本發(fā)明涉及免疫化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡。

背景技術(shù)：

氟喹諾酮類藥物(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)是20世紀(jì)80年代之后研制并得到廣泛應(yīng)用的一類人工合成抗生素，具有良好的組織滲透性。氟喹諾酮類藥物的作用機(jī)理是抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，使酶不能在DNA雙鏈上引入切口，破壞細(xì)菌的代謝和繁殖，達(dá)到迅速殺滅細(xì)菌的目的，其對革蘭氏陽性和陰性桿菌、葡萄球菌和肺炎球菌均有很強的抗菌活性。最初這類藥物用于治療尿道感染，后來發(fā)展到治療系統(tǒng)感染性疾病，主要用于泌尿系統(tǒng)感染、皮膚感染、呼吸道感染、消化道炎癥、傷寒和敗血癥等疾病的治療。由于它們具有吸收好、半衰期長、抗菌譜廣、抗菌活性強、低毒高效、安全價廉，多數(shù)品種可以口服等許多優(yōu)點，因此在臨床中得到了廣泛應(yīng)用，并且在動物飼養(yǎng)中作為預(yù)防和治療藥物普遍使用，有時還作為飼料添加劑促進(jìn)動物生長，提高生長速度與產(chǎn)量。

氟喹諾酮類藥物在獸醫(yī)臨床上長期和大量使用，必然會導(dǎo)致其在動物性食品中的殘留，從而給食品衛(wèi)生及人類健康帶來潛在的危害。研究表明：長期使用氟喹諾酮類抗生素易導(dǎo)致動物群體體內(nèi)致病菌產(chǎn)生耐藥性，并且這種耐藥性可能由動物微生物向人類病原菌傳播；而且該類藥物在動物體內(nèi)代謝緩慢，人體攝入后，會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)及關(guān)節(jié)部位造成不良反應(yīng)，嚴(yán)重時，可引起食用者產(chǎn)生遠(yuǎn)期毒性及潛在的致癌、致畸、致突變效應(yīng)。因此，氟喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的廣泛關(guān)注。我國以及世界衛(wèi)生組織、歐盟、美國、日本等國家和組織都將氟喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥藥物清單中，并制訂出相應(yīng)的最高殘留限量(maximum residue limit，MRL)和休藥期，而且加大了其殘留監(jiān)管力度。歐盟規(guī)定：動物肌肉、肝臟和腎臟中二氟沙星、恩諾沙星(恩諾沙星+環(huán)丙沙星)、沙拉沙星等氟喹諾酮類獸藥最高殘留量為0.01-1.9mg/kg；美國和加拿大規(guī)定：氟喹諾酮為養(yǎng)蜂業(yè)禁用藥物，蜂王漿中各種氟喹諾酮類藥物MRL為5μg/kg；日本2006年5月29日開始實施“肯定列表制度”后，除有暫定標(biāo)準(zhǔn)的藥物如恩諾沙星、噁喹酸等外，其余FQs均按10μg/kg的“一律標(biāo)準(zhǔn)”；我國規(guī)定FQs在牛奶中的MRL分別為：恩諾沙星(恩諾沙星+環(huán)丙沙星)為100μg/L，達(dá)氟沙星為30μg/L，氟甲喹為50μg/L。2015年9月9號，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告(第2292號)，自2016年12月31日起，停止經(jīng)營、使用用于食品動物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑。

國內(nèi)外用于FQs藥物殘留檢測的方法較多，主要包括高效液相法(HPLC)以及與此相關(guān)的HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS，LC-ESI-MS/MS，另外還有熒光光譜法、高效毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、ELISA、膠體金試紙、微生物學(xué)方法和電解分析法等。膠體金標(biāo)記免疫分析法是近年來迅速發(fā)展的一種新型分析技術(shù)，其特點是簡便快速、成本低、無污染、無需培訓(xùn)，非常適合于現(xiàn)場檢測，與ELISA相比，具有樣品前處理簡單，顯色時間短(3-5min)，且所有試劑包含在一根試紙條上，無需儀器等優(yōu)點，具有廣闊的市場前景和應(yīng)用價值。但目前，市場上銷售的試紙卡同時檢測的FQs獸藥殘留種類少，檢測效率受到影響。因此，研制檢測種類多的試紙卡對于保障動物性食品安全具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供基于培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡，所述試紙卡操作簡單、快速準(zhǔn)確、靈敏度高、成本低、穩(wěn)定性好，能夠進(jìn)行13種氟喹諾酮類藥物的定性檢測。

