比較用于預(yù)測(cè)高vs.低CADI，來(lái)證明最終的最佳基因集得到最好的預(yù)測(cè)。此外，選出10000個(gè)隨機(jī)選擇的基因集，計(jì)算這些基因集的AUC，與最終的最佳基因集的AUC比較。最終的最佳基因集使用3倍交叉驗(yàn)證方法進(jìn)行交叉驗(yàn)證。簡(jiǎn)要地，患者隨機(jī)分入相等大小以及高低CADI患者數(shù)量相等的3個(gè)組中，任意兩個(gè)組的數(shù)據(jù)用作訓(xùn)練集，第三個(gè)用作預(yù)測(cè)集。將在訓(xùn)練集上構(gòu)建的懲罰型邏輯回歸模型應(yīng)用于預(yù)測(cè)集，來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)局和真假陽(yáng)性率。從預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)集計(jì)算預(yù)測(cè)精確性，然后從三種可能的排列中進(jìn)行平均。這些步驟重復(fù)超過100次。計(jì)算總體的真假陽(yáng)性率和預(yù)測(cè)精確性。對(duì)于100次迭代，基于使用訓(xùn)練集推導(dǎo)出的模型在測(cè)試集上AUC的分布進(jìn)行繪圖。為了進(jìn)一步評(píng)估預(yù)測(cè)的置信度，將小組標(biāo)記隨機(jī)分配給患者，在小組標(biāo)記變序的數(shù)據(jù)上計(jì)算AUC。上述步驟重復(fù)10000次，計(jì)算來(lái)自10000次迭代的AUC高于原始AUC的比例。也進(jìn)行不同的CADI-12閾值(高CADI-12≥3，或高CADI-12≥4)下的預(yù)測(cè)，來(lái)評(píng)估13基因集預(yù)測(cè)的健壯性。為了研究所述基因集的預(yù)測(cè)是否優(yōu)于臨床變量的預(yù)測(cè)，通過包括入以下人口統(tǒng)計(jì)學(xué)/臨床變量進(jìn)行多變量邏輯回歸用于預(yù)測(cè)高/低CADI-12：CADI-3、供體_年齡、死亡的_供體、ECD_腎臟、DGF、性別、種族、CIT_min、誘導(dǎo)_治療、抗_HLA_Ab_類_I、抗_HLA_Ab_類_II、他克莫司和CYA。在分步的選擇之后，保持顯著性的變量用于最終的模型中。然后計(jì)算最終模型的ROC曲線的AUC，與用所述基因集的CADI-12預(yù)測(cè)相比較。最后檢查炎癥是否是13基因集的驅(qū)動(dòng)因素，在101位患者中在12個(gè)月時(shí)評(píng)估急性排斥的預(yù)測(cè)精確性，以及對(duì)于沒有急性排斥的患者，評(píng)估高/低CADI-12的預(yù)測(cè)精確性。為了測(cè)試基因集是否可以預(yù)測(cè)移植后的早期移植物損失，對(duì)于初始的155位患者，在排除了攜帶有功能的移植物死亡的4位患者之后，首先，對(duì)3年內(nèi)有移植物損失或已經(jīng)跟蹤至少三年而沒有移植物損失的那些患者應(yīng)用所述基因集的邏輯回歸預(yù)測(cè)模型，并計(jì)算AUC。第二，對(duì)所有155名患者進(jìn)行存活分析，來(lái)檢查所述基因集是否與移植物損失相關(guān)：首先進(jìn)行13個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)的主成分分析(PCA)，前10個(gè)主成份(PC)被應(yīng)用于移植物損失時(shí)間的Cox比例危險(xiǎn)模型。選擇與移植物損失顯著相關(guān)的主成份(PC)，顯著成分的特征值的線性組合乘以來(lái)自Cox模型的相應(yīng)PC的相關(guān)系數(shù)，用作基因集風(fēng)險(xiǎn)分值(GR-分值)。人口統(tǒng)計(jì)學(xué)的和臨床的變量，包括CADI-3、延遲的移植物功能、3個(gè)月或之前的急性排斥、針對(duì)HLA1或HLA2的抗體、供體種族、供體年齡、接受者種族、接受者年齡、供體狀態(tài)(活的/死亡的)以及誘導(dǎo)治療，單獨(dú)地或與基因集風(fēng)險(xiǎn)分值組合，在移植物損失時(shí)間的Cox比例危險(xiǎn)模型中擬合，來(lái)研究是否有任何人口統(tǒng)計(jì)學(xué)的或臨床的變量與移植物損失相關(guān)。然后根據(jù)基因集風(fēng)險(xiǎn)分值(GR-分值)將患者分層到兩個(gè)群體中，用于Kaplan-meier存活分析。最后，標(biāo)繪出移植后2年或3年內(nèi)移植物損失預(yù)測(cè)的時(shí)間依賴性ROC，并計(jì)算AUC?；蚣尿?yàn)證：還在兩個(gè)獨(dú)立的公眾數(shù)據(jù)集上驗(yàn)證了最終的最佳基因集。兩個(gè)公眾數(shù)據(jù)集都位于AffymetrixGeneChip平臺(tái)HU430plus2上(GSE213748,GSE259029)。