本發(fā)明涉及一種人工皮膚組織培養(yǎng)的氣液界面生物反應(yīng)器及其制備方法和使用方法。

背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，是人體阻礙水流失、紫外、機(jī)械傷害、毒性及細(xì)菌病毒傷害的一道重要防線。若大面積燒傷病人不能及時(shí)進(jìn)行治療，傷口就會(huì)發(fā)炎，導(dǎo)致死亡。針對(duì)大面積(直徑大于1cm2)的皮膚缺失，治療的黃金準(zhǔn)則是“自體皮膚移植”。然而，大面積皮膚缺失者自體皮膚遠(yuǎn)不足以供應(yīng)傷者所需。異體移植(如他人、尸體皮膚)不但數(shù)量少、價(jià)格昂貴，而且引入新的病毒而造成安全隱患。組織工程被譽(yù)為“再生”之科學(xué)，隨著其發(fā)展，人工皮膚的問(wèn)世能部分解決上述問(wèn)題。其價(jià)格雖然不足以匹敵真人皮膚，但其昂貴的價(jià)格使許多傷者無(wú)法負(fù)擔(dān)而選擇放棄治療。造成人工皮膚成本較高的主要因素是人工皮膚培養(yǎng)周期長(zhǎng)(4～6周)且需要?dú)庖航缑?Air-LiquidInterface,ALI)復(fù)雜的培養(yǎng)模式?，F(xiàn)今大多數(shù)公司采用懸掛式培養(yǎng)小室(Transwell)進(jìn)行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式需要大量操作員頻繁更換培養(yǎng)液，且在更換過(guò)程中會(huì)因部分樣品染菌導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決常用的懸掛式培養(yǎng)小室需要大量操作員頻繁更換培養(yǎng)液且在更換過(guò)程中部分樣品會(huì)染菌的問(wèn)題，提供了一種基于注射泵的閉合式連續(xù)灌注式生物反應(yīng)器及其制備方法和使用方法。本發(fā)明用于人工皮膚組織培養(yǎng)的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器包括上蓋、下托蓋、進(jìn)氣管、出氣管、進(jìn)液管、出液管、注氣注射器、注液注射器和收集裝置；所述上蓋的下表面有一個(gè)槽，槽的一端有一個(gè)通孔，槽的另一端有一個(gè)通孔；所述的下托蓋中間有一個(gè)盲孔，下托蓋內(nèi)部垂直于盲孔開(kāi)有左側(cè)通道和右側(cè)通道，左側(cè)通道的左端有一個(gè)通向上蓋上表面的孔，右側(cè)通道的右端有一個(gè)通向上蓋上表面的孔；所述的盲孔的下半部設(shè)置有一個(gè)圓筒體，所述的圓筒體的側(cè)壁均勻分布有多個(gè)通孔，圓筒體里面放置海綿，海綿上平面與左側(cè)通道和右側(cè)通道上平面及圓筒體的上開(kāi)口水平；所述的通孔與進(jìn)氣管連接、通孔與出氣管連接、孔與進(jìn)液管連接和孔與出液管連接；其中通孔通過(guò)進(jìn)氣管連接注氣注射器，注氣注射器通入CO2和空氣；孔通過(guò)進(jìn)液管連接注液注射器，注液注射器通入分化培養(yǎng)液；通孔通過(guò)出氣管排出廢氣，孔通過(guò)出液管連接收集裝置，收集裝置收集廢液；所述上蓋的下表面與下托蓋的上表面之間為密封連接。本發(fā)明用于人工皮膚組織培養(yǎng)的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的制備方法按以下步驟進(jìn)行：一、PDMS模型的澆鑄將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用膠粘在玻璃片上，再將固化劑(SYLGARD184)與PDMS的預(yù)聚物(SYLGARD184)按質(zhì)量比為1：10充分混合后澆灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脫氣10min～30min，至沒(méi)有氣泡為止，澆鑄成PDMS和PMMA的組合模具；二、PDMS模型的固化將組合模具放入80℃～100℃恒溫箱中固化1.5h～2.5h；三、對(duì)PDMS模型打孔將固化后的PDMS從PMMA模具上小心取下，利用直徑為0.4mm～0.6mm的打孔針對(duì)PDMS模型打孔；四、PDMS模型的鍵合利用等離子清洗機(jī)對(duì)中層PDMS模型和下層PDMS模型進(jìn)行鍵合。五、氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的組合將通孔分別與進(jìn)氣管、出氣管、進(jìn)液管和出液管連接，將上蓋與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型組成的下托蓋密封；將進(jìn)氣管與注氣注射器連接、出氣管置于裝置外以排出廢氣、進(jìn)液管與注液注射器連接并將出液管連接收集器；組成氣液界面灌注式生物反應(yīng)器。本發(fā)明用于人工皮膚組織培養(yǎng)的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的使用方法是按以下步驟進(jìn)行：一、將整個(gè)PDMS生物反應(yīng)器裝置中的不同組成部分均進(jìn)行三次不同方式滅菌；二、三次滅菌后將海綿放置于盲孔下半部的圓筒體內(nèi)，保持海綿上平面與左側(cè)通道和右側(cè)通道上平面及圓筒體的上開(kāi)口水平，主要目的是使皮膚組織與水凝膠的上表面與通入的CO2和空氣接觸、下表面與通入的分化培養(yǎng)液接觸；將種有皮膚細(xì)胞的水凝膠放在海綿上，海綿的主要目的是用于支撐皮膚組織與水凝膠；三、將通孔分別與進(jìn)氣管、出氣管、進(jìn)液管和出液管連接，對(duì)上蓋與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型組成的下托蓋進(jìn)行密封，將進(jìn)氣管與注氣注射器連接、出氣管置于裝置外以排出廢氣、進(jìn)液管與注液注射器連接和出液管連接收集器；四、向注液注射器通入分化培養(yǎng)液；向注氣注射器通入CO2和空氣。本發(fā)明的原理在于：澆鑄的PDMS模型含有兩個(gè)封閉式灌注通道，通道兩側(cè)有孔用于連接軟管；下層封閉式灌注通道通過(guò)軟管通入分化培養(yǎng)液，下層封閉式灌注通道過(guò)軟管通入含有CO2的空氣，實(shí)現(xiàn)了人體皮膚細(xì)胞外側(cè)與空氣接觸且內(nèi)側(cè)與營(yíng)養(yǎng)液體接觸的環(huán)境。