本發(fā)明提供了一種基于培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡，包括塑料盒體，所述塑料盒體一端設(shè)置有加樣孔，設(shè)置在所述塑料盒體中的試紙條，所述試紙條包括支撐層，設(shè)置在所述支撐層上的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線處設(shè)置有氟喹諾酮類藥物包被抗原，所述質(zhì)控線處設(shè)置有羊抗兔IgG，其特征在于，所述結(jié)合墊上灌注有膠體金標(biāo)記的抗培氟沙星類多克隆抗體；

所述包被抗原為吡哌酸-雞卵清白蛋白偶聯(lián)物，具有式Ⅰ所示結(jié)構(gòu)：

式I中，OVA為雞卵清白蛋白。

優(yōu)選的是，所述抗培氟沙星類多克隆抗體是由培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物免疫新西蘭大白兔制備得到；所述培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物具有式Ⅱ所示結(jié)構(gòu)：

優(yōu)選的是，所述包被抗原的濃度為0.1～0.2μg/ml。

優(yōu)選的是，所述多克隆抗體的濃度為0.22～0.28mg/ml。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述試紙卡在檢測氟喹諾酮類藥物殘留中的應(yīng)用，所述氟喹諾酮類藥物包括培氟沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、氟羅沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、馬波沙星和依諾沙星的一種或多種。

本發(fā)明提供了基于培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡。利用本發(fā)明所述氟喹諾酮類藥物包被抗原和膠體金標(biāo)記的抗培氟沙星類多克隆抗體得到的檢測試紙卡呈廣譜特異性，能識別13種氟喹諾酮類藥物殘留，靈敏度高，特異性強，操作簡單，方便快捷，成本低，易于大范圍推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例7提供的基于培氟沙星類多克隆抗體制備得到的試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例7提供的基于培氟沙星類多克隆抗體制備得到的試紙卡的側(cè)視圖；

圖3為本發(fā)明實施例7提供的基于培氟沙星類多克隆抗體制備得到的試紙卡的俯視圖；

圖4為本發(fā)明實施例2提供的氟喹諾酮類藥物包被抗原合成路線圖；

圖5為本發(fā)明實施例1提供的培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成路線圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了基于培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡，包括塑料盒體，所述塑料盒體一端設(shè)置有加樣孔，設(shè)置在所述塑料盒體中的試紙條，所述試紙條包括支撐層，設(shè)置在所述支撐層上的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線處設(shè)置有氟喹諾酮類藥物包被抗原，所述質(zhì)控線處設(shè)置有羊抗兔IgG，所述結(jié)合墊上灌注有膠體金標(biāo)記的抗培氟沙星類多克隆抗體；

所述包被抗原為吡哌酸-雞卵清白蛋白偶聯(lián)物，具有式Ⅰ所示結(jié)構(gòu)：

式I中，OVA為雞卵清白蛋白。

所述試紙卡的結(jié)構(gòu)如圖1、圖2和圖3所示。其中：1為塑料盒體，2為試紙條，3為支撐層，4為樣品墊，5為金標(biāo)抗體結(jié)合墊，6為硝酸纖維素膜，7為吸收墊，8為加樣孔，9為觀察窗，10為質(zhì)控線(C線)，11為檢測線(T線)，12為膠膜，13為標(biāo)記線。

本發(fā)明提供了一種氟喹諾酮類藥物包被抗原，為吡哌酸-雞卵清白蛋白偶聯(lián)物，具有式Ⅰ所示結(jié)構(gòu)：

式I中，OVA為雞卵清白蛋白。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述包被抗原的制備方法，包括以下步驟：

1)將3-氨基丁酸溶于氫氧化鈉溶液，得到3-氨基丁酸溶液；

將吡哌酸溶于含N,N-二甲基甲酰胺的甲醇溶液中，得到吡哌酸溶液；

將所述3-氨基丁酸溶液滴加到所述吡哌酸溶液中，進(jìn)行碳鏈衍伸化反應(yīng)1.5～3h；

將所述反應(yīng)得到的產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，將所述萃取得到的中間產(chǎn)物酸洗后用碳酸氫鈉溶液反萃取，得到吡哌酸半抗原；

2)將所述步驟1)得到的吡哌酸半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再與三乙胺混合，4～8℃反應(yīng)活化1～2h，得到吡哌酸半抗原反應(yīng)液；

將氯甲酸異丁酯與所述吡哌酸半抗原反應(yīng)液混合，進(jìn)行混合酸酐偶聯(lián)反應(yīng)1～2h，得到吡哌酸反應(yīng)產(chǎn)物；

