專利名稱：：雪菜單倍體育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種雪菜單倍體育種方法。
背景技術(shù)：
：雪菜屬十字花科蕓苔屬的芥菜種、是分蘗芥的一個(gè)變種。雪菜的別名有很多，如安徽、江蘇和浙江等地稱為"雪里蕻"、"九頭芥"，在湖南、湖北等地稱為"排菜"。它是我國長江流域普遍栽培的冬春兩季重要蔬菜，以葉柄和葉片為食用部分，營養(yǎng)價(jià)值很高。香氣濃郁、滋味清脆鮮美的東坡肉、雪菜肉絲面、雪菜冬夢(mèng)、雪菜豆腐、雪菜黃魚就是以雪菜作為主要成份烹制而成的。所謂單倍體育種，即利用花藥培養(yǎng)等方法誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，并使其單一的染色體各自加倍成對(duì)，成為有活力、能正常結(jié)實(shí)的純合體，從而選育出新的品種，單倍體主要是通過小孢子直接萌發(fā)或經(jīng)過愈傷組織分化成植抹獲得。我國在蕓苔屬作物小孢子培養(yǎng)方面有較多的研究，但對(duì)雪菜小孢子懸浮培養(yǎng)方法的優(yōu)化研究尚未見報(bào)導(dǎo)。由于雪菜小孢子懸浮培養(yǎng)胚胎發(fā)生頻率較低，繼代技術(shù)難度大，難以有效獲得雙單倍體(DH)再生植抹，給抗性育種、品質(zhì)育種和轉(zhuǎn)基因研究等應(yīng)用造成困難。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種雪菜單倍體育種方法，該方法解決了雪菜小孢子懸浮培養(yǎng)胚胎發(fā)生頻率較低的問題。一種雪菜單倍體育種方法，包括以下步驟a.取雪菜主莖或分枝上的花序，在2~4匸誘導(dǎo)12-24個(gè)小時(shí)后，取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾進(jìn)行滅菌；b.將滅菌后的花蕾放入NLN-13培養(yǎng)液中，搗碎、過濾，離心后得到小孢子懸浮液；c.將小孢子懸浮液置于3032。C下熱擊處理2~3天后，在常溫下進(jìn)行黑暗恒溫培養(yǎng)，至肉眼可見胚狀體時(shí)，再在常溫下進(jìn)行黑暗震蕩培養(yǎng)，得到子葉期胚狀體；d.收集子葉期胚狀體，接種至分化培養(yǎng)基，再在組培室中光照培養(yǎng)，分化芽長出后接種至生根培養(yǎng)基，生根、煉苗后移入營養(yǎng)土中培養(yǎng)，得到單倍體植抹；e.用秋水仙堿對(duì)單倍體植株的根系進(jìn)行加倍處理，植抹恢復(fù)正常后移入大田進(jìn)行正常栽培。秋水仙石咸的濃度最好為150~300mg/L，處理時(shí)間最好為15~30h。本發(fā)明方法在胚狀體誘導(dǎo)過程當(dāng)中，對(duì)花蕾進(jìn)行了低溫誘導(dǎo)，對(duì)小孢子進(jìn)行熱擊處理與適溫培養(yǎng)，提高了胚狀體發(fā)生頻率和胚成活率，其胚成活率高達(dá)95%以上。本發(fā)明利用秋水仙堿對(duì)單倍體植株的根系進(jìn)行加倍處理，通過篩選秋水仙堿的濃度，其有效加倍率可達(dá)80%左右。具體實(shí)施方式培養(yǎng)基NLN-13培養(yǎng)基以配置1L培養(yǎng)液為例，需將100ml大量元素(溶液)、10ml微量元素(溶液)、10ml有機(jī)物(溶液)、10ml葉酸(溶液)、10mlFe鹽(溶液)、10ml肌醇(溶液)、130g蔑糖、30mg谷胱甘肽、800mg左旋谷氨酰胺、100mg絲氨酸混合，最終pH調(diào)節(jié)至6.0，過濾滅菌后放于4'C水箱備用。其中大量元素(溶液)、微量元素(溶液)、有機(jī)物(溶液)、Fe鹽(溶液)、葉酸(溶液)、肌醇(溶液)中各組分配比如下I.大量元素(溶液)(g/L)m.有機(jī)物(溶液)認(rèn)031.25維生素Bl0.05Ca(N03)2.4H20維生素B60.05MgS04.7H201.25維生素B50.5KH2P041.25生物素0.005II.微量元素(溶液)氨基乙酸0.2H3B030.62IV.