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)其優(yōu)點(diǎn)在于：1.本發(fā)明基于注射泵的閉合式連續(xù)灌注式生物反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)了氣液界面復(fù)雜的培養(yǎng)模式。相比于傳統(tǒng)培養(yǎng)皿中的靜態(tài)培養(yǎng)，一方面減少因頻繁更換培養(yǎng)液帶來(lái)的染菌風(fēng)險(xiǎn)，提高培養(yǎng)成功率；另一方面實(shí)現(xiàn)了模擬人體生理環(huán)境的灌注式培養(yǎng)，不僅為細(xì)胞提供了充足的營(yíng)養(yǎng)，而且流體可沖走細(xì)胞有害代謝物，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高效培養(yǎng)。利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞在1、4、7天的存活率分別可達(dá)84％～90％、90％～96％和90％～95％，而通常靜態(tài)培養(yǎng)的在1、4、7天的存活率分別為73％～77％、70％～74％和77％～83％。相比之下本發(fā)明培養(yǎng)細(xì)胞的存活率較靜態(tài)培養(yǎng)的總體提高了10％以上。細(xì)胞增殖方面也存在差異，本發(fā)明培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞在1、4、7天細(xì)胞生長(zhǎng)占總面積的20％～24％、72％～76％和94％～98％。在相同條件下比靜態(tài)培養(yǎng)的分別提高了1％～2％、5％～10％和11％～15％。2.利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞在培養(yǎng)分化過(guò)程中較傳統(tǒng)培養(yǎng)皿中靜態(tài)培養(yǎng)的差別在于：本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)分化14、21、28及35天人工表皮厚度分別可達(dá)：22μm～26μm、40μm～46μm、48μm～52μm和56μm～60μm。相比之下本發(fā)明培養(yǎng)細(xì)胞的人工表皮厚度較靜態(tài)培養(yǎng)的總體提高了2μm以上。14、21、28及35天人工表皮層數(shù)分別可達(dá)：2層～4層、4層～6層、6層～8層和7層～9層，較靜態(tài)培養(yǎng)的總體提高了0.5層～1層。3.本發(fā)明提供的制備氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的方法，其換用不同的模具再與聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板經(jīng)螺栓固定就可以實(shí)現(xiàn)適用于不同孔道或者可以進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞組織培養(yǎng)，可操作性強(qiáng)。4.本發(fā)明使用的材料如：注射器、海綿等無(wú)毒且海綿吸水性好、不容易降解是放置種有皮膚細(xì)胞的水凝膠的最好方法，材料價(jià)格低更利于節(jié)約成本。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明氣液界面灌注式生物反應(yīng)器灌注系統(tǒng)的側(cè)視截面圖。圖2為本發(fā)明氣液界面灌注式生物反應(yīng)器灌注系統(tǒng)的局部放大圖。圖3為本發(fā)明向PMMA模具澆鑄成的PDMS和PMMA組合模具的示意圖。圖4為對(duì)PDMS模型打孔的示意圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種用于人工皮膚組織培養(yǎng)的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器，其特征在于：該生物反應(yīng)器包括上蓋1、下托蓋2、進(jìn)氣管4-2、出氣管4-3、進(jìn)液管4-1、出液管4-4、注氣注射器10-1、注液注射器10-2和收集裝置8；所述上蓋1的下表面有一個(gè)槽1-3，槽1-3的一端有一個(gè)通孔1-1，槽1-3的另一端有一個(gè)通孔1-2；所述的下托蓋2中間有一個(gè)盲孔3，下托蓋2內(nèi)部垂直于盲孔3開(kāi)有左側(cè)通道2-3和右側(cè)通道2-4，左側(cè)通道2-3的左端有一個(gè)通向上蓋1上表面的孔2-1，右側(cè)通道2-4的右端有一個(gè)通向上蓋1上表面的孔2-2；所述的盲孔3的下半部設(shè)置有一個(gè)圓筒體5-1，所述的圓筒體5-1的側(cè)壁均勻分布有多個(gè)通孔5-2，圓筒體5-1里面放置海綿5-3，海綿5-3上平面與左側(cè)通道2-3和右側(cè)通道2-4上平面及圓筒體5-1的上開(kāi)口水平；所述的通孔1-1與進(jìn)氣管4-2連接、通孔1-2與出氣管4-3連接、孔2-1與進(jìn)液管4-1連接和孔2-2與出液管4-4連接；其中通孔1-1通過(guò)進(jìn)氣管4-2連接注氣注射器10-1，注氣注射器10-1通入CO2和空氣；孔2-1通過(guò)進(jìn)液管4-1連接注液注射器10-2，注液注射器10-2通入分化培養(yǎng)液；通孔1-2通過(guò)出氣管4-3排出廢氣，孔2-2通過(guò)出液管4-4連接收集裝置8，收集裝置8收集廢液；所述上蓋1的下表面與下托蓋2的上表面之間為密封連接。具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是，進(jìn)氣管4-2與注氣注射器10-1之間連接過(guò)濾器9-1；進(jìn)液管4-1與注液注射器10-2之間連接過(guò)濾器9-2；出氣管4-3連接過(guò)濾器9-3；出液管4-4與收集裝置8之間連接過(guò)濾器9-4；進(jìn)一步防止外界細(xì)菌進(jìn)入系統(tǒng)中污染系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是，所述的通孔1-1、通孔1-2、孔2-1和孔2-2的直徑均為0.4mm～0.6mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是，所述的進(jìn)氣管4-2、出氣管4-3、進(jìn)液管4-1和出液管4-4均為聚四氟乙烯，其其外徑為0.75mm，內(nèi)徑為0.03mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是，所述CO2的體積分?jǐn)?shù)占CO2和空氣總體系的4％～6％。