3)將雞卵清白蛋白溶于碳酸鹽緩沖液中，再與N,N-二甲基甲酰胺反應(yīng)0.5～1h，得到雞卵清白蛋白溶液；

4)將所述步驟2)得到的吡哌酸反應(yīng)產(chǎn)物滴加到所述步驟3)得到的雞卵清白蛋白溶液中，4～8℃反應(yīng)5～8h后透析，得到包被抗原；

所述步驟2)和步驟3)之間、步驟1)和步驟3)之間沒有時間順序的限制。

本發(fā)明上述技術(shù)方案所述包被抗原的制備方法反應(yīng)原理圖如圖4所示。

本發(fā)明將3-氨基丁酸溶于氫氧化鈉溶液，得到3-氨基丁酸溶液。所述3-氨基丁酸的溶解過程優(yōu)選在冰浴攪拌的條件下進(jìn)行，所述3-氨基丁酸溶液的pH值優(yōu)選為8.5～10.5。用作溶劑的氫氧化鈉溶液的濃度為0.01～0.02mol/L，所述3-氨基丁酸溶液的濃度優(yōu)選為1～2mol/L，更優(yōu)選為2mol/L。

本發(fā)明將吡哌酸溶于含N,N-二甲基甲酰胺的甲醇溶液中，得到吡哌酸溶液。所述含N,N-二甲基甲酰胺的甲醇溶液中N,N-二甲基甲酰胺的體積百分含量為40～60％，更優(yōu)選為50％。吡哌酸溶液的質(zhì)量濃度為10～20mg/ml。

得到3-氨基丁酸溶液和吡哌酸溶液后，本發(fā)明將所述3-氨基丁酸溶液滴加到所述吡哌酸溶液中，進(jìn)行碳鏈衍伸化反應(yīng)1.5～3h，更優(yōu)選為2h。所述反應(yīng)優(yōu)選在攪拌條件下進(jìn)行，所述攪拌的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為50～200rpm。

本發(fā)明將所述反應(yīng)得到的產(chǎn)物用乙酸乙酯萃取，將所述萃取得到的的中間產(chǎn)物酸洗后用碳酸氫鈉溶液反萃取，得到吡哌酸半抗原。在本發(fā)明中，所述酸洗優(yōu)選采用稀鹽酸，更優(yōu)選為濃度為0.09～0.18mg/ml的稀鹽酸。在本發(fā)明中，所述碳酸氫鈉溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.01～0.02mol/L；反萃取用反萃劑為質(zhì)量濃度為2.1～4.2mg/ml的碳酸氫鈉溶液進(jìn)行，其產(chǎn)物提取到水相中。

得到吡哌酸半抗原后，本發(fā)明將所述吡哌酸半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再與三乙胺混合，4～8℃反應(yīng)活化1～2h，得到吡哌酸半抗原反應(yīng)液。在本發(fā)明中，所述反應(yīng)溫度優(yōu)選為4℃，所述反應(yīng)時間優(yōu)選為1.5h。吡哌酸半抗原溶解后得到溶液的濃度為12～25mg/ml；在本發(fā)明中，所述吡哌酸半抗原的質(zhì)量和三乙胺的體積比為(1.5～2.5)mg：1μL，更優(yōu)選為1.8mg：1μL；

得到吡哌酸半抗原反應(yīng)液，本發(fā)明將氯甲酸異丁酯與所述吡哌酸半抗原反應(yīng)液混合，進(jìn)行混合酸酐偶聯(lián)反應(yīng)1～2h，更優(yōu)選為1.2h，得到吡哌酸反應(yīng)產(chǎn)物。在本發(fā)明中，所述吡哌酸半抗原的質(zhì)量和氯甲酸異丁酯的體積比為(1.5～2.5)mg：3μL，更優(yōu)選為1.8mg：3μL。反應(yīng)溫度2～8℃。

本發(fā)明將雞卵清白蛋白溶于碳酸鹽緩沖液中，再與N,N-二甲基甲酰胺反應(yīng)0.5～1h，得到雞卵清白蛋白溶液。在本發(fā)明中，所述碳酸鹽緩沖液的濃度優(yōu)選為0.05mol/L，pH值優(yōu)選為9.6。雞卵清白蛋白在緩沖溶液中的濃度10～30mg/ml。所述雞卵清白蛋白與N,N-二甲基甲酰胺優(yōu)選在攪拌條件下進(jìn)行，所述攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)選為50～200rpm。

本發(fā)明將得到的吡哌酸反應(yīng)產(chǎn)物滴加到雞卵清白蛋白溶液中，4～8℃反應(yīng)5～8h后透析，得到包被抗原。所述滴加反應(yīng)優(yōu)選攪拌的條件下進(jìn)行。在本發(fā)明中，所述吡哌酸反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量以吡哌酸半抗原計，與雞卵清白蛋白的質(zhì)量比為1：(2～3)，更優(yōu)選為9：22。所述透析優(yōu)選為：將反應(yīng)液裝入透析袋，置于4℃的碳酸鹽緩沖液中透析；所述透析的時間優(yōu)選為4～6d，更優(yōu)選為5d；本發(fā)明優(yōu)選5～8h換液一次。所述透析后，本發(fā)明將透析后的反應(yīng)液離心取上清，得到包被抗原。

