專利名稱：產(chǎn)生雙單倍體植物的方法
產(chǎn)生雙單倍體植物的方法本發(fā)明涉及產(chǎn)生雙單倍體植物的新方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及由此獲得的植物以及這些植物的后代、細(xì)胞、組織和種子。自從Guha和Maheshwari在1964年(Nature 204 :497)發(fā)現(xiàn)植物可再生自單倍體孢子，已完成了許多研究來(lái)獲得關(guān)于其它物種的相似認(rèn)識(shí)(參閱例如"^ vitro Haploid production in Higher plants" Vol. 1，2，3，4，5，Eds :S.Jain, S.Sopory and R.Veilleux(1996)Kluwer Academic Publishers)?，F(xiàn)在，為了加速產(chǎn)生基因純系并且也為了評(píng)估和監(jiān)測(cè)難于了解的特性諸如那些由多基因/等位基因編碼的特性，使用雙單倍體(double haploid, DH)的現(xiàn)代植物育種已成為非常有用的工具。在繁殖農(nóng)作物中產(chǎn)生和使用DHs對(duì)許多物種而言是眾所周知的(參閱例如Thomas W. et al. (2003), In :Doubled Haploid production in crop plants. A Manual. Eds. M.Maluszynski, K. Kasha, B. Forster and I.Szarejko. Kluwer Academic Publishers, pp 337-349)?，F(xiàn)在為止，DHs可獲自雄性或雌性器官的孢子。來(lái)自雄性器官的孢子被稱為小孢子，而體外培養(yǎng)物被稱為小孢子培養(yǎng)物。長(zhǎng)期以來(lái)在蕓苔中已很好地建立了典型小孢子培養(yǎng)物(參閱例如 Keller et al. (1984) In :K. Giles, S. Sen (eds.), Plant Cell Culture in Crop Improvement ppl69_183. Plenum Pub. Corp. , New York)。來(lái)自雌性器官的孢子被稱為大孢子，并且這些孢子的體外培養(yǎng)通常被稱為雌核生殖(gynogenesis)。對(duì)于例如糖甜菜以及黃瓜而言雌核生殖是一項(xiàng)成熟的技術(shù)(參閱例如Hosemans D.and Bossoutrot, Ζ.Pflanzenzuchtg. 91 :74-77(1983) ；EP O 374 755)。盡管有許多技術(shù)進(jìn)步，雌核生殖和小孢子培養(yǎng)二者的成功僅限于一些順應(yīng)性較高的基因型。不僅存在對(duì)于產(chǎn)生DHs而言成功率低的植物種類諸如西瓜(Sari N. , Hort. Science 1994，vol. 29(10), 1189-1190)和南瓜(Kurtar Ε. S. et al.，Euphytica, Volume 127 (3)，2002，335-344 (10)，一些物種對(duì)DHs的誘導(dǎo)完全抵制。這意味著DHs的巨大利益不能被用于每一種期望的植物種類。因此本發(fā)明的目標(biāo)是提供適于產(chǎn)生DHs的新方法。此目標(biāo)通過(guò)包含以下步驟的用于產(chǎn)生雙單倍體植物的方法得以實(shí)現(xiàn)a)用有一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉對(duì)非中央細(xì)胞的胚囊細(xì)胞授精；b)使中央細(xì)胞增殖成胚乳；c)從胚乳再生雙單倍體植物。本發(fā)明沒有通過(guò)直接使用小孢子或大孢子獲得DH植物。相反，所述DH植物再生自雌性配子體的中央細(xì)胞。被子植物中有性生殖的特點(diǎn)是被稱為雙重受精的獨(dú)特過(guò)程。這意味著來(lái)自花粉粒的兩個(gè)精細(xì)胞進(jìn)入雌配子體。然后第一個(gè)精細(xì)胞將使單倍體卵細(xì)胞受精，而第二個(gè)精細(xì)胞將使包含兩個(gè)核的中央細(xì)胞受精。從受精卵細(xì)胞將發(fā)育出二倍體胚芽，而從中央細(xì)胞將增殖出三倍體胚乳。不使中央細(xì)胞受精以及/或者沒有來(lái)自受精卵細(xì)胞的引發(fā)，中央細(xì)胞通常不會(huì)增殖成胚乳。唯一的例外是可產(chǎn)生自主胚乳發(fā)育的fis和fie突變體。