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是，所述的盲孔3直徑為5mm～7mm，高度為7mm～9mm，左側(cè)通道2-3和右側(cè)通道2-4截面寬×高為(0.75mm～1.25mm)×(1.0mm～1.5mm)。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是，所述的圓筒體5-1是可拆卸的，其直徑為5mm～7mm，高度為2mm～4mm，用于放置海綿。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式七相同。具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是，所述的上蓋1的下表面與下托蓋2的上表面之間是由密封裝置6密封的。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式九：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式八不同的是，所述的密封裝置6是由兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1和4套螺栓6-2組成，其中上面的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1有四個(gè)圓形通孔7。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式十：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式九不同的是，所述的兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1的厚度為3mm～4mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十一相同。具體實(shí)施方式十一：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式九不同的是，所述的通孔7的直徑為3mm～5mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十一相同。具體實(shí)施方式十二：本實(shí)施方式的用于人工皮膚組織培養(yǎng)的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的制備方法按以下步驟進(jìn)行：一、PDMS模型的澆鑄將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用膠粘在玻璃片14上，再將固化劑與PDMS的預(yù)聚物充分混合后澆灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脫氣，至沒(méi)有氣泡為止，澆鑄成PDMS和PMMA的組合模具；二、PDMS模型的固化將將組合模具放入恒溫箱中固化；三、對(duì)PDMS模型打孔將固化后的PDMS從聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上取下，利用打孔針對(duì)PDMS打孔；四、PDMS模型的鍵合利用等離子清洗機(jī)對(duì)中層PDMS模型12和下層PDMS模型13進(jìn)行鍵合；五、氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的組合將通孔1-1與進(jìn)氣管4-2連接、通孔1-2與出氣管4-3連接、孔2-1與進(jìn)液管4-1連接和孔2-2與出液管4-4連接；將上蓋1與鍵合好的中層PDMS模型12和下層PDMS模型13組成的下托蓋2密封；將進(jìn)氣管4-2與注氣注射器10-1連接、出氣管4-3置于裝置外以排出廢氣、進(jìn)液管4-1與注液注射器10-2連接并將出液管4-4連接收集器8；組成氣液界面灌注式生物反應(yīng)器。具體實(shí)施方式十三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟一中所述的固化劑和PDMS的預(yù)聚物為灌封膠(DC184)。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式十四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟一中所述的固化劑(SYLGARD184)與PDMS的預(yù)聚物(SYLGARD184)按質(zhì)量比為1：10混合。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式十五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟一中所述的PMMA模具的厚度為1.0mm～2.0mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式十六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟一中所述的真空干燥箱脫氣時(shí)間為10min～30min。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式十七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟二中恒溫箱的溫度設(shè)置為80℃～100℃。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式十八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟二中固化時(shí)間為1.5h～2.5h。