與上文描述的請(qǐng)求的數(shù)據(jù)集進(jìn)行的類似，這些公眾數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)在AffymetrixExpressionConsole上處理。提取最終的最佳基因集中每個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。使用懲罰型邏輯回歸模型進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)(對(duì)于GSE21374，活檢后任何時(shí)間的移植物損失，和對(duì)于GSE25902，基于CADI分值的進(jìn)展者/非進(jìn)展者)。從ROC曲線計(jì)算這2個(gè)數(shù)據(jù)集的每一個(gè)的AUC分值，用于預(yù)測(cè)特異性和敏感性。還使用與GOCAR數(shù)據(jù)集相同的方法，對(duì)數(shù)據(jù)集1進(jìn)行(GSE21374)移植物損失時(shí)間分析。還使用如上所述相同的方法應(yīng)用最佳基因集來(lái)預(yù)測(cè)進(jìn)展者和非進(jìn)展者。CADI-3≤3并到12個(gè)月時(shí)展現(xiàn)了ΔCADI≥2的患者被認(rèn)為是進(jìn)展者，ΔCADI≤1的患者被認(rèn)為是非進(jìn)展者。對(duì)于在24個(gè)月時(shí)有CADI分值的患者，以及CADI-3≤2的患者進(jìn)行類似的評(píng)估。qPCR實(shí)施例使用Allprep試劑盒(QIAGEN-ALLprep試劑盒，Valencia,CAUSA)從45名獨(dú)立的群組患者(18人：CADI≥2；27人：CADI<2)的異體移植物活檢樣品中提取總RNA。用寡聚dt引物(AgilentInc.SantaClara,CA)使用AffinityScriptRT試劑盒合成cDNA。用于13基因集、3個(gè)持家基因(ACTB、GAPDH和RPLP0)和18s的TaqManqPCR分析購(gòu)自ABILifeTechnology(GrandIsland,NY)。使用TAQMAN通用混合物對(duì)cDNA進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，使用ABI7900HT系統(tǒng)監(jiān)視和獲取PCR反應(yīng)。樣品測(cè)量三次。產(chǎn)生預(yù)測(cè)基因集以及3個(gè)持家基因的CT值。通過從每個(gè)基因的CT值中減去持家基因的平均CT值來(lái)計(jì)算每個(gè)基因的ΔCT值，然后對(duì)ΔCT值應(yīng)用懲罰型邏輯回歸擬合模型用于預(yù)測(cè)45名患者的高和低CADI，然后如上所述計(jì)算AUC值。實(shí)施例1：患者群體和移植物結(jié)局。588名患者被包括在群組中；基于包含指標(biāo)，204名患者被包括在當(dāng)前的研究中。當(dāng)使用CADI分值量化時(shí)，60％的12個(gè)月活檢物具有0-1的CADI，23％為2-4，17％的超過4。正如所料，CADI-12與12個(gè)月的eGFR負(fù)相關(guān)(r＝0.35；p＝0.0004)，和CADI-12≥2與3年移植物存活相關(guān)(log排名p＝0.007)；根據(jù)與移植物存活的相關(guān)性，高CADI-12被定義為≥2510。表1概括了基于CADI的患者人口資料。在多變量回歸中，與高CADI-12顯著相關(guān)的臨床因子是供體年齡，接受者)。在159個(gè)m3_Bx上進(jìn)行微陣列，其中101個(gè)具有相應(yīng)的12個(gè)月的程序性活檢。缺乏12個(gè)月的活檢的原因包括移植物損失(n＝8)、死亡(n＝1)、跟蹤丟失(n＝9)、禁忌癥/不能獲得活檢物(n＝40)。在159名微陣列患者與101位有一年活檢的之間，在臨床變量上沒有差異(表1)。86名患者有可用于病理學(xué)的第二個(gè)m3活檢物核心，55％的CADI0-1，33％的2-3，12％的CADI>3。在20/86人(23.5％)的m3_Bx[13人-邊線，3人-IA，1人-IB，3人-IIA]中診斷出亞臨床的急性排斥，而52％被報(bào)告為正常。實(shí)施例2：移植物內(nèi)分子表型是時(shí)間依賴性的。通過相關(guān)性分析和基因集富集分析(GSEA)分析來(lái)自m3_Bx的基因表達(dá)分布，以了解IF/TA的分子機(jī)制(n＝159)。在未調(diào)節(jié)的截?cái)嘀祊<0.05下，鑒定出1,316個(gè)基因與CADI-3顯著相關(guān)(806個(gè)正相關(guān)，510個(gè)負(fù)相關(guān))，1,056個(gè)基因與CADI-12顯著相關(guān)(852個(gè)正相關(guān)，204個(gè)負(fù)相關(guān))。僅176個(gè)基因(13.2％)與CADI-3和CADI-12都相關(guān)?