專利名稱：用于移植的同種異體皮膚的處理方法及由其制備的冷凍保存同種異體皮膚的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于移植的同種異體皮膚的處理方法及由其制備的冷凍保存同種異體皮膚。更詳細(xì)地，涉及以二甲基亞砜(dimethyl s ulfoxide)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine serum)為基本成分，在其中添加蔗糖(sucrose)，從而制得冷凍保護(hù)劑， 然后利用該溶液冷凍處理用于移植的皮膚組織的方法。
背景技術(shù)：
皮膚是覆蓋整個(gè)人體表面的最大器官，其防止體液的流失，以及防止有害物質(zhì)和微生物由外部進(jìn)入，抵御來自物理、化學(xué)方面的刺激等，執(zhí)行保護(hù)我們身體的功能。對(duì)于因嚴(yán)重的燒傷、外傷、上皮癌切除及皮膚疾病等而使皮膚嚴(yán)重受損的患者，應(yīng)起到阻止受損部位感染及體液損失的保護(hù)膜的作用，同時(shí)應(yīng)使患者的傷口部位不留下疤痕，防止在自然愈合過程中可能發(fā)生的嚴(yán)重收縮。用于使受損的皮膚組織再生的方法有以下三種移植患者自身皮膚的自體移植(autograft)、移植他人皮膚的同種異體移植(allograft)及移植動(dòng)物皮膚的異種移植(xenograft)。這些方法中自體移植最為理想，但燒傷部位范圍大的情況下，能夠確保組織的部位有限，在取皮部位還會(huì)留下新的傷口，因此存在困難。同種異體移植與其說起到永久移植的作用，不如說起到有助于傷口周圍區(qū)域的細(xì)胞移動(dòng)和愈合的作用。特別是在表皮層、真皮層及直至皮下層受損的3度燒傷的情況下，必須要進(jìn)行皮膚移植治療。現(xiàn)在主要采用的皮膚移植治療方法為自體移植方法，由于在摘除了皮膚的健康部位產(chǎn)生新的外傷，因此增加了患者的痛苦，需要很長(zhǎng)時(shí)間痊愈，并且經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)也大。此夕卜，如嚴(yán)重的燒傷患者沒有足夠的身體健康部位的情況下，存在無法采用自體移植方法或需要進(jìn)行多次移植手術(shù)的問題。試圖通過采用他人皮膚的同種異體移植或采用豬等其它動(dòng)物皮膚的異種移植等來解決上述問題，但這樣不僅會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，還會(huì)帶來其它多種副作用。并且，國(guó)內(nèi)外醫(yī)院實(shí)施的燒傷手術(shù)最普遍的情況為先將壞死的表皮層和真皮層去除，然后利用捐贈(zèng)者尸體的皮膚，去除表皮后，利用去除了真皮內(nèi)細(xì)胞的無細(xì)胞真皮進(jìn)行皮膚移植，以消除免疫排斥反應(yīng)。之后培養(yǎng)的角質(zhì)細(xì)胞在其上完成完整的皮膚。這樣完成的皮膚含有基膜層，因此能夠像實(shí)際皮膚一樣起到保護(hù)我們身體的作用，防止外界有害物質(zhì)的進(jìn)入。但是這種用于移植的皮膚價(jià)格非常昂貴，并且大部分為進(jìn)口產(chǎn)品，存在供需不暢的問題。另外，目前廣泛采用的用于處理從捐贈(zèng)者身上摘取的皮膚的方法為對(duì)皮膚用不同濃度的甘油進(jìn)行處理的甘油保存法，但該方法使細(xì)胞失去生命力而使得細(xì)胞存活率低，導(dǎo)致治療時(shí)間長(zhǎng)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題因此，本發(fā)明的目的在于提供一種新的用于移植的同種異體皮膚的處理方法，并以此作為技術(shù)課題，該方法在對(duì)用于移植的皮膚進(jìn)行加工時(shí)，與現(xiàn)有的甘油保存法相比，能夠更加有效地提高細(xì)胞的存活率，使生物學(xué)性質(zhì)的變化最小化。解決技術(shù)問題的技術(shù)手段為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供用于移植的同種異體皮膚的處理方法，其包括下列步驟i)混合胎牛血清(fetal bovine serum)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide)；ii)在上述溶液中溶解蔗糖(sucrose)，從而制得冷凍保護(hù)劑；iii)將上述冷凍保護(hù)劑浸透于分離的皮膚中；iv)將浸透了冷凍保護(hù)劑的皮膚在程序冷凍儀(controlled rate f reezer)中冷凍。