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式十九：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟三中所述的打孔針的直徑為0.4mm～0.6mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式二十：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，進(jìn)氣管4-2與注氣注射器10-1之間連接過(guò)濾器9-1；進(jìn)液管4-1與注液注射器10-2之間連接過(guò)濾器9-2；出氣管4-3連接過(guò)濾器9-3；出液管4-4與收集裝置8之間連接過(guò)濾器9-4；防止外界細(xì)菌進(jìn)入系統(tǒng)中污染系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式二十一：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟五所述的上蓋1的下表面與下托蓋2的上表面之間是由密封裝置6密封的。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式二十二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十不同的是，所述的密封裝置6是由兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1和4套螺栓6-2組成，其中上面的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1有四個(gè)圓形通孔7。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十相同。具體實(shí)施方式二十三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十二不同的是，所述的兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1的厚度為3mm～4mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十二相同。具體實(shí)施方式二十四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十二不同的是，所述的通孔7的直徑為3mm～5mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十二相同。具體實(shí)施方式二十五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟五所述的通孔(1-1)、通孔(1-2)、孔(2-1)和孔(2-2)的直徑均為0.4mm～0.6mm。他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式二十六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式十二不同的是，步驟五所述的進(jìn)氣管(4-2)、出氣管(4-3)、進(jìn)液管(4-1)和出液管(4-4)均為聚四氟乙烯，其其外徑為0.75mm，內(nèi)徑為0.03mm。他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式十二相同。具體實(shí)施方式二十七：本實(shí)施方式的用于人工皮膚組織培養(yǎng)的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的使用方法是按以下步驟進(jìn)行：一、將整個(gè)PDMS生物反應(yīng)器裝置中的不同組成部分均進(jìn)行三次不同方式滅菌；二、三次滅菌后將海綿5-3放置于盲孔3下半部的圓筒體5-1內(nèi)，保持海綿5-3上平面與左側(cè)通道2-3和右側(cè)通道2-4上平面及圓筒體5-1的上開(kāi)口水平，主要目的是使皮膚組織與水凝膠的上表面與通入的CO2和空氣接觸、下表面與通入的分化培養(yǎng)液接觸；將種有皮膚細(xì)胞的水凝膠放在海綿5-3上，海綿5-3的主要目的是用于支撐皮膚組織與水凝膠；三、將通孔1-1與進(jìn)氣管4-2連接、通孔1-2與出氣管4-3連接、孔2-1與進(jìn)液管4-1連接和孔2-2與出液管4-4連接；將上蓋1與鍵合好的中層PDMS模型12和下層PDMS模型13組成的下托蓋2密封；將進(jìn)氣管4-2與注氣注射器10-1連接、出氣管4-3置于裝置外以排出廢氣、進(jìn)液管4-1與注液注射器10-2連接并將出液管4-4連接收集器8；四、向注液注射器10-2通入分化培養(yǎng)液；向注氣注射器10-1通入CO2和空氣。具體實(shí)施方式二十八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十七不同的是，步驟一中第一次滅菌按以下方法進(jìn)行：將整套設(shè)備浸入體積分?jǐn)?shù)為70％～80％的乙醇水溶液中滅菌1h～1.5h。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十七相同。具體實(shí)施方式二十九：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十七不同的是，步驟一中第二次滅菌按以下方法進(jìn)行：將整套設(shè)備至于無(wú)菌的細(xì)胞操作臺(tái)，打開(kāi)紫外(UV)燈進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為45min～1h。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十七相同。具體實(shí)施方式三十：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十七不同的是，步驟一中第三次滅菌按以下方法進(jìn)行：用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％～2％的青霉素-鏈霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培養(yǎng)基依次沖洗PTFE管4、圓柱形支架3、下封閉式灌注通道1-1、上封閉式灌注通道1-2和封閉式灌注室1-7。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十七相同。