本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及LACC1和FHL2基因在制備脊柱側彎檢測產品中的應用。
背景技術：
脊柱側彎(Scoliosis)，又稱脊柱側凸，是一類以脊柱側方彎曲并伴有椎體旋轉的復雜三維脊柱畸形。根據發(fā)病原因，可將其分為3大類：先天性脊柱側彎、綜合癥性脊柱側彎和特發(fā)性脊柱側彎。先天性脊柱側彎是由脊柱發(fā)育畸形導致的；綜合癥性脊柱側彎是由神經肌肉疾病、骨骼疾病、結締組織疾病和神經纖維瘤病等導致的；特發(fā)性脊柱側彎確切病因尚不清楚，相關研究認為基因遺傳因素、生長發(fā)育和激素、結締組織病變、肌肉系統的異常、中樞神經系統異常、褪黑素的作用等都可能與AIS的發(fā)病有關。其中，青少年特發(fā)性脊柱側彎(Adolescent Idiopathic Scoliosis，AIS)最為常見，占整個脊柱側彎的80％。青少年特發(fā)性脊柱側彎在10歲-16歲青少年中的發(fā)病率較高，是繼視力異常、肥胖、包莖和社會心理障礙后的第五大常見病。雖然AIS除表現畸形外通常不引起嚴重的病理狀態(tài)，但是重度胸彎可能引起心、肺功能的減退，導致明顯的體型上的畸形，甚至影響壽命。
目前治療方法主要是針對畸形進行矯治，包括臨床觀察、支具治療和對側彎超過45°者進行手術治療，治療復雜，常遺留有脊柱畸形和脊柱活動障礙，效果不理想。同時，AIS患者如果不進行篩查，在初次就診時主彎平均角度為38°，已經接近進行支具治療的上限。因此，對AIS的早期篩查和診斷可以為患者爭取更多保守治療的機會，減少手術幾率。目前AIS的診斷與篩查主要還是依靠對患者外觀對稱性的體格檢查和影像學檢查，這會使很多低風險的青少年接受不必要的放射學檢查，而且這種篩查手段特異性較差。隨著醫(yī)學遺傳學和醫(yī)學分子生物學研究的不斷深入和進步，AIS的醫(yī)學分子生物學機制的研究也陸續(xù)被報道。在對AIS進行分子生物學研究的過程中發(fā)現了一些與其相關的生物標記物，如鈣調蛋白、外周血中瘦素、血清骨橋蛋白、可溶性CD44、SH3GL1等，但效果和結論仍需進一步驗證。因此，從基因表達水平上去研究AIS病因，繼續(xù)尋找新的、特異性好的AIS早期篩查與診斷的標記物具有重要意義。
技術實現要素：
為了實現青少年特發(fā)性脊柱側彎的早期發(fā)現，早期治療，本發(fā)明的目的之一在于提供LACC1和FHL2基因在制備脊柱側彎檢測產品中的應用。
本發(fā)明的目的之二在于提供一種檢測脊柱側彎的生物試劑。
本發(fā)明的目的之三在于提供一種檢測脊柱側彎的ELISA試劑盒。
為實現上述目的，本發(fā)明首先提供LACC1和FHL2基因在制備脊柱側彎檢測產品中的應用。
優(yōu)選地，所述脊柱側彎為青少年特發(fā)性脊柱側彎。
優(yōu)選地，所述產品能夠通過檢測生物學樣品中LACC1和FHL2基因或其表達產物的表達水平來診斷脊柱側彎。
優(yōu)選地，所述LACC1和FHL2基因或其表達產物在脊柱側彎生物學樣品中表達下調。
優(yōu)選地，所述的檢測包括基因水平的檢測和蛋白水平的檢測，所述基因水平檢測包括實時定量PCR法、基因芯片法和高通量測序法；所述蛋白水平的檢測包括免疫組化、膠體金法、ELISA法和Western blot法。
優(yōu)選地，所述產品包括芯片、試劑盒或生物試劑。
優(yōu)選地，所述試劑盒可以是檢測LACC1和FHL2基因轉錄水平的試劑盒，如QPCR試劑盒，也可以是檢測LACC1和FHL2蛋白的表達水平的試劑盒，如ELISA試劑盒；所述芯片可以是基因芯片或是蛋白芯片，其能夠檢測LACC1和FHL2基因的表達水平；所述生物試劑包括LACC1和FHL2的特異性引物和抗LACC1和FHL2蛋白的特異性抗體。
進一步地，本發(fā)明提供了一種檢測脊柱側彎的生物試劑，所述生物試劑包括用于檢測脊柱側彎的兩組引物對，其中，一組引物對具有SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；另一組引物對具有SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述二組引物對通過轉錄介導擴增技術來檢測人體體內LACC1和FHL2基因的表達水平，以判斷脊柱側彎發(fā)生的風險。
更進一步地，本發(fā)明提供了一種檢測脊柱側彎的ELISA試劑盒，所述試劑盒包括抗LACC1和FHL2蛋白的特異性抗體。
優(yōu)選地，所述LACC1和FHL2蛋白抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
優(yōu)選地，所述抗體可以從商業(yè)途徑獲取，也可以使用一系列本領域已知的方法來制備。例如，將純化的人LACC1和FHL2蛋白或它的抗原片段注射入動物體內以產生多克隆抗體。同樣，表達人LACC1和FHL2蛋白或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。單克隆抗體可用雜交瘤技術制備。