在本發(fā)明中，所述抗培氟沙星類多克隆抗體是由培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物免疫新西蘭大白兔制備得到；所述培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物具有式Ⅱ所示結(jié)構(gòu)：

在本發(fā)明中，所述培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的制備方法包括以下步驟：

對牛血清白蛋白進(jìn)行活化；

采用氨基戊酸對培氟沙星進(jìn)行半抗原衍生化，得到培氟沙星半抗原衍生物；

以所述活化后的牛血清白蛋白與培氟沙星半抗原衍生物為原料，采用碳二亞胺兩步法合成培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物。

本發(fā)明上述技術(shù)方案所述培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的制備方法反應(yīng)原理圖如圖5所示。

本發(fā)明對牛血清白蛋白進(jìn)行活化，得到活化后的牛血清白蛋白(cBSA)。本發(fā)明所述蛋白質(zhì)活化，是為了封閉蛋白質(zhì)上的羧基，提高其氨基偶聯(lián)效率。如將BSA和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶于PBS緩沖液中，攪拌條件下，添加乙二胺溶液，37℃振蕩反應(yīng)1.5～3h；將得到的反應(yīng)液用PBS緩沖液透析3～5d，得到活化的牛血清白蛋白；所述活化的BSA凍干保存，在本發(fā)明中，所述振蕩反應(yīng)的時間更優(yōu)選為2h。本發(fā)明所述乙二胺溶液的溶劑為PBS緩沖液和N,N-二甲基甲酰胺的混合液。所述BSA、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和乙二胺的質(zhì)量比優(yōu)選為30～60：2～5：1，所述PBS緩沖溶液濃度為0.01mol/L,pH值為7.4；所述乙二胺溶液的滴加速率為30～100滴/min。所述攪拌的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為50～200rpm。凍干保存的條件密閉條件下2～8℃凍存。

本發(fā)明采用氨基戊酸對培氟沙星進(jìn)行半抗原衍生化，本發(fā)明對所述衍生化的反應(yīng)條件沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的半抗原衍生化反應(yīng)即可。如將培氟沙星甲磺酸二水化合物、N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶于N,N-二甲基甲酰胺中，室溫下避光攪拌10～15h，離心取上清得到A液；將5-氨基戊酸鹽酸鹽溶于PBS緩沖液中，得到B液；攪拌狀態(tài)下將所述B液緩慢滴入A液中，反應(yīng)3～5h，離心取上清，調(diào)節(jié)pH值為10.0～12.0，棄沉淀，再調(diào)節(jié)pH值為4.0～6.0，收集沉淀，即得培氟沙星半抗原衍生物。所述培氟沙星甲磺酸二水化合物、N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸的質(zhì)量比優(yōu)選為3：(0.8～1.4)：(1.2～2.8)；所述離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為8000～10000rpm；所述pH調(diào)節(jié)用酸化劑優(yōu)選為0.1mol/L的稀鹽酸。

本發(fā)明采用碳二亞胺兩步法合成培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，優(yōu)選具體為：將培氟沙星半抗原衍生物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，避光振蕩反應(yīng)24h，得C液。將cBSA溶解于含50％DMF的PBS磷酸鹽緩沖溶液中，得D液。將C液逐滴緩慢加入到D液中，并不斷震蕩，加完后繼續(xù)反應(yīng)3h，獲得培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物。

在本發(fā)明中，所述包被抗原的濃度為0.1～0.2μg/ml。

在本發(fā)明中，所述多克隆抗體的濃度為0.22～0.28mg/ml。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述試紙卡在檢測氟喹諾酮類藥物殘留中的應(yīng)用，所述氟喹諾酮類藥物包括培氟沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星、氟羅沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、馬波沙星和依諾沙星中的一種或多種。

本發(fā)明對所述樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊的制備沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸收墊的制備方法即可。