具體實(shí)施方式三十一：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十七不同的是，步驟二中所述種有皮膚細(xì)胞的水凝膠是按以下方法種出來(lái)的：一、將皮膚細(xì)胞種植于水凝膠上，靜止45min～1h后放入24孔板中靜置培養(yǎng)18h～24h；二、將水凝膠連同皮膚細(xì)胞放入生物反應(yīng)器中圓筒體5-1的海綿5-3上進(jìn)行生長(zhǎng)期培養(yǎng)，培養(yǎng)6d～8d，氣液界面分化期培養(yǎng)35d～40d；三、取出人工皮膚與水凝膠，經(jīng)處理后植入人體。具體實(shí)施方式三十二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十七不同的是，步驟三中進(jìn)氣管4-2與注氣注射器10-1之間連接過(guò)濾器9-1；進(jìn)液管4-1與注液注射器10-2之間連接過(guò)濾器9-2；出氣管4-3連接過(guò)濾器9-3；出液管4-4與收集裝置8之間連接過(guò)濾器9-4；防止外界細(xì)菌進(jìn)入系統(tǒng)中污染系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十七相同。具體實(shí)施方式三十三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十七不同的是，所述的通孔1-1、通孔1-2、孔2-1和孔2-2的直徑均為0.4mm～0.6mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十七相同。具體實(shí)施方式三十四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十七不同的是，步驟三中所述的進(jìn)氣管4-2、出氣管4-3、進(jìn)液管4-1和出液管4-4均為聚四氟乙烯，其其外徑為0.75mm，內(nèi)徑為0.03mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十七相同。具體實(shí)施方式三十五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十七不同的是，步驟三中所述的上蓋1的下表面與下托蓋2的上表面之間是由密封裝置6密封的。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十七相同。具體實(shí)施方式三十六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三十五不同的是，所述的密封裝置6是由兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1和4套螺栓6-2組成，其中上面的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1有四個(gè)圓形通孔7。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式三十五相同。具體實(shí)施方式三十七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三十六不同的是，所述的兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板6-1的厚度為3mm～4mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式三十六相同。具體實(shí)施方式三十八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式三十六不同的是，所述的通孔7的直徑為3mm～5mm。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式三十六相同。具體實(shí)施方式三十九：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二十七不同的是，步驟四中所述CO2的體積分?jǐn)?shù)占CO2和空氣總體系的4％～6％。其他步驟與參數(shù)與具體實(shí)施方式二十七相同。用以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明：實(shí)施例1：本發(fā)明制備的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器按以下步驟制備：一、PDMS模型的澆鑄將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用膠粘在玻璃片上，再將固化劑(SYLGARD184)與PDMS的預(yù)聚物(SYLGARD184)按質(zhì)量比為1：10充分混合后澆灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脫氣10min，至沒(méi)有氣泡為止，澆鑄成PDMS和PMMA的組合模具；二、PDMS模型的固化將組合模具放入80℃恒溫箱中固化1.5h；三、對(duì)PDMS模型打孔將固化后的PDMS從PMMA模具上小心取下，利用直徑為0.4mm的打孔針對(duì)PDMS模型打孔；四、PDMS模型的鍵合利用等離子清洗機(jī)對(duì)中層PDMS模型和下層PDMS模型進(jìn)行鍵合。五、氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的組合利用兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓將上層PDMS模型與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型夾緊；使用時(shí)將整個(gè)PDMS生物反應(yīng)器浸入體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇水溶液中滅菌1h；：再將整個(gè)裝置置于無(wú)菌的細(xì)胞操作臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)紫外(UV)燈進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為45min；然后用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的青霉素-鏈霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培養(yǎng)基依次沖洗整個(gè)裝置。