本發(fā)明還提供由上述處理方法制得的冷凍保存同種異體皮膚。下面詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑中使用的基本成分為二甲基亞砜、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清。以重量為基準(zhǔn)，本發(fā)明使用的二甲基亞砜、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清優(yōu)選的混合比為 1 3 5 4 6。本發(fā)明中，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的混合比小于3時(shí)，會(huì)因?yàn)楸匦锠I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏而產(chǎn)生細(xì)胞死亡率增加的問題，如果大于5，冷凍時(shí)，由于發(fā)生冷害，會(huì)存在細(xì)胞死亡率增加的問題。本發(fā)明中，胎牛血清的混合比小于4時(shí)，由于防冷害血漿蛋白的缺乏，會(huì)發(fā)生冷凍時(shí)因冷害引起的問題，如果大于6，會(huì)因?yàn)檠獫{成分過多，會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞活性方面的問題。以重量為基準(zhǔn)，本發(fā)明使用的二甲基亞砜、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清最優(yōu)選的混合比為1 4 5。本發(fā)明的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基可以使用本領(lǐng)域公知的任意的培養(yǎng)基。本發(fā)明中可以使用的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基例如有MEM、DMEM、RPMI 1640、IMDM、特定角化細(xì)胞-無血清培養(yǎng)基(Defined Keratinocyte-SFM)(不含 ΒΡΕ)、角化細(xì)胞(Keratinocyte)-SFN (含 ΒΡΕ)、 敲除(KnockOut)D-MEM、AmnioMAX-II完全培養(yǎng)基、AmnioMAX-ClOO完全培養(yǎng)基等，但并不限于這些。本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑是在上述混合有基本成分的溶液中溶解蔗糖(sucrose)而制得的。在本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑中加入蔗糖，保護(hù)其免受冷凍細(xì)胞膜和細(xì)胞膜蛋白質(zhì)時(shí)出現(xiàn)的冰晶的影響并使其穩(wěn)定的作用。因此，根據(jù)本發(fā)明的處理方法制得的冷凍保存同種異體皮膚的細(xì)胞存活率能夠得以提高，采用蔗糖、胎牛血清及二甲基亞砜的理想混合比，能夠使細(xì)胞存活率得到更大的提高。本發(fā)明中的蔗糖優(yōu)選為在上述混合有基本成分的溶液中以最終濃度為25 40重量％進(jìn)行溶解。如果本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑中的蔗糖濃度小于25重量％，會(huì)降低提高細(xì)胞存活率所需的細(xì)胞膜和膜蛋白質(zhì)的保護(hù)及穩(wěn)定等作用，如果大于40 重量％，會(huì)由于高濃度的糖(sugar)成分，誘發(fā)細(xì)胞死亡率的增加。本發(fā)明的冷凍保護(hù)劑最優(yōu)選為使蔗糖在上述混合有基本成分的溶液中以最終濃度為30重量％進(jìn)行溶解。本發(fā)明中，在皮膚組織中浸透冷凍保護(hù)劑可以使用本領(lǐng)域公知的多種方法，優(yōu)選在低溫反應(yīng)器中，使冷凍保護(hù)劑浸透皮膚。浸透所需的時(shí)間根據(jù)皮膚組織的大小等有所不同，例如在4°C的低溫反應(yīng)器中，可以浸透約6 M小時(shí)。本發(fā)明中浸透了冷凍保護(hù)劑的皮膚可以使用程序冷凍儀(control led rate