不過(guò)，在本發(fā)明中，其中精細(xì)胞之一缺失或失活的突變體花粉將只使卵細(xì)胞受精。 在缺失第二個(gè)精細(xì)胞時(shí)中央細(xì)胞將保持未受精，并因此保持在二倍體階段，它在本質(zhì)上是雙單倍體。卵細(xì)胞受精將引發(fā)未受精的中央細(xì)胞增殖成胚乳。由此可使用對(duì)于許多植物種類可廣泛獲取的適于從胚乳再生三倍體植物的技術(shù)(參閱τ. D. Thomas&R. Chaturvedi, Plant Cell Tissue and Organ Culture 93 :1)來(lái)從未受精中央細(xì)胞產(chǎn)生雙單倍體植物。因此本發(fā)明涉及利用突變體花粉使得只有卵細(xì)胞受精，這將引發(fā)未受精雙單倍體中央細(xì)胞的發(fā)育。在某一實(shí)施方案中，用EMS或類似EMS的化學(xué)藥品諸如EES，BMS，PMS，MES，或MMS 通過(guò)化學(xué)誘變產(chǎn)生具有唯一一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉。在某一實(shí)施方案中，通過(guò)用UV光、X-射線、Y射線輻照或致電離輻射誘變產(chǎn)生只帶一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉。在某一實(shí)施方案中，可用eco-tilling針對(duì)在生殖細(xì)胞中細(xì)胞分裂被抑制的適當(dāng)突變篩選誘變植物。在某一實(shí)施方案中，可用eco-tilling篩選具有只含一個(gè)功能性精細(xì)胞之花粉的天然群體。在某一實(shí)施方案中，抑制生殖細(xì)胞分裂的分子在花粉發(fā)育期間瞬時(shí)表達(dá)，例如通過(guò)存在于質(zhì)粒上的核酸實(shí)現(xiàn)。抑制分子可以是核酸或蛋白質(zhì)，其通過(guò)來(lái)自質(zhì)粒的組成型表達(dá)而在花粉或小孢子中產(chǎn)生。在某一實(shí)施方案中，所述抑制生殖細(xì)胞分裂的分子表達(dá)自穩(wěn)定摻入花粉基因組的核酸。該細(xì)胞分裂抑制分子(可以是核酸或蛋白質(zhì))通過(guò)組成型表達(dá)在花粉或小孢子中產(chǎn)生。依照本發(fā)明的某一實(shí)施方案，通過(guò)用核酸轉(zhuǎn)化可獲得只包含一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉。轉(zhuǎn)化可以任何適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行，諸如通過(guò)根癌土壤桿菌的方法或通過(guò)粒子轟擊(基因槍)的方法。這些轉(zhuǎn)化技術(shù)是眾所周知的。用根癌土壤桿菌方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞是一項(xiàng)成熟技術(shù)，并且例如綜述于文獻(xiàn) De Ia Riva et al.，EJB Vol. 1(3) (1998)，and Bent, Plant Physiol. 124 :1540-1547(2000)中。最近，人們發(fā)現(xiàn)植物的遺傳轉(zhuǎn)化不僅僅局限于土壤桿菌，其它的細(xì)菌也具有轉(zhuǎn)化植物的能力(Broothaerts et al.，Nature 433，6四_633 Q005)，收編于此作為參考)。通過(guò)獲取非致瘤Ti質(zhì)粒(disarmed Ti plasmid)和合適的二元載體使這些植物相關(guān)的共生細(xì)菌適合于進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。這樣的轉(zhuǎn)化體系也適用于本發(fā)明?；驑屴D(zhuǎn)化也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且用于此應(yīng)用的工具多年來(lái)已是商品化了的(Ralph Bock, In =QiagenNews, Issue No. 5，1997)。用于本發(fā)明的合適的技術(shù)也可參閱Barinova等的文章(J Exp Bot. 53(371) 1119-29 (2002))，其中顯示了在小孢子水平的DNA遞送及其在金魚草(Antirrhinum ma jus)中的瞬時(shí)表達(dá)，或者參閱Ramaiah等人關(guān)于紫花苜蓿(Medicago sativa. L.)的文章(Current Science73 :674-682 (1997))。在煙草中用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化小孢子或花粉的方法可參閱BaiAak Bajoghli, (Matrikel number 9802743, University of Vienna, Experimentelle Genetic III.Plant Biotechnology by Alisher Touraev, July 2001)。