三次滅菌后將海綿放置于灌注室內(nèi)下方的圓柱形支架上，確保海綿上平面與下層通道上平面處于同一水平線，主要目的是用于支撐皮膚組織與水凝膠，將種有皮膚細(xì)胞的水凝膠放在海綿上；利用兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓將上層PDMS模型與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型夾緊；用注射器向其中一個(gè)灌注入口通入分化培養(yǎng)液、另一個(gè)通入CO2的體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2和空氣，兩個(gè)出口利用軟管連接過(guò)濾器，防止外界細(xì)菌進(jìn)入系統(tǒng)中污染系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境，過(guò)濾器通過(guò)軟管連接收集器。為驗(yàn)證連續(xù)灌注組織培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)及水凝膠的毒性與粘附性，在生長(zhǎng)期灌注培養(yǎng)1天以后取出灌注培養(yǎng)樣品及靜態(tài)培養(yǎng)樣品用活-死細(xì)胞生存能力及毒性染色試劑進(jìn)行染色分析，計(jì)算生長(zhǎng)期細(xì)胞活性與生長(zhǎng)率。結(jié)果表明：利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞的存活率為85％、細(xì)胞生長(zhǎng)占總生長(zhǎng)面積的22％，靜態(tài)培養(yǎng)的存活率75％、細(xì)胞生長(zhǎng)占總生長(zhǎng)面積的20％；經(jīng)過(guò)分化期養(yǎng)殖14天后，用4％的多聚甲醛水溶液將各時(shí)期培養(yǎng)樣品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常溫浸泡4小時(shí)，接著浸入30％的蔗糖水溶液常溫浸泡4小時(shí)。取出樣品放入長(zhǎng)×寬×高為10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分鐘以后，將樣品連同切片模具盒一起放入裝有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷卻。帶OCT完全凝固后，用冰凍切片機(jī)(LeicaCM3050)將皮膚組織切成5μm后的小片，用正電荷防脫載玻片吸附樣品后，通過(guò)蘇木精-伊紅染色法染色，可測(cè)出傳統(tǒng)靜態(tài)模式培養(yǎng)與灌注模式培養(yǎng)下的皮膚生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明：利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞的人工表皮厚度為24μm、人工表皮層數(shù)為3層而靜態(tài)培養(yǎng)的人工表皮厚度為22μm、人工表皮層數(shù)為2.5層。實(shí)施例2：本發(fā)明制備的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器按以下步驟制備：一、PDMS模型的澆鑄將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用膠粘在玻璃片上，再將固化劑(SYLGARD184)與PDMS的預(yù)聚物(SYLGARD184)按質(zhì)量比為1：10充分混合后澆灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脫氣10min，至沒(méi)有氣泡為止，澆鑄成PDMS和PMMA的組合模具；二、PDMS模型的固化將組合模具放入80℃恒溫箱中固化1.5h；三、對(duì)PDMS模型打孔將固化后的PDMS從PMMA模具上小心取下，利用直徑為0.4mm的打孔針對(duì)PDMS模型打孔；四、PDMS模型的鍵合利用等離子清洗機(jī)對(duì)中層PDMS模型和下層PDMS模型進(jìn)行鍵合。五、氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的組合利用兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓將上層PDMS模型與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型夾緊；使用時(shí)將整個(gè)PDMS生物反應(yīng)器浸入體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇水溶液中滅菌1h；：再將整個(gè)裝置置于無(wú)菌的細(xì)胞操作臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)紫外(UV)燈進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為45min；然后用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的青霉素-鏈霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培養(yǎng)基依次沖洗整個(gè)裝置。三次滅菌后將海綿放置于灌注室內(nèi)下方的圓柱形支架上，確保海綿上平面與下層通道上平面處于同一水平線，主要目的是用于支撐皮膚組織與水凝膠，將種有皮膚細(xì)胞的水凝膠放在海綿上；利用兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓將上層PDMS模型與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型夾緊；用注射器向其中一個(gè)灌注入口通入分化培養(yǎng)液、另一個(gè)通入CO2的體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2和空氣，兩個(gè)出口利用軟管連接過(guò)濾器，防止外界細(xì)菌進(jìn)入系統(tǒng)中污染系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境，過(guò)濾器通過(guò)軟管連接收集器。