優(yōu)選地，所述LACC1和FHL2蛋白抗體為單克隆抗體，所述LACC1和FHL2蛋白抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，優(yōu)選為鼠源抗體。本發(fā)明使用的抗人LACC1和FHL2蛋白鼠源單克隆抗體均由abcam公司制備。
優(yōu)選地，所述LACC1和FHL2蛋白抗體為辣根過氧化物酶標記的抗體。
優(yōu)選地，所述試劑盒還包括抗LACC1兔多克隆抗體包被的酶標板、抗FHL2兔多克隆抗體包被的酶標板、蛋白標準品LACC1和FHL2、TMB底物溶液、稀釋液、洗滌緩沖液、終止溶液。
優(yōu)選地，終止溶液成分為2M H2SO4。
本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與脊柱側彎相關的基因LACC1和FHL2，并進一步證實該LACC1和FHL2基因或其表達蛋白在青少年特發(fā)性脊柱側彎患者生物學樣品中表達下調。利用LACC1和FHL2基因在青少年中進行脊柱側彎的普查，解決了現有技術中診斷措施敏感性和特異性差的問題，也減少了X線輻射的損害，能夠快速有效的做到AIS的早期診斷，而且為預測診斷AIS的發(fā)生發(fā)展，甚至是為今后在生物學水平治療AIS提供了治療靶點和重要依據。
附圖說明
圖1本發(fā)明中實施例2中脊柱側彎患者LACC1和FHL2基因表達下調。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。
本發(fā)明的技術方案具體包括：對25例青少年特發(fā)性脊柱側彎患者樣本及15例對照樣本進行高通量測序，結合生物信息學方法進行基因篩選，挑選出候選基因LACC1和FHL2，現有研究中并沒有LACC1、FHL2和青少年特發(fā)性脊柱側彎相關的報道，進一步，發(fā)明人進行了分子生物學方法驗證，證實了LACC1和FHL2在脊柱側彎患者生物學樣品中表達下調，其相關制劑可用于診斷青少年特發(fā)性脊柱側彎。
本發(fā)明的LACC1和FHL2基因是在本發(fā)明之前的已知基因，其基本信息如下：
Genbank登錄號：LACC1GeneID:144811，FHL2GeneID:2274來源于人類基因組。
LACC1(laccase domain containing 1，漆酶域1)位于13號染色體上，是一個蛋白編碼基因。與LACC1疾病包括類風濕性關節(jié)炎和全身性幼年麻風病。
FHL2(four and a halfLIM domains 2)又稱DRAL是FHL(four-and-half LIM，FHL)家族中一員。FHL家族共有5個成員，即FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和FHL5/ACT，均只含有LIM結構域，介導蛋白-蛋白相互作用，激活或抑制轉錄因子的活性，進而影響基因表達；FHL2調節(jié)細胞的增殖；參與細胞骨架的形成。
具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分：
1.利用高通量測序方法對25例脊柱側彎患者的血液樣本LACC1和FHL2基因的水平與15例對照樣本中進行差異比較。
2.采用RT-PCR方法檢測LACC1和FHL2基因在脊柱側彎患者和正常人群中的表達，并驗證了該基因為脊柱側彎表達下調基因。
3.脊柱側彎的ELISA檢測試劑盒組裝和使用
(1)ELISA實驗中常規(guī)試劑的配制
(2)多克隆抗體制備
(3)酶標板的包被
(4)酶標抗體的制備
(5)試劑盒的組裝
4.ELISA試劑盒的臨床應用
利用本發(fā)明人制備的ELISA試劑盒檢測待確診的脊柱側彎患者并與實際臨床檢測相比較以確定了ELISA試劑盒的有效性。具體包括測定受試者血液樣本中LACC1和FHL2蛋白表達量，并與正常血液樣本中LACC1和FHL2蛋白表達量進行比較，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴重程度，及時采取更具個性化的防治方案提供支持。
本發(fā)明的LACC1和FHL2基因的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。
目前，已經可以完全通過化學合成來編碼本發(fā)明的蛋白(或其片段)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中的各種DNA分子(如載體)和細胞中。本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產生之外，還可用固相技術通過直接合成肽而加以生產(Stewart等人，(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在體外合成蛋白質可以用手工或自動進行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產生全長的分子。
本文使用的“脊柱側彎”未做說明時，一般特指青少年特發(fā)性脊柱側彎。