文獻(xiàn) Van der Leede-Plegt, et al. , TransgenicResearch 4(2) :77-86(1995)描述了通過(guò)微粒轟擊方法將DNA直接遞送入煙草(粘毛煙草 (Nicotiana glutinosa))的花粉內(nèi)。這些和其它技術(shù)可用于本發(fā)明所用花粉或小孢子的轉(zhuǎn)化。在某一實(shí)施方案中，花粉和小孢子由于核酸存在而因此包含細(xì)胞分裂抑制分子。 被引入的核酸可以是細(xì)胞分裂抑制分子本身，或者可以編碼細(xì)胞分裂抑制分子。在后一種情況下，抑制分子是蛋白質(zhì)或肽。在第一種情況中，抑制分子是核酸。所述核酸可抑制其自身或者它可阻斷其它核酸被表達(dá)。例如，核酸可以是或編碼抗CDK蛋白家族或KRP家族的成員的RNAi。本發(fā)明基于只有一個(gè)精細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)化或天然突變體花粉被遞送入胚囊或卵細(xì)胞。 能抑制生殖細(xì)胞中的細(xì)胞分裂的基因構(gòu)建體或分子是本身已知的，并且可用于本發(fā)明的新方法中。在某一實(shí)施方案中，隨后花粉粒被轉(zhuǎn)移至來(lái)自同一物種或其中可發(fā)生所說(shuō)花粉/ 小孢子細(xì)胞的花粉卸載的物種的植物雌蕊上。后者被稱為異源授粉。異源授粉的一個(gè)例子是使用屬于茄科的物種作為花粉供體而以西紅柿作為受體。其它例子可參閱de Martinis, D et al. Planta 214(5) :806-812 (2002)禾口 Dore C et al. , Plant Cell Reports 15: 758-761(1996)。通常，適于異源授粉的物種屬于同一植物科內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生只含一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉的植物和來(lái)自所述植物或其后代的小孢子、卵細(xì)胞、種子、細(xì)胞或組織。最后本發(fā)明涉及可通過(guò)本發(fā)明方法獲得的雙單倍體胚乳以及再生自所述雙單倍體胚乳的植物、所述植物的后代、來(lái)自所述植物或其后代的種子、細(xì)胞、組織、小孢子和卵細(xì)胞。在所有的實(shí)施方案中，所述花粉包含能成功使卵細(xì)胞受精的一個(gè)功能性精細(xì)胞或生殖細(xì)胞。附圖
描述了本發(fā)明的方法。胚囊細(xì)胞1包含三個(gè)反足細(xì)胞2、一個(gè)雙核中央細(xì)胞3 和兩側(cè)是兩個(gè)助細(xì)胞5和6的單倍體卵細(xì)胞4。當(dāng)用具有兩個(gè)功能性精細(xì)胞9和10的野生型花粉8進(jìn)行受精7時(shí)，在胚囊細(xì)胞1中形成了受精的三倍體中央卵細(xì)胞11和受精的二倍體卵細(xì)胞12。通過(guò)發(fā)芽，由胚芽形成了二倍體植物13。用只包含一個(gè)功能性精細(xì)胞15的突變體花粉14進(jìn)行受精16后，中央細(xì)胞17未發(fā)生受精。未受精的中央細(xì)胞17是雙單倍體。受精后卵細(xì)胞18是二倍體。隨后可從中央細(xì)胞17再生出雙單倍體植物19。本發(fā)明將在以下實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。這些實(shí)施例僅供例證說(shuō)明的目的，而不應(yīng)解釋為以任何方式限制了本發(fā)明。
實(shí)施例用突變體花粉授粉和胚乳培養(yǎng)⑶C2A基因在植物的有絲分裂細(xì)胞周期中起核心作用。⑶C2A區(qū)域中的陰性突變產(chǎn)生了其中生殖細(xì)胞的有絲分裂失敗的花粉，這導(dǎo)致了花粉只含有一個(gè)精細(xì)胞(Nowack et al, Nature genetics 38:63(2006))。用實(shí)施例1中獲自西紅柿植物的已轉(zhuǎn)化突變體花粉對(duì)西紅柿花朵進(jìn)行去勢(shì)和授粉。在授粉后，子房擴(kuò)張形成類果實(shí)的形體。這種嫩的果實(shí)樣結(jié)構(gòu)在植物上保持2-4周。植物在受控氣候條件下生長(zhǎng)(22°C白天，18°C晚上)。 收獲果實(shí)并將胚乳與其余的胚芽細(xì)胞分開。然后將胚乳細(xì)胞在通常用于胚乳再生的培養(yǎng)基中孵育(參閱 T. D. Thomas&R. Chaturvedi，Plant Cell Tissue and Organ Culture 93 :1(2008)及其中的參考文獻(xiàn))。用成功生成的植物的葉子通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法確定植物的倍性(K. E. Arumuganathan&E. D. Earle Plant Molecular Biology Reporter9 229)。再生自胚乳的大部分小植株具有與二倍體西紅柿植株相似的核DNA含量，意味著這些植物事實(shí)上是雙單倍體并且沒有發(fā)生中央細(xì)胞的受精。