將人體皮膚細(xì)胞在生長(zhǎng)期灌注培養(yǎng)4天以后，取出灌注培養(yǎng)樣品及靜態(tài)培養(yǎng)樣品用活-死細(xì)胞生存能力及毒性染色試劑進(jìn)行染色分析，計(jì)算生長(zhǎng)期細(xì)胞活性與生長(zhǎng)率。結(jié)果表明：利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞的存活率為90％、細(xì)胞生長(zhǎng)占總生長(zhǎng)面積的74％，而靜態(tài)培養(yǎng)的存活率76％、細(xì)胞生長(zhǎng)占總生長(zhǎng)面積的67％；經(jīng)過(guò)分化期養(yǎng)殖21天后，用4％的多聚甲醛水溶液將各時(shí)期培養(yǎng)樣品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常溫浸泡4小時(shí)，接著浸入30％的蔗糖水溶液常溫浸泡4小時(shí)。取出樣品放入長(zhǎng)×寬×高為10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分鐘以后，將樣品連同切片模具盒一起放入裝有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷卻。帶OCT完全凝固后，用冰凍切片機(jī)(LeicaCM3050)將皮膚組織切成5μm后的小片，用正電荷防脫載玻片吸附樣品后，通過(guò)蘇木精-伊紅染色法染色，可測(cè)出傳統(tǒng)靜態(tài)模式培養(yǎng)與灌注模式培養(yǎng)下的皮膚生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明：利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞的人工表皮厚度為42μm、人工表皮層數(shù)為5層而靜態(tài)培養(yǎng)的人工表皮厚度為38μm、人工表皮層數(shù)為4.5層。實(shí)施例3：本發(fā)明制備的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器按以下步驟制備：一、PDMS模型的澆鑄將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用膠粘在玻璃片上，再將固化劑(SYLGARD184)與PDMS的預(yù)聚物(SYLGARD184)按質(zhì)量比為1：10充分混合后澆灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脫氣30min，至沒(méi)有氣泡為止，澆鑄成PDMS和PMMA的組合模具；二、PDMS模型的固化將組合模具放入90℃恒溫箱中固化2.0h；三、對(duì)PDMS模型打孔將固化后的PDMS從PMMA模具上小心取下，利用直徑為0.5mm的打孔針對(duì)PDMS模型打孔；四、PDMS模型的鍵合利用等離子清洗機(jī)對(duì)中層PDMS模型和下層PDMS模型進(jìn)行鍵合。五、氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的組合利用兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓將上層PDMS模型與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型夾緊；使用時(shí)將整個(gè)PDMS生物反應(yīng)器浸入體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇水溶液中滅菌1.5h；：再將整個(gè)裝置置于無(wú)菌的細(xì)胞操作臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)紫外(UV)燈進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為50min；然后用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％的青霉素-鏈霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培養(yǎng)基依次沖洗整個(gè)裝置。三次滅菌后將海綿放置于灌注室內(nèi)下方的圓柱形支架上，確保海綿上平面與下層通道上平面處于同一水平線，主要目的是用于支撐皮膚組織與水凝膠，將種有皮膚細(xì)胞的水凝膠放在海綿上；利用兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓將上層PDMS模型與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型夾緊；用注射器向其中一個(gè)灌注入口通入分化培養(yǎng)液、另一個(gè)通入CO2的體積分?jǐn)?shù)為6％的CO2和空氣，兩個(gè)出口利用軟管連接過(guò)濾器，防止外界細(xì)菌進(jìn)入系統(tǒng)中污染系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境，過(guò)濾器通過(guò)軟管連接收集器。將人體皮膚細(xì)胞在生長(zhǎng)期灌注培養(yǎng)7天以后，取出灌注培養(yǎng)樣品及靜態(tài)培養(yǎng)樣品用活-死細(xì)胞生存能力及毒性染色試劑進(jìn)行染色分析，計(jì)算生長(zhǎng)期細(xì)胞活性與生長(zhǎng)率。結(jié)果表明：利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞的存活率為91％、細(xì)胞生長(zhǎng)占總生長(zhǎng)面積的96％，而靜態(tài)培養(yǎng)的存活率80％、細(xì)胞生長(zhǎng)占總生長(zhǎng)面積的67％；經(jīng)過(guò)分化期養(yǎng)殖28天后，用4％的多聚甲醛水溶液將各時(shí)期培養(yǎng)樣品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常溫浸泡4小時(shí)，接著浸入30％的蔗糖水溶液常溫浸泡4小時(shí)。