葉酸(溶液)100倍(g/L)4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>分化培養(yǎng)基以配置1L培養(yǎng)基為例，將100ml大量元素(溶液)、10ml微量元素(溶液)、10ml有機(jī)物(溶液)、10mlFe鹽(溶液)、2mg6-BA(溶液)、20g蔗糖、8.25g瓊脂條、100mg肌醇混合，加熱攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至6.0，12(TC滅菌20分鐘，冷卻待用。生根培養(yǎng)基以配置1L培養(yǎng)基為例，將100ml大量元素(溶液)、10ml微量元素(溶液)、10ml有機(jī)物(溶液)、10mlFe鹽(溶液)、20g蔗糖、8.25g瓊脂條、100mg肌醇混合，加熱攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至6.0，120。C滅菌20分鐘，冷卻待用。其中大量元素(溶液)、微量元素(溶液)、有機(jī)物(溶液)、Fe鹽(溶酉己t匕^口下I.<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>分離小孢子采用雪菜優(yōu)良品種七星雞冠菜作為供體材料，供體植抹生長在15tV10。C(晝/夜)的條件下。(l)在清晨或傍晚，從上述雪菜主莖和分枝上摘取健康的花序，放入4。C低溫冰箱中，低溫誘導(dǎo)24小時(shí)，溫度也可調(diào)節(jié)至2。C,從而把處理時(shí)間調(diào)整為12小時(shí)。(2)在無菌室內(nèi)，選取上述花序上單核晚期至雙核早期的雪菜花蕾IO個(gè)放入培養(yǎng)皿，用5.6。/。NaC10溶液滅菌，放于搖床上震蕩15分鐘后，用4'C無菌水沖洗5次。(3)將上述雪菜花蕾放入小燒杯中，加入少量4。C無菌NLN-13培養(yǎng)液，用玻璃棒輕輕搗碎。(4)將擊碎的雪菜花蕾連同NLN-13培養(yǎng)液用40pm尼龍網(wǎng)過濾，倒入50ml離心管，然后用NLN-13多次沖洗燒杯和玻璃棒，并將其一并倒入離心管中，共約10ml。(5)快速將離心管放入低速離心機(jī)進(jìn)行離心5分鐘，轉(zhuǎn)速為800r/min,離心完畢后，倒出上清液，力。NLN-13培養(yǎng)液至10ml,再次快速將離心管放入離心機(jī)進(jìn)行離心5分鐘，離心完畢后，倒出上清液，加NLN-13培養(yǎng)液至40ml，然后加入活性碳溶液(以配50ml活性炭溶液為例活性炭lg、瓊脂糖0.125g、用無菌NLN-13溶液定容至50ml,然后分瓶高壓滅菌，滅菌后放入4。C水箱)3-4滴。活性炭主要是為了吸附懸浮液中某些小孢子產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，可以讓小孢子胚狀體更加健康地生長。培育單倍體植物(1)用5ml移液槍吸取4ml上述小孢子懸浮液分裝于十個(gè)小培養(yǎng)孤中。放入3032。C恒溫培養(yǎng)箱熱擊處理兩至三天，再移至組培室黑暗恒溫培養(yǎng)，溫度控制在2426。C。(2)當(dāng)肉眼可見胚狀體時(shí)(約一個(gè)星期)，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至搖床繼續(xù)震蕩培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速60r/min，24~26°C,黑暗，約兩個(gè)星期左右)，得到子葉期胚狀體。(3)收集子葉期胚狀體，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基繼續(xù)在24~26°C、16h光周期下(光照強(qiáng)度約100pmol/m2s1)進(jìn)行光培養(yǎng)。(4)分化芽長出后接種至生根培養(yǎng)基，待植林發(fā)育良好開瓶煉苗2d,然后移入含水量為60%的營養(yǎng)土(體積比為3:1的泥炭土和珍珠巖的混合物)中培養(yǎng)。