4freezer)進(jìn)行冷凍。冷凍時(shí)使用程序冷凍儀能夠以期望的速度冷凍皮膚。本發(fā)明中使用程序冷凍儀冷凍皮膚的速度優(yōu)選為-0. I0C /min至-7V /min，最優(yōu)選為_1°C /min。本發(fā)明進(jìn)行冷凍時(shí)，由于浸透了冷凍保護(hù)劑的皮膚的溫度和程序冷凍儀腔室(chamber)的溫度不能夠相同，因此在冷凍時(shí)，由于從發(fā)生潛在熔化熱的區(qū)域急速冷凍至沒有水分子運(yùn)動(dòng)的-80°C 溫度，其速度每分鐘超過10°C，因此若不能夠調(diào)節(jié)潛在熔化熱，則會(huì)發(fā)生冰晶現(xiàn)象，使組織破壞。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的處理方法制備的冷凍保存同種異體皮膚的細(xì)胞存活率高，細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)的變化也小，從而有助于移植部位快速生成肉芽組織，可以提高無細(xì)胞真皮的移植率并縮短治療周期。


圖1為示出使用TUNEL分析法對(duì)甘油保存皮膚(GPA)及冷凍保存皮膚(CPA)進(jìn)行細(xì)胞死亡率分析的圖表。圖2為將甘油保存皮膚進(jìn)行H&E染色后，用光學(xué)顯微鏡放大200倍后拍攝的照片， 圖3為將冷凍保存皮膚進(jìn)行H&E染色后，用光學(xué)顯微鏡放大200倍后拍攝的照片。圖4為將甘油保存皮膚進(jìn)行TUNEL染色后，用熒光顯微鏡放大100倍后拍攝的照片，圖5為將冷凍保存皮膚進(jìn)行TUNEL染色后，用熒光顯微鏡放大100倍后拍攝的照片。圖6為示出使用TUNEL分析法，對(duì)細(xì)胞死亡率隨蔗糖濃度差異的變化進(jìn)行分析的圖表。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅是為了幫助理解本發(fā)明而進(jìn)行的例示，并不能限制本發(fā)明的范圍。由于捐贈(zèng)者(尸體)的人體皮膚組織的應(yīng)用受到限制，因此使用了接近人體皮膚的豬皮，根據(jù)下述實(shí)施例及比較例的方法分別制備了 10份冷凍保存皮膚及甘油保存皮膚。實(shí)施例使用豬皮按照下述步驟準(zhǔn)備冷凍保存皮膚。(1)用生理鹽水洗凈豬皮。(2)將豬皮分別切成5 X IOcm2的大小。(3)以1 4 5的重量比混合二甲基亞砜(Sigma，美國(guó))、DMEM(GIBC0，美國(guó))及胎牛血清(GIBC0，美國(guó))。(4)加入蔗糖溶解，使(3)的溶液中蔗糖的最終濃度為30重量％，從而制得冷凍保護(hù)劑。(5)在(4)的冷凍保護(hù)劑中加入O)的豬皮。(6)準(zhǔn)備 4°C 的低溫反應(yīng)器(P-039，KoaTech)。(7)在4°C的低溫反應(yīng)器中放入(5)的豬皮，然后浸透冷凍保護(hù)劑12小時(shí)。(8)將浸透好的豬皮和50ml的冷害保護(hù)劑放入聚酰胺袋(低溫包裝袋 (CryoBag)，奧利金(Origen)，美國(guó))中。
(9)準(zhǔn)備程序冷凍儀(14S-A，SY實(shí)驗(yàn)室，美國(guó))。(10)將(8)的聚酰胺袋放入程序冷凍儀中，以-1°C /min的速度冷凍至_150°C。(11)冷凍結(jié)束后，直至分析實(shí)驗(yàn)前，將聚酰胺袋冷凍保存于絕熱包裝(Dry shipper)中。比較例使用豬皮按照下述步驟依次用50%的甘油及85%的甘油進(jìn)行處理，從而準(zhǔn)備甘油保存皮膚。(1)用生理鹽水洗凈豬皮。(2)將豬皮分別切成5 X IOcm2的大小。(3)將豬皮浸泡于用蒸餾水稀釋的50%的甘油中72小時(shí)。(4)將(3)的皮膚在85%的甘油中浸泡72小時(shí)。實(shí)驗(yàn)例1利用TUNEL (脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling))
比較例準(zhǔn)備的豬皮進(jìn)行了分析。TUNEL分析是使用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit)，熒光素(Fluorescein) (Roche，德國(guó))，并按照制造者的指示實(shí)施的。對(duì)細(xì)胞的死亡率進(jìn)行分析的結(jié)果(結(jié)果為10個(gè)試樣的平均值)如圖1所示。用顯微鏡(奧林巴斯(Olympus)B)(51)拍攝了實(shí)施例及比較例的皮膚，示于圖2、圖 3、圖4及圖5。由圖1的結(jié)果可以看出，與比較例相比，實(shí)施例的細(xì)胞死亡率要低4 5倍程度。