；虮倔w富集表明，單獨(dú)與CADI-3特異性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與異體免疫相關(guān)，包括T-細(xì)胞活化；而涉及程序性細(xì)胞死亡/細(xì)胞凋亡和細(xì)胞粘附的基因與CADI-12單獨(dú)相關(guān)。通過GSEA方法進(jìn)一步確認(rèn)生物學(xué)功能，其中比較了在3個(gè)月或12個(gè)月時(shí)具有高(≥2)和低(<2)CADI的患者之間GO類別中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。實(shí)施例3：3-個(gè)月的轉(zhuǎn)錄組鑒定出處于慢性異體移植物損壞風(fēng)險(xiǎn)的腎臟分析獲自m3_Bx的轉(zhuǎn)錄組來(lái)鑒定對(duì)CADI-12有預(yù)測(cè)性的最小基因集(補(bǔ)充方法)。起初，鑒定出169個(gè)基因，與CADI-12特異性相關(guān)而不與CADI-3相關(guān)。在排除低強(qiáng)度的與和對(duì)臨床參數(shù)調(diào)整之后，這169個(gè)基因減少為85個(gè)基因的集合(表4)。對(duì)這85個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)迭代應(yīng)用懲罰型邏輯回歸擬合鑒定出13基因集，其以1的曲線下面積(AUC)從低CADI-12中區(qū)分出高CADI-12(表2)。這高于從初始的85個(gè)基因中隨機(jī)選擇的13基因集的AUC(平均AUC0.87±0.025)。使用訓(xùn)練集和測(cè)試集的隨機(jī)分配，對(duì)該基因集進(jìn)行3重交叉驗(yàn)證(100次)。測(cè)試集的平均敏感性、特異性和預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性分別是95％、82％、86％。100個(gè)測(cè)試集的平均AUC[0.947(95％CI:0.942-0.952]高于10000次迭代對(duì)隨機(jī)分配的高和低CADI患者組預(yù)測(cè)獲得的任何AUC。在不同的截?cái)嘞?，包括CADI-12≥3或≥4，對(duì)CADI-12獲得的AUC分別是0.986和0.963，確認(rèn)了本發(fā)明的基因集的健壯性?；蚣念A(yù)測(cè)優(yōu)于臨床-病理學(xué)變量(AUC＝0.783)，組合高CADI-12的臨床參數(shù)預(yù)測(cè)不會(huì)增強(qiáng)所述基因集的性能。重要的是，該基因集還基于Banff分值(Ci+Ct)精確地預(yù)測(cè)纖維化(AUC＝0.092)。亞臨床的排斥存在于二十例m3_Bx中，并且與高CADI-12(p＝0.0003)和BANFF分值(Ci+Ct)(p＝0.002)相關(guān)。排除有排斥的或i+t>2的m3_Bx，不改變由本文公開的基因集的高CADI-12預(yù)測(cè)(AUC＝1)，同時(shí)13基因不良地預(yù)測(cè)ACR(AUC＝0.743)。這一點(diǎn)與預(yù)測(cè)Ci+Ct能力一起證明了炎癥不是它的衍生的優(yōu)勢(shì)驅(qū)動(dòng)因素。最后，當(dāng)用相似的人口資料作為訓(xùn)練集在獨(dú)立的GoCAR群組上通過qPCR驗(yàn)證時(shí)(表S4)，該基因集精確地區(qū)分高vs.低CADI-12(AUC＝0.866)。實(shí)施例4：轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(cè)慢性異體移植物損壞的進(jìn)展接下來(lái)，應(yīng)用該基因集來(lái)將具有最小纖維化或沒有纖維化的m3_Bx分類為發(fā)展或不發(fā)展?jié)u進(jìn)性纖維化。從初始的101名患者中，CADI-3≤3的那些異體移植物(n＝68)被鑒定出，根據(jù)從3個(gè)月到12個(gè)月時(shí)CADI的改變表征了兩個(gè)組：(1)ΔCADI≥2的進(jìn)展者(n＝1)；和(2)ΔCADI≤1的非進(jìn)展者(n＝51)。表5比較了進(jìn)展者vs.非進(jìn)展者的3個(gè)月和12個(gè)月的活檢病理分值。進(jìn)展者具有主要由ci分值驅(qū)動(dòng)的3個(gè)月時(shí)的較高的CADI；然而，單獨(dú)的CADI-3不能用于從非進(jìn)展者區(qū)分進(jìn)展者。臨床參數(shù)也是進(jìn)展的不良預(yù)測(cè)子(AUC＝0.642)。在12個(gè)月(AUC0.984)和24個(gè)月(AUC0.859)下，所述公開的基因集精確地從非進(jìn)展者中鑒定出CADI進(jìn)展者。當(dāng)分析CADI-3≤2的原始異體移植物時(shí)，它預(yù)測(cè)了到12個(gè)月和24個(gè)月時(shí)的CADI進(jìn)展(分別地，AUC＝1和0.84)。