在本發(fā)明中，所述試紙卡檢測原理如下：滴加樣品液后，在吸收墊和硝酸纖維素膜的毛細(xì)作用下，樣品溶液向上遷移，到達(dá)結(jié)合墊時，金標(biāo)抗體將被溶解。當(dāng)樣品中含有氟喹諾酮類藥物殘留時，它們將和金標(biāo)抗體結(jié)合，并一起向上遷移，到達(dá)固定有包被抗原的檢測線位置時，包被抗原將和氟喹諾酮類藥物競爭結(jié)合金標(biāo)抗體上有限的抗原結(jié)合位點。樣品中氟喹諾酮類藥物殘留含量越高，檢測抗原和金標(biāo)抗體結(jié)合數(shù)量就越少，T線顯色就越弱；當(dāng)樣品中氟喹諾酮類藥物殘留含量高于一定數(shù)值時，包被抗原就無法和金標(biāo)抗體結(jié)合，T線不顯色。無論樣品中是否氟喹諾酮類藥物殘留存在，過量的金標(biāo)抗體或包被抗原與金標(biāo)抗體的結(jié)合物都將和二抗GaRIgG結(jié)合，在C線形成紅色。試紙卡以紅色印跡線“|”或“‖”作為檢測線的陽性和陰性標(biāo)記，即在硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)顯示一條紅色“|”印跡時，表示被檢測樣品溶液呈陽性；若硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)同時出現(xiàn)兩條紅色“‖”印跡時，表示樣品溶液呈陰性。

本發(fā)明提供的試紙卡可用于氟喹諾酮類藥物殘留的檢測，對待測樣品的種類沒有特殊的限制，可以為血樣、尿樣、蜂蜜或組織樣品，具體的在所述檢測前，待測樣品進(jìn)行前處理，所述前處理的過程優(yōu)選包括：

(1)動物尿樣：新鮮尿樣放于4℃冰箱中待檢，直接用于試紙卡檢測；若尿液中有污染和混濁，5000r/min離心10min或過濾后檢測。

(2)動物血液：用加有肝素鈉(20～30單位/ml血樣)的離心管采集血液樣本，5000r/min離心10min；取出血漿2ml加入干凈的玻璃離心管中，再加入2ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液(體積比為40/60)，用振蕩器混勻5min后上樣檢測。

(3)蜂蜜：取5.0g蜂蜜置于50mL聚苯乙烯離心管中，加入5mL PBS緩沖液，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；然后加入乙腈-NaOH溶液10mL，充分混合10min，15℃3000r/min離心10min，取上層液體用于試紙卡檢測。

(4)動物組織：準(zhǔn)確稱取5g已絞碎的動物組織樣品于50ml具擰蓋的塑料離心管中。加入10ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液(體積比為40/60)，充分混合10min，15℃3000r/min離心10min。取出2mL上清液，加入PBS緩沖液2mL混合均勻，上樣檢測。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述的基于培氟沙星類多克隆抗體檢測氟喹諾酮類藥物的試紙卡做進(jìn)一步詳細(xì)的介紹，本發(fā)明的技術(shù)方案包括但不限于以下實施例。

實施例1

培氟沙星-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的合成，所述偶聯(lián)物的合成流程圖如圖5所示。

(1)稱取培氟沙星甲磺酸二水化合物46.5mg(約0.1mmoL)，NHS 12mg(約0.1mmoL)和EDC 19.2mg(約0.1mmoL)溶于2mL的DMF，室溫下避光攪拌12h。反應(yīng)產(chǎn)物于8000r/min離心10min，取上清稱為A液。5-氨基戊酸鹽酸鹽11mg(約0.1mmoL)溶于2mL PBS中，即B液。攪拌狀態(tài)下將B液緩慢滴入A液中，反應(yīng)4h，然后8000r/min離心10min，取上清液用飽和NaHCO₃調(diào)至偏堿性，棄沉淀。上清液再用稀鹽酸(0.1mol/L)調(diào)至偏酸性，收集沉淀，即為培氟沙星半抗原衍生物。

(2)將220mg BSA、11.6mg EDC溶于5mL PBS緩沖液中，攪拌條件下，緩慢加入7mg乙二胺溶液(溶于3mL PBS和DMF溶液的乙二胺溶液)，37℃振蕩反應(yīng)2h。反應(yīng)液用PBS透析4d，活化的BSA凍干保存，即為活化后的牛血清白蛋白。

(3)取PEF半抗原衍生物32mg，用3ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)攪拌溶解后，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)15mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)52mg，溶解后室溫條件下避光，搖床振蕩反應(yīng)24h，稱C液。將活化的cBSA溶解于含50％DMF的PBS磷酸鹽緩沖溶液中，稱D液。將C液逐滴緩慢加入到D液中，并不斷震蕩，加完后繼續(xù)反應(yīng)3h，獲得PEF-cBSA免疫原。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液裝入透析袋，用PBS緩沖液透析6d，每天換液3次。紫外掃描透析液無小分子吸收峰時分裝于安瓿瓶中，-20℃保存。