加倍處理(5)利用美國BD公司的BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀對(duì)所有幼苗新長出的葉片進(jìn)行倍性分析，如果是單倍體則進(jìn)行秋水仙堿加倍處理。在幼苗健壯時(shí)采用150mg/L秋水仙堿溶液進(jìn)行根系浸根處理30h,也可以采用300mg/L秋水仙堿溶液進(jìn)行根系浸根處理15h。(6)雪菜4直株恢復(fù)正常后移入大田進(jìn)行正常栽培管理。胚成活率的檢驗(yàn)在分離得到小孢子一個(gè)星期后，轉(zhuǎn)移至24。C、16h光照、60r/min條件下振蕩培養(yǎng)至胚狀體轉(zhuǎn)綠。把已轉(zhuǎn)綠的子葉期胚狀體，移入分化固體培養(yǎng)基中，在22。C、16h光周期下(光照強(qiáng)度約100pmol/m2s1)光照培養(yǎng)。胚成活率即在分化培養(yǎng)基上可健康萌發(fā)生長的胚狀體數(shù)與移入培養(yǎng)基的胚狀體總數(shù)的比率。本發(fā)明的胚狀體成活率達(dá)到95%。加倍成功率的檢驗(yàn)經(jīng)秋水仙堿處理所獲得的小植林，重新移入含水量為60%的營養(yǎng)土(體積比為3:l的泥炭土和珍珠巖的混合物)，12周后取新長出葉，用美國BD公司的BDFACSCalibur流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行倍性檢測(cè)，以區(qū)分是單倍體、雙單倍體及四倍體等。雙單倍體加倍成功率為檢測(cè)所得為雙單倍體的植抹數(shù)與所測(cè)再生植株總數(shù)的比率。本發(fā)明的加倍成功率達(dá)到80%。權(quán)利要求1、一種雪菜單倍體育種方法，包括以下步驟a.取雪菜主莖或分枝上的花序，在2～4℃誘導(dǎo)12～24個(gè)小時(shí)后，取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾進(jìn)行滅菌；b.將滅菌后的花蕾放入NLN-13培養(yǎng)液中，搗碎、過濾，離心后得到小孢子懸浮液；c.將小孢子懸浮液置于30～32℃下熱擊處理2～3天后，在常溫下進(jìn)行黑暗恒溫培養(yǎng)，至肉眼可見胚狀體時(shí)，再進(jìn)行黑暗震蕩培養(yǎng)，得到子葉期胚狀體；d.收集子葉期胚狀體，接種至分化培養(yǎng)基，在常溫下光照培養(yǎng)，分化芽長出后接種至生根培養(yǎng)基，生根、煉苗后移入營養(yǎng)土中培養(yǎng)，得到單倍體植株；e.用秋水仙堿對(duì)單倍體植株的根系進(jìn)行加倍處理，植株恢復(fù)正常后移入大田進(jìn)行正常栽培。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的雪菜單倍體育種方法，其特征在于所述的秋水仙堿的濃度為150~300mg/L,處理時(shí)間為15~30h。全文摘要本發(fā)明公開了一種雪菜單倍體育種方法，包括以下步驟取雪菜主莖或大分枝上的花序，低溫誘導(dǎo)后取花序上單核晚期至雙核早期的花蕾進(jìn)行滅菌；將滅菌后的花蕾放入NLN-13培養(yǎng)液中，搗碎、過濾，離心后得到小孢子懸浮液；將小孢子懸浮液熱擊處理后再進(jìn)行常溫黑暗培養(yǎng)得到子葉期胚狀體；收集子葉期胚狀體，轉(zhuǎn)移至固體分化培養(yǎng)基后進(jìn)行分化培養(yǎng)，生根、煉苗后移栽到營養(yǎng)土中，得到單倍體植株；將單倍體植株的根系用秋水仙堿加倍處理，得到雙單倍體植株。本發(fā)明方法在胚狀體誘導(dǎo)過程當(dāng)中，對(duì)花蕾進(jìn)行了低溫誘導(dǎo)，對(duì)小孢子進(jìn)行熱擊處理，提高了胚狀體發(fā)生頻率和胚成活率，其胚成活率高達(dá)95％以上。文檔編號(hào)A01H1/08GK101473789SQ20091009562公開日2009年7月8日申請(qǐng)日期2009年1月13日優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日發(fā)明者萬光龍,周偉軍,王淑珍,玲許,馬華升申請(qǐng)人:浙江大學(xué)