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生雙單倍體植物的方法，包括以下步驟a)用含一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉使非中央細(xì)胞的胚囊細(xì)胞受精；b)使中央細(xì)胞增殖成胚乳；和c)從胚乳再生出雙單倍體植物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中含一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉是突變體花粉。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述突變體花粉可通過(guò)化學(xué)突變、用核酸轉(zhuǎn)化或輻照獲得。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述化學(xué)突變是通過(guò)用選自EMS，EES，BMS，PMS，MES，或匪S 的化學(xué)試劑處理種子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述輻照是UV輻照、X-射線、Y-射線或致電離輻射。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述核酸是瞬時(shí)表達(dá)的或穩(wěn)定摻入的。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述轉(zhuǎn)化通過(guò)根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或粒子轟擊方法進(jìn)行。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述核酸是或者編碼阻斷調(diào)控第二個(gè)精細(xì)胞形成的基因表達(dá)的RNAi。
9.權(quán)利要求3的方法，其中所述花粉在涉及抑制或阻止第二個(gè)精細(xì)胞形成的基因中被突變。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述突變基因是CDC2A或周期蛋白依賴性激酶蛋白(CDK) 家族的另一成員或KRP蛋白家族基因的陰性突變體。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述花粉粒的一個(gè)精細(xì)胞被破壞。
12.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)生含一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉的植物可通過(guò) eco-tiIling 獲得。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中含一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉來(lái)自就提供胚囊細(xì)胞或卵細(xì)胞的受體植物而言屬于另一物種的供體植物。
14.產(chǎn)生依照權(quán)利要求1至13的只含一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉的植物或來(lái)自所述植物的后代、種子、細(xì)胞或組織。
15.通過(guò)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的方法可獲得的雙單倍體植物或胚乳。
16.來(lái)自權(quán)利要求15的胚乳或植物的后代、種子、細(xì)胞或組織。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生雙單倍體植物的方法，包括用含一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉使非中央細(xì)胞的胚囊細(xì)胞受精；使中央細(xì)胞增殖成胚乳；然后從胚乳再生出雙單倍體植物。含一個(gè)功能性精細(xì)胞的花粉是例如突變體花粉，它可通過(guò)化學(xué)突變、用核酸轉(zhuǎn)化或輻照獲得。
文檔編號(hào)A01H1/08GK102480925SQ201080031510
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者R·H·G·德克斯 申請(qǐng)人:瑞克斯旺種苗集團(tuán)公司