本文使用的術語“生物學樣品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、軟骨等樣品。用于本發(fā)明的生物學樣品得自任何受試者的任何組織樣品(如椎間盤、關節(jié)突、脊髓、椎旁肌或血樣)或細胞樣品(如成骨細胞、軟骨細胞或血細胞樣品)均可以根據本發(fā)明方法使用?？梢詮闹蝎@得這些樣品并根據本發(fā)明方法使用這些樣品的受試者實例包括但不限于無癥狀受試者、表現或更多脊柱側彎癥狀的受試者、臨床診斷為患有脊柱側彎的受試者、易患脊柱側彎的受試者(如有脊柱側彎家族史的受試者、有脊柱側彎遺傳易感性的受試者以及生活方式使其易感脊柱側彎或提高患脊柱側彎可能性的受試者)、懷疑患有脊柱側彎的受試者、正接受脊柱側彎治療的受試者、患有脊柱側彎和非接受脊柱側彎治療的受試者、開業(yè)醫(yī)生(如醫(yī)師)確定為健康或無脊柱側彎的受試者(即正常)、已治愈脊柱側彎的受試者、正在控制其脊柱側彎的受試者和未診斷為脊柱側彎的受試者。
實施例1高通量測序篩選差異表達基因
1、取樣
選取2012年10月到2015年12月期間在北京協和醫(yī)院骨科就診的脊柱側彎患者，病例組共收集25例，所有患者均有典型的臨床表現，經X線檢查確診。對照來源于同時期骨科住院的其他疾病患者，共收集15例?；颊呔鶠?0歲-18歲的青少年。采集所有研究對象的血液樣本，編號后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對患者進行知情告知并經本醫(yī)院倫理委員會通過。
2、對血液樣本進行總RNA提取
采用LS(Invitrogen:10296-010)對采集的血液樣本進行RNA提取，實驗操作按產品說明書進行，每組實驗的具體操作如下：
取收集到的新鮮血液，加入3倍體積紅細胞裂解液，混勻后室溫放置10分鐘，10,000rpm離心1分鐘。徹底吸棄上清，收集白細胞沉淀。
(1)入1mLTrizol，室溫保存5分鐘；
(2)加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫放置3-5分鐘；
(3)12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的界面。移入新管，加入等體積的-20℃預冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；
(4)12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下8000rpm離心2分鐘。棄去乙醇液體，室溫下放置2分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；
(5)用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質量判定標準：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。
3、RNA樣品的質量分析
RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結果可以初步判定提取的RNA樣品質量合格與否，是否可以用于進一步的轉錄組分析。進而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。
4、高通量測序
測序平臺為Illumina公司的HiSeq 2500高通量測序平臺，進行高通量轉錄組深度測序，測序后我們運用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數據的質量進行整體評估，包括堿基的質量值分布，質量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達分析時，根據得到的FPKM值，采用國際公認算法EBSeq進行差異篩選。其中，篩選時，LOG2FC>1或<-1，FDR<0.05。為了更好的理解差異表達基因的功能，我們對差異表達基因進行了Gene Ontology和信號通路分析，并對差異表達基因進行功能注釋和蛋白質互相作用網絡分析，鑒于以上數據分析的結果，結合文獻我們篩選了差異表達基因LACC1和FHL2，LACC1和FHL2基因在脊柱側彎患者血液樣本中表達下調。
實施例2 qRT-PCR驗證脊柱側彎患者LACC1和FHL2基因的表達情況
1、材料
選取2012年10月到2015年12月期間在北京協和醫(yī)院骨科就診的脊柱側彎患者10例，所有患者均有典型的臨床表現，經X線檢查確診。對照來源于同時期骨科住院的其他疾病患者，共收集8例?；颊呔鶠?0歲-18歲的青少年。采集所有研究對象的血液樣本，編號后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對患者進行知情告知并經本醫(yī)院倫理委員會通過。
2、方法
2.1對血液樣本進行總RNA提取，同實施例1的提取方法。
2.2逆轉錄合成cDNA
采用RT reagent kit(TaKaRa，貨號DRR037A)進行cDNA反轉錄，實驗操作按產品說明書進行，具體操作如下：