此外，由圖2、圖3、圖4及圖5的顯微鏡照片可知，實(shí)施例中的細(xì)胞死亡顯然低于比較例。S卩、本發(fā)明的處理方法與現(xiàn)有的甘油保存處理方法相比，顯示出了高的細(xì)胞存活率，因此根據(jù)本發(fā)明的處理方法制備的用于移植的皮膚有助于移植部位快速生成肉芽組織，能夠提高無細(xì)胞真皮的移植率并縮短治療周期。實(shí)驗(yàn)例2為了觀察本發(fā)明中細(xì)胞死亡率隨蔗糖濃度差異的變化，除了將蔗糖濃度分別調(diào)至 5、10、15、20、25、30、35及40重量％來制備并使用冷凍保護(hù)劑以外，其余同上述實(shí)施例的方法來準(zhǔn)備冷凍保存皮膚，然后利用TUNEL分析法進(jìn)行分析。TUNEL分析是使用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit)，熒光素(Fluorescein) (Roche, 德國(guó))，并按照制造者的指示實(shí)施的。熒光標(biāo)記使用了 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚， 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)。對(duì)細(xì)胞的死亡率進(jìn)行分析的結(jié)果如下表1所示，作為圖表如圖6所示。表 權(quán)利要求
1.用于移植的同種異體皮膚的處理方法，其包括下列步驟i)混合二甲基亞砜、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清； )在上述溶液中溶解蔗糖，從而制得冷凍保護(hù)劑；iii)將上述冷凍保護(hù)劑浸透于分離的皮膚中；iv)將浸透了冷凍保護(hù)劑的皮膚在程序冷凍儀中冷凍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于移植的同種異體皮膚的處理方法，其特征在于，使蔗糖在上述步驟i)的溶液中以最終濃度為25 40重量％進(jìn)行溶解。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于移植的同種異體皮膚的處理方法，其特征在于，蔗糖的最終濃度為30重量％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于移植的同種異體皮膚的處理方法，其特征在于，以重量為基準(zhǔn)，二甲基亞砜、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清的混合比為1 3 5 4 6。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于移植的同種異體皮膚的處理方法，其特征在于，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基選自 MEM、DMEM、RPMI 1640 及 IMDM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于移植的同種異體皮膚的處理方法，其特征在于，將冷凍保護(hù)劑浸透于分離的皮膚是在4°C的低溫反應(yīng)器中，浸透6 M小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于移植的同種異體皮膚的處理方法，其特征在于，浸透了冷凍保護(hù)劑的皮膚在程序冷凍儀中，以-1°C /min的速度進(jìn)行冷凍。
8.由權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法處理得到的冷凍保存同種異體皮膚。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于移植的同種異體皮膚的處理方法及由其制備的冷凍保存同種異體皮膚。更詳細(xì)地，涉及以二甲基亞砜、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清為基本成分，在其中添加蔗糖，從而制得冷凍保護(hù)劑，然后利用該溶液冷凍處理用于移植的皮膚組織的方法。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102480935SQ201080033190
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月22日
發(fā)明者崔源益, 田旭, 鄭載得 申請(qǐng)人:Cg生物技術(shù)有限公司