這些發(fā)現(xiàn)具有臨床重要性，因?yàn)樵?6個(gè)月跟蹤中，進(jìn)展者的移植物存活比非進(jìn)展者差(Gehan-Breslow-Wilcoxonp＝0.01；Log-排名p＝0.06)。實(shí)施例5：轉(zhuǎn)錄組標(biāo)志預(yù)測(cè)早期異體移植物損失接下來(lái)用本發(fā)明的基因集和臨床變量產(chǎn)生Cox-模型來(lái)對(duì)公開的群組預(yù)測(cè)死亡審核的移植物損失(移植物損傷n＝11)。13基因的表達(dá)數(shù)據(jù)的三個(gè)主要成分(P4、P6和P7)與Cox比例危險(xiǎn)模型中的移植物損失顯著相關(guān)(p<0.05)(表S5)，被用于推導(dǎo)(基因集風(fēng)險(xiǎn)分值”(GR-分值)(移植物損失HR2.719，95％CI1.60-4.63)?；谶@種GR-分值，患者被分層到相等大小的兩個(gè)組中，更高的分值與移植物損失顯著相關(guān)(Log-排名p<0.002)。使用GR-分值，移植后2年和3年的時(shí)間依賴性移植物損失的AUC分別是0.863和0.849。在臨床變量中，僅延遲的移植物功能與移植物損失顯著相關(guān)(表6)。然而，基因集與延遲的移植物功能的組合不能改善預(yù)測(cè)。實(shí)施例6：預(yù)測(cè)性基因集的驗(yàn)證為了確認(rèn)13基因集在各種情境下的實(shí)用性，兩個(gè)獨(dú)立的公眾可獲得的數(shù)據(jù)集使用移植物損失的終點(diǎn)和CADI作為慢性異體移植物損傷的指標(biāo)來(lái)進(jìn)行分析(表9)。對(duì)于每個(gè)數(shù)據(jù)集，該基因集精確地預(yù)測(cè)相關(guān)的終點(diǎn)，性能好于原始研究報(bào)道的AUC。使用本發(fā)明的基因集對(duì)數(shù)據(jù)集-1的存活分析顯示了對(duì)于移植物損失分層為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的顯著差異(p＝2.1e-9)；活檢后1年和2年內(nèi)移植物損失的AUC分別是0.865和0.807。這些數(shù)據(jù)證明了，這種13基因集可以跨群體應(yīng)用，用于預(yù)測(cè)多樣的而又臨床上重要的結(jié)局，包括異體移植物存活。實(shí)施例7：根據(jù)本發(fā)明的13基因標(biāo)志集KLHL13、KAAG1、MET、SPRY4、SERINC5、CHCHD10、FJX1、WNT9A、RNF149、ST5、TGIF1、RXRA、ASB15。這些基因的本領(lǐng)域公認(rèn)的名稱在表2中顯示。表1：人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征(高-和低-CDAI-12；cDAI-進(jìn)展者和非進(jìn)展者)圖例：CADI-12個(gè)月時(shí)慢性同種異體移植物損壞指數(shù)；MFI-平均熒光強(qiáng)度；MMF-霉酚酸酯；CNI-鈣調(diào)磷酸酶抑制物；DSA-供體特異性抗體；*僅死亡的供體；**94/101名患者具有測(cè)量的HLA抗體#通過Mann-Whitney檢驗(yàn)(非參數(shù)性比較)或非配對(duì)T-檢驗(yàn)確定的P值表2：多變量分析-12個(gè)月的CADI-分值≥2的臨床協(xié)變量預(yù)測(cè)#P-值-Wald卡方，*DD-死亡的供體，**LD-活的供體***誘導(dǎo)治療類別比較了淋巴細(xì)胞耗盡和淋巴細(xì)胞非耗盡誘導(dǎo)與無(wú)誘導(dǎo)治療。表3：13基因預(yù)測(cè)集表4：85焦點(diǎn)基因集表5：進(jìn)展者/非進(jìn)展者之間的CADI子分值比較*Mann-Whitney檢驗(yàn)表6：GoCAR患者群組的基線臨床和人口學(xué)特征*P-值，通過非配對(duì)T-檢驗(yàn)(或非參數(shù)的)以及，卡方/Fisher確切檢驗(yàn)。**94/101&38/45名患者具有測(cè)量的HLA抗體。#86/101&40/45名患者具有報(bào)道用于組織學(xué)的3個(gè)月活檢表7：13基因集的10個(gè)主成分與移植物損失在Cox比例危險(xiǎn)模型中的相關(guān)性。