取出樣品放入長(zhǎng)×寬×高為10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分鐘以后，將樣品連同切片模具盒一起放入裝有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷卻。帶OCT完全凝固后，用冰凍切片機(jī)(LeicaCM3050)將皮膚組織切成5μm后的小片，用正電荷防脫載玻片吸附樣品后，通過(guò)蘇木精-伊紅染色法染色，可測(cè)出傳統(tǒng)靜態(tài)模式培養(yǎng)與灌注模式培養(yǎng)下的皮膚生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明：利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞的人工表皮厚度為50μm、人工表皮層數(shù)為6層而靜態(tài)培養(yǎng)的人工表皮厚度為45μm、人工表皮層數(shù)為5層。實(shí)施例4：本發(fā)明制備的氣液界面灌注式生物反應(yīng)器按以下步驟制備：一、PDMS模型的澆鑄將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具用膠粘在玻璃片上，再將固化劑(SYLGARD184)與PDMS的預(yù)聚物(SYLGARD184)按質(zhì)量比為1：10充分混合后澆灌于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)模具上，真空干燥箱脫氣30min，至沒(méi)有氣泡為止，澆鑄成PDMS和PMMA的組合模具；二、PDMS模型的固化將組合模具放入90℃恒溫箱中固化2.0h；三、對(duì)PDMS模型打孔將固化后的PDMS從PMMA模具上小心取下，利用直徑為0.5mm的打孔針對(duì)PDMS模型打孔；四、PDMS模型的鍵合利用等離子清洗機(jī)對(duì)中層PDMS模型和下層PDMS模型進(jìn)行鍵合。五、氣液界面灌注式生物反應(yīng)器的組合利用兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓將上層PDMS模型與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型夾緊；使用時(shí)將整個(gè)PDMS生物反應(yīng)器浸入體積分?jǐn)?shù)為75％的乙醇水溶液中滅菌1.5h；：再將整個(gè)裝置置于無(wú)菌的細(xì)胞操作臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)紫外(UV)燈進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間為50min；然后用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％的青霉素-鏈霉素(Penicillin-Streptomycin，P-S)的磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferSolution，PBS)和培養(yǎng)基依次沖洗整個(gè)裝置。三次滅菌后將海綿放置于灌注室內(nèi)下方的圓柱形支架上，確保海綿上平面與下層通道上平面處于同一水平線，主要目的是用于支撐皮膚組織與水凝膠，將種有皮膚細(xì)胞的水凝膠放在海綿上；利用兩片聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄板和4套螺栓將上層PDMS模型與鍵合好的中層PDMS模型和下層PDMS模型夾緊；用注射器向其中一個(gè)灌注入口通入分化培養(yǎng)液、另一個(gè)通入CO2的體積分?jǐn)?shù)為6％的CO2和空氣，兩個(gè)出口利用軟管連接過(guò)濾器，防止外界細(xì)菌進(jìn)入系統(tǒng)中污染系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境，過(guò)濾器通過(guò)軟管連接收集器。將人體皮膚細(xì)胞在生長(zhǎng)期灌注培養(yǎng)7天以后，取出灌注培養(yǎng)樣品及靜態(tài)培養(yǎng)樣品用活-死細(xì)胞生存能力及毒性染色試劑進(jìn)行染色分析，計(jì)算生長(zhǎng)期細(xì)胞活性與生長(zhǎng)率。結(jié)果表明：利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞的存活率為91％、細(xì)胞生長(zhǎng)占總生長(zhǎng)面積的96％，而靜態(tài)培養(yǎng)的存活率80％、細(xì)胞生長(zhǎng)占總生長(zhǎng)面積的67％；經(jīng)過(guò)分化期養(yǎng)殖35天后，用4％的多聚甲醛水溶液將各時(shí)期培養(yǎng)樣品固定20min后，浸入15％的蔗糖(sucrose)水溶液常溫浸泡4小時(shí)，接著浸入30％的蔗糖水溶液常溫浸泡4小時(shí)。取出樣品放入長(zhǎng)×寬×高為10mm×10mm×5mm切片模具盒(CryomoldBiopsy)中，倒入浸泡切削液(OptimalCuttingTemperature，OCT)10分鐘以后，將樣品連同切片模具盒一起放入裝有干冰和100％乙醇混合物上迅速冷卻。帶OCT完全凝固后，用冰凍切片機(jī)(LeicaCM3050)將皮膚組織切成5μm后的小片，用正電荷防脫載玻片吸附樣品后，通過(guò)蘇木精-伊紅染色法染色，可測(cè)出傳統(tǒng)靜態(tài)模式培養(yǎng)與灌注模式培養(yǎng)下的皮膚生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明：利用本發(fā)明制備的設(shè)備培養(yǎng)的人體皮膚細(xì)胞的人工表皮厚度為58μm、人工表皮層數(shù)為7層而靜態(tài)培養(yǎng)的人工表皮厚度為52μm、人工表皮層數(shù)為6層。本發(fā)明使用的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)(8560K171，McMasterCarr公司，新澤西州，美國(guó))經(jīng)激光切割機(jī)切制而成。本發(fā)明選用惰性的PTFE管，其外徑為0.75mm，內(nèi)徑為0.03mm。