實施例2

氟喹諾酮類藥物包被抗原的制備，所述包被抗原的合成流程圖如圖4所示。

(1)稱取2mmol 3-氨基丁酸加入三角燒瓶中，然后用2ml氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為9，冰浴攪拌；用含50％N,N-二甲基甲酰胺的甲醇溶解吡哌酸，攪拌狀態(tài)下逐滴加入氨基丁酸-氫氧化鈉溶液中，磁力攪拌反應(yīng)2h；用乙酸乙酯萃取，稀鹽酸洗滌，再用碳酸氫鈉溶液反萃取，制得吡哌酸半抗原。

(2)稱取18mg吡哌酸半抗原溶解在2mLN,N-二甲基甲酰胺中，加入10μL三乙胺，4℃冰浴條件下反應(yīng)1h。然后加入30μL氯甲酸異丁酯，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h。將44mg的雞卵清白蛋白溶于2mL碳酸鹽緩沖溶液中(CBS，0.05mol/L,pH 9.6)，并加入2mL N,N-二甲基甲酰胺攪拌反應(yīng)0.5h，得到雞卵清白蛋白溶液。冰浴、攪拌條件下將吡哌酸反應(yīng)產(chǎn)物逐滴加入雞卵清白蛋白溶液中，加完后在4℃下振蕩反應(yīng)6h。反應(yīng)液裝入透析袋，CBS緩沖液4℃透析5d，6h換液1次，離心取上清，得吡哌酸-雞卵清白蛋白包被抗原，-20℃凍存。

實施例3

培氟沙星類特異性多克隆抗體的制備

所述的抗培氟沙星類特異性多克隆抗體的由培氟沙星-牛血清白蛋白(PEF-cBSA)偶聯(lián)物免疫新西蘭大白兔制備而來：

用雌性新西蘭大白兔2只，背皮下多點免疫法制備抗PEF多克隆抗體。首免用PBS稀釋的免疫原與等體積氟氏完全佐劑完全乳化，以后每隔3w加強免疫一次，換用氟氏不完全佐劑乳化，免疫劑量為500μg/次，體積為0.5mL。每次免疫后8d耳緣靜脈采血監(jiān)測抗體效價，5免后10d心臟驅(qū)血收集抗血清，4℃過夜后離心(8000rpm,10min)。飽和硫酸銨鹽析法純化抗體，分別采用55％、33％、33％的飽和硫酸銨，分三次純化血清，提取富含IgG的抗體，制得培氟沙星類特異性多克隆抗體。

實施例4

間接ELISA檢測培氟沙星抗體效價

用CBS稀釋的PMA-OVA包被抗原包板，每孔100μL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2h。PBS-T洗板三次后用300μL/孔的封閉液37℃封閉1h。再次洗板后加入用PBS倍比稀釋的抗血清，每孔50μL，37℃溫育15min，PBST洗板三次。然后加入經(jīng)稀釋液1:1000倍稀釋的GaMIgG-HRP，每孔50μL，37℃溫育25min，PBS-T洗板三次。加入60μL/孔新鮮配制的酶底物(A、B液)，室溫下顯色15min，然后加入100μL/孔2M H₂SO₄終止酶促反應(yīng)。反應(yīng)設(shè)陰性對照(NC)和PBS空白對照(BC)，每次檢測三個重復(fù)。酶標(biāo)儀測定每孔A₄₅₀值，以陽性/陰性(P/N)＞2.1，且P－N＞0.2為標(biāo)準(zhǔn)，培氟沙星抗體效價結(jié)果為1.28～2.56×10⁴。

實施例5

間接競爭ELISA(ciELISA)檢測培氟沙星抗體的靈敏度和特異性

間接競爭ELISA(ciELISA)操作程序：參照間接ELISA實驗條件包板和封閉，然后加入50μL/孔不同濃度的PEF標(biāo)準(zhǔn)品或其它氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同時加入等體積適當(dāng)稀釋倍數(shù)的PEF多克隆抗體(PEF pAb)，37℃溫育15min，其它操作同間接ELISA。以B/B₀值(B是不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品時A₄₅₀值，B₀是不加標(biāo)準(zhǔn)品時A₄₅₀值)為縱坐標(biāo)，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，四參數(shù)曲線擬合建立ciELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行相關(guān)分析。靈敏度用IC₅₀值表示，代表標(biāo)準(zhǔn)品的半數(shù)抑制濃度，線性范圍表示最大信號值20-80％的抑制率(IC₂₀-IC₈₀)，最低檢測限(LOD)以IC₁₅值計算。