對(duì)10個(gè)df的可能性比例測(cè)試＝20.7，p＝0.023，n＝155，事件數(shù)＝11表8：Cox比例危險(xiǎn)模型中人口學(xué)或臨床變量與移植物損失的相關(guān)性*HLA抗體：dsa：供體特異性抗原，參考；ndsa：非dsa抗體；n：無(wú)抗體誘導(dǎo)類型：LD：淋巴細(xì)胞耗盡；LND：淋巴細(xì)胞非耗盡；None：無(wú)誘導(dǎo)*種族的參考：亞洲人對(duì)24個(gè)df的可能性比例測(cè)試＝32.1，p＝0.123n＝135，事件數(shù)＝10表9：CoCAR基因集在其他腎臟移植群組中的驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)1.Meier-KriescheHU,ScholdJD,SrinivasTR,KaplanB.Lackofimprovementinrenalallograftsurvivaldespiteamarkeddecreaseinacuterejectionratesoverthemostrecentera.Americanjournaloftransplantation:officialjournaloftheAmericanSocietyofTransplantationandtheAmericanSocietyofTransplantSurgeons2004；4:378-83.2.WolfeRA,RoysEC,MerionRM.TrendsinorgandonationandtransplantationintheUnitedStates,1999-2008.Americanjournaloftransplantation:officialjournaloftheAmericanSocietyofTransplantationandtheAmericanSocietyofTransplantSurgeons2010；10:961-72.3.NankivellBJ,BorrowsRJ,FungCL,O'ConnellPJ,AllenRD,ChapmanJR.Thenaturalhistoryofchronicallograftnephropathy.NEnglJMed2003；349:2326-33.4.YilmazS,McLaughlinK,PaavonenT，等人.Clinicalpredictorsofrenalallografthistopathology:acomparativestudyofsingle-lesionhistologyversusacomposite,quantitativescoringsystem.Transplantation2007；83:671-6.5.YilmazS,TomlanovichS,MathewT，等人.ProtocolcoreneedlebiopsyandhistologicChronicAllograftDamageIndex(CADI)assurrogateendpointforlong-termgraftsurvivalinmulticenterstudies.JournaloftheAmericanSocietyofNephrology:JASN2003；14:773-9.6.SolezK,ColvinRB,RacusenLC，等人.Banff07classificationofrenalallograftpathology:updatesandfuturedirections.Americanjournaloftransplantation:officialjournaloftheAmericanSocietyofTransplantationandtheAmericanSocietyofTransplantSurgeons2008；8:753-60.7.IrizarryRA,BolstadBM,CollinF,CopeLM,HobbsB,SpeedTP.SummariesofAffymetrixGeneChipprobeleveldata.Nucleicacidsresearch2003；31:e15.8.JohnsonWE,LiC,RabinovicA.AdjustingbatcheffectsinmicroarrayexpressiondatausingempiricalBayesmethods.Biostatistics2007；8:118-27.9.SubramanianA,TamayoP,MoothaVK，等人.Genesetenrichmentanalysis:aknowledge-basedapproachforinterpretinggenome-wideexpressionprofiles.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2005；102:15545-50.10.EineckeG,ReeveJ,SisB，等人.Amolecularclassifierforpredictingfuturegraftlossinlatekidneytransplantbiopsies.TheJournalofclinicalinvestigation2010；120:1862-72.11.NaesensM,KhatriP,LiL，等人.Progressivehistologicaldamageinrenalallograftsisassociatedwithexpressionofinnateandadaptiveimmunitygenes.Kidneyinternational2011；80:1364-76.12.ParkWD,GriffinMD,CornellLD,CosioFG,StegallMD.Fibrosiswithinflammationatoneyearpredictstransplantfunctionaldecline.JAmSocNephrol2010；21:1987-97.13.IsoniemiH,TaskinenE,HayryP.Histologicalchronicallograftdamageindexaccuratelypredictschronicrenalallograftrejection.Transplantation1994；58:1195-8.14.CosioFG,GrandeJP,WadeiH,LarsonTS,GriffinMD,StegallMD.Predictingsubsequentdeclineinkidneyallograftfunctionfromearlysurveillancebiopsies.Americanjournaloftransplantation:officialjournaloftheAmericanSocietyofTransplantationandtheAmericanSocietyofTransplantSurgeons2005；5:2464-72.15.StegallMD,ParkWD,LarsonTS，等人.Thehistologyofsolitaryrenalallograftsat1and5yearsaftertransplantation.Americanjournaloftransplantation:officialjournaloftheAmericanSocietyofTransplantationandtheAmericanSocietyofTransplantSurgeons2011；11:698-707.16.MannonRB,MatasAJ,GrandeJ，等人.Inflammationinareasoftubularatrophyinkidneyallograftbiopsies:apotentpredictorofallograftfailure.Americanjournaloftransplantation:officialjournaloftheAmericanSocietyofTransplantationandtheAmericanSocietyofTransplantSurgeons2010；10:2066-73.17.HayryP,PaavonenT,TaskinenE，等人.ProtocolcoreneedlebiopsyandhistologicalchronicallograftdamageindexassurrogateendpointforLong-Termgraftsurvival.TransplantProc2004；36:89-91.18.SeronD,MoresoF,BoverJ，等人.Earlyprotocolrenalallograftbiopsiesandgraftoutcome.KidneyInt1997；51:310-6.19.SeronD,MoresoF,FulladosaX,HuesoM,CarreraM,GrinyoJM.Reliabilityofchronicallograftnephropathydiagnosisinsequentialprotocolbiopsies.KidneyInt2002；61:727-33.20.NankivellBJ,Fenton-LeeCA,KuypersDR，等人.Effectofhistologicaldamageonlong-termkidneytransplantoutcome.Transplantation2001；71:515-23.21.FurnessPN,TaubN,AssmannKJ，等人.Internationalvariationinhistologicgradingislarge,andpersistentfeedbackdoesnotimprovereproducibility.AmJSurgPathol2003；27:805-10.22.El-ZoghbyZM,StegallMD,LagerDJ，等人.Identifyingspecificcausesofkidneyallograftloss.Americanjournaloftransplantation:officialjournaloftheAmericanSocietyofTransplantationandtheAmericanSocietyofTransplantSurgeons2009；9:527-35.23.ChapmanJR.Doprotocoltransplantbiopsiesimprovekidneytransplantoutcomes？CurrOpinNephrolHypertens2012；21:580-6.24.ShishidoS,AsanumaH,NakaiH，等人.Theimpactofrepeatedsubclinicalacuterejectionontheprogressionofchronicallograftnephropathy.JAmSocNephrol2003；14:1046-52.25.KurtkotiJ,SakhujaV,S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