PEF pAb的交叉反應(yīng)性決定了抗體的特異性。以氟喹諾酮類藥物同類藥物代替PEF標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行交叉反應(yīng)實驗，計算公式是：(IC₅₀ofPEF)/(IC₅₀of FQs)×100，CR越低，抗體特異性越強，結(jié)果見表1。由表1可知，PEF pAb呈現(xiàn)類特異性，與培氟沙星(100％)、恩諾沙星(94.9％)、達(dá)氟沙星(88.9％)、氧氟沙星(77.8％)、洛美沙星(75.7％)、二氟沙星(67.5％)、諾氟沙星(62.9％)、左氧氟沙星(58.9％)、氟羅沙星(47.9％)、環(huán)丙沙星(43.4％)、沙拉沙星(38.9％)、馬波沙星(30.8％)和依諾沙星(27.3％)有較高的交叉反應(yīng)率，這說明培氟沙星類特異性多克隆抗體可識別13種氟喹諾酮類藥物獸藥殘留。

表1培氟沙星類特異性多克隆抗體的交叉反應(yīng)率

實施例6

金標(biāo)抗體的制備

所述的膠體金標(biāo)記的抗培氟沙星類特異性多克隆抗體(PEF pAb)，由以下步驟實現(xiàn)：

(1)膠體金溶液的制備：取超純水溶解的0.01％氯金酸溶液100ml，置電爐加熱至沸騰，3min后邊攪拌，邊迅速加入1％的檸檬酸三鈉溶液2ml。繼續(xù)加熱，溶液顏色由無色轉(zhuǎn)為淺黃色，最后變?yōu)槌燃t色時停止加熱。冷卻后用超純水恢復(fù)至原體積，進(jìn)行透射電鏡掃描，鑒定膠體金質(zhì)量及顆粒大小。膠體金懸液中加入最終質(zhì)量濃度為0.05％的疊氮鈉(NaN₃)，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)抗體預(yù)處理：高濃度的抗體長時間冷凍保存會發(fā)生不同程度的聚集，這些聚集物會影響標(biāo)記的穩(wěn)定性。因此標(biāo)記前，將抗培氟沙星類特異性多克隆抗體10000r/min，4℃條件下離心30min，棄沉淀，上清液用0.01mol/L PBS稀釋成1mg/ml。

(3)待標(biāo)pAb實際用量的確定：酶標(biāo)板用每孔50μl雙蒸水鋪底，縱排加入倍比稀釋的PEF pAb，每孔50μl，設(shè)空白對照(BC)。用0.1mol/L K₂CO₃調(diào)節(jié)膠體金溶液至pH 9.0，加入到酶標(biāo)板中，每孔50μl混勻。室溫孵育15min后，加入10％NaCl溶液100μl，混勻，靜置。對照孔與pAb量不足以穩(wěn)定金溶膠的各孔呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而pAb量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各孔仍保持紅色不變。選擇不聚沉?xí)rpAb的最低量，在此基礎(chǔ)上增加20％，即為待標(biāo)PEF pAb的實際用量。

(4)金標(biāo)抗體的制備：將事先確定的最佳標(biāo)記PEF pAb的實際用量與膠體金偶聯(lián)，常溫攪拌30min，5000r/min離心20min，棄上清后，加入10％BSA硼酸鈉溶液，使BSA終濃度為1％作為穩(wěn)定劑。金標(biāo)抗體溶液10000r/min離心30min，棄上清，用20mmol/L的硼酸鹽稀釋液(含1％BSA和0.1％疊氮鈉)將金標(biāo)抗體恢復(fù)至原體積的1/10，放置在4℃冰箱備用。

實施例7

試紙卡的生產(chǎn)和組裝，試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1、圖2和圖3所示。其中：1為塑料盒體，2為試紙條，3為支撐層，4為樣品墊，5為金標(biāo)抗體結(jié)合墊，6為硝酸纖維素膜，7為吸收墊，8為加樣孔，9為觀察窗，10為質(zhì)控線(C線)，11為檢測線(T線)，12為膠膜，13為標(biāo)記線。

硝酸纖維素膜(NC膜)的制備方法：將硝酸纖維素膜置于X-only單向噴點儀平臺上，檢測抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平壓緊，開機(jī)后將PMA-OVA檢測抗原和二抗分別點射于硝酸纖維素膜上，形成檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)。室溫自然干燥后，將其浸入封閉液(質(zhì)量濃度為1％的BSA的PBS緩沖液，pH 7.4)中30min，37℃烘干后，加入干燥劑，4℃密封保存。

結(jié)合墊的制備方法：將玻璃纖維棉裁成4mm寬的細(xì)條，放入含質(zhì)量濃度為5％的BSA，質(zhì)量濃度為2％的蔗糖，質(zhì)量濃度為0.8％的NaCl和質(zhì)量濃度為0.05％的NaN₃的PBS處理液中20min，37℃恒溫烘干，然后將金標(biāo)抗體灌注已處理好的玻璃纖維棉上，真空凍干4h，即為結(jié)合墊。

樣品墊的制備方法：玻璃纖維棉要用含質(zhì)量濃度為2％的BSA，質(zhì)量濃度為1％的蔗糖，質(zhì)量濃度為0.5％的硼酸鈉和質(zhì)量濃度為0.1％的NaN₃的PBS處理后，干燥備用，即為樣品墊。

試紙卡的組裝：在支持板(PVC板)上，將NC膜、結(jié)合墊、樣品墊、吸收墊和膠膜等按一定工藝組裝在一起，用CM4000切割機(jī)制成4mm寬的試紙條。然后，按一定工藝將試紙條封裝于帶有加樣孔和觀察窗的特制的塑料盒體中，即為本發(fā)明的基于培氟沙星類特異性多克隆抗體的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡。

實施例8

本發(fā)明的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡在動物尿液中樣品前處理及實際檢測線

采集新鮮尿液放于4℃冰箱中待檢，一般不需特殊處理，可直接用于試紙卡檢測；若尿液中有污染和混濁，5000r/min離心10min或過濾后檢測。試紙卡識別尿液中氟喹諾酮類藥物獸藥殘留的檢測線分別為：培氟沙星(5ng/mL)、恩諾沙星(6ng/mL)、達(dá)氟沙星(7ng/mL)、氧氟沙星(8ng/mL)、洛美沙星(8ng/mL)、二氟沙星(10ng/mL)、諾氟沙星(10ng/mL)、左氧氟沙星(12ng/mL)、氟羅沙星(15ng/mL)、環(huán)丙沙星(15ng/mL)、沙拉沙星(16ng/mL)、馬波沙星(20ng/mL)和依諾沙星(20ng/mL)。

實施例9

本發(fā)明的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡在動物血液中樣品前處理及實際檢測線

用加有肝素鈉(20-30單位/mL血樣)的離心管采集血液樣本，5000r/min離心10min；取出血漿2mL加入干凈的玻璃離心管中，再加入2mL乙腈，用振蕩器混勻后上樣檢測。試紙卡識別血液中氟喹諾酮類藥物獸藥殘留的檢測線分別為：培氟沙星(10ng/mL)、恩諾沙星(12ng/mL)、達(dá)氟沙星(15ng/mL)、氧氟沙星(15ng/mL)、洛美沙星(15ng/mL)、二氟沙星(20ng/mL)、諾氟沙星(20ng/mL)、左氧氟沙星(25ng/mL)、氟羅沙星(30ng/mL)、環(huán)丙沙星(30ng/mL)、沙拉沙星(30ng/mL)、馬波沙星(40ng/mL)和依諾沙星(40ng/mL)。

實施例10

本發(fā)明的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡在動物組織中樣品前處理及實際檢測線

用均漿器均質(zhì)動物組織，取5.0g動物組織置于50mL具擰蓋的塑料離心管中，加入10ml乙腈-0.1M氫氧化鈉溶液(體積比為40/60)，充分混合10min，15℃3000r/min離心10min。取出2mL上清液，加入PBS緩沖液2mL混合均勻，上樣檢測。試紙卡識別動物組織中氟喹諾酮類藥物獸藥殘留的檢測線分別為：培氟沙星(20ng/mL)、恩諾沙星(20ng/mL)、達(dá)氟沙星(25ng/mL)、氧氟沙星(30ng/mL)、洛美沙星(30ng/mL)、二氟沙星(40ng/mL)、諾氟沙星(40ng/mL)、左氧氟沙星(50ng/mL)、氟羅沙星(60ng/mL)、環(huán)丙沙星(40ng/mL)、沙拉沙星(60ng/mL)、馬波沙星(80ng/mL)和依諾沙星(80ng/mL)。

實施例11

本發(fā)明的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試紙卡在蜂蜜中樣品前處理及實際檢測線

取5.0g蜂蜜置于50mL聚苯乙烯離心管中，加入5mL PBS緩沖液，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；然后加入乙腈-NaOH溶液10mL，充分混合10min，15℃3000r/min離心10min，取上層液體用于試紙卡檢測。試紙卡識別蜂蜜中氟喹諾酮類藥物獸藥殘留的檢測線分別為：培氟沙星(20ng/mL)、恩諾沙星(20ng/mL)、達(dá)氟沙星(25ng/mL)、氧氟沙星(30ng/mL)、洛美沙星(30ng/mL)、二氟沙星(40ng/mL)、諾氟沙星(40ng/mL)、左氧氟沙星(50ng/mL)、氟羅沙星(60ng/mL)、環(huán)丙沙星(40ng/mL)、沙拉沙星(60ng/mL)、馬波沙星(80ng/mL)和依諾沙星(80ng/mL)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。