使用逆轉錄試劑盒，用逆轉錄緩沖液對0.3μg總RNA進行逆反錄合成cDNA。采用10μL反應體系：5xPrimerScript Buffer 2μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL、OligodT Primer 0.5μL、Random 6mers 0.5μL、RNA模板為0.3μg和RNase Free dH2O補至10μL。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。
2.3 Real-Time PCR
利用在線引物設計軟件，LACC1基因序列參照NCBI:NM_001128303.1，FHL2基因序列參照NCBI:NM_001039492.2，內參選GAPDH，引物設計后由invitrogen公司合成。具體引物如表1所示：
表1 引物序列表
用Premix Ex TaqTMII(TaKaRa，貨號DRR081A)進行擴增，實驗操作按產品說明書進行。熒光定量PCR 20μL反應體系如下：Premix Ex TaqTMII：10μL，引物(10μM)：正、反向引物各0.8μL，ROX Reference DyeII(50×)：0.4μL，dH2O：6μL，模板cDNA：2μL。反應程序在ABI7500上進行，擴增程序為：95℃30sec，(95℃5sec，60℃34sec)×40個循環(huán)。
3、統計學分析
實時定量PCR擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應管的擴增效率相近，極限平而無上揚現在，曲線指數期斜率較大，說明擴增效率較高；樣本擴增產物溶解曲線都是單峰，說明擴增產物只有一條，為特異性擴增；根據qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較LACC1和FHL2基因在脊柱側彎患者血液中和對照組血液中的表達水平。結果顯示：qRT-PCR擴增結果穩(wěn)定，其中LACC1和FHL2基因在脊柱側彎患者血液中的表達水平分別為對照組血液中的40％和35％，如圖1所示。以上結果驗證了高通量轉錄組表達數據的整合分析LACC1和FHL2基因在脊柱側彎患者中表達下調的結果。
實施例3檢測脊柱側彎的ELISA試劑盒組裝和使用
1.ELISA實驗中常規(guī)試劑：
包被緩沖液(pH9.6的碳酸鹽緩沖液)：Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加蒸餾水至1L。
洗滌緩沖液(pH7.4)：8.0g NaCl；0.2g KH2PO4；2.9g Na2HPO4·12H2O；0.2g KCl；0.5mL 0.05％吐溫-20，加ddH2O至1L。
稀釋液:牛血清白蛋白(BSA)0.1g加洗滌緩沖液至100mL；
本發(fā)明使用的抗人LACC1和FHL2蛋白鼠源單克隆抗體均由abcam公司制備。
蛋白標準品LACC1和FHL2為人源重組蛋白均購自北京傲銳東源生物科技有限公司。
2.多克隆抗體制備：
采用固相合成法制備LACC1和FHL2蛋白；采用碳二亞胺偶聯法將合成LACC1和FHL2蛋白與載體蛋白BSA(牛血清白蛋白)偶聯制備免疫原LACC1-BSA和FHL2-BSA，聯合UV(紫外掃描)和SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)監(jiān)測偶聯物LACC1-BSA和FHL2-BSA；將制備好的偶聯物LACC1-BSA和FHL2-BSA作為免疫原，結合弗氏完全佐劑與不完全佐劑免疫新西蘭大耳白兔，每次偶聯物抗原免疫劑量為1mg，免疫方式為頸背部皮下多點注射；經3次免疫后檢測免疫兔靜脈血滴度，達到1:10000以上后，對免疫兔進行頸動脈取血收集免疫全血，離心分離后收集兔免疫血清；采用Protein A親和層析柱對抗LACC1和FHL2蛋白的兔免疫血清進行純化，制備抗LACC1和FHL2蛋白的多克隆抗體，檢測多克隆抗體的滴度、特異性、靈敏性等，得到抗血清LACC1和FHL2蛋白抗體。
3.酶標板的包被：
所述的抗LACC1和FHL2兔多克隆抗體包被的酶標板通過如下方法制備：用pH9.6的碳酸鹽包被緩沖液將純化后抗LACC1和FHL2兔多克隆抗體稀釋成目的濃度0.63μg/mL；將稀釋好的抗體溶液混勻后加入微孔中，100μL/孔，4℃過夜；洗板3次，200μL/孔；加入3％BSA封閉液，300μL/孔，4℃過夜；洗板3次，200μL/孔；-20℃保存。
4.酶標抗體的制備：
取抗LACC1和FHL2蛋白鼠源單克隆抗體，分別與HRP進行偶聯，得到酶標記抗體。取一定量的酶標記抗體加入到稀釋液中，充分混勻，使其終濃度為2μg/mL(可根據具體的條件而定)，2-8℃避光保存。
5.試劑盒的組裝：
檢測脊柱側彎的ELISA試劑盒包括表2中的組分：
表2 ELISA檢測試劑盒
為方便使用，該試劑盒還可包含陽性對照：正常人AB血清或胎牛血清500μL和陰性對照：1％PBS 1mL。
該試劑盒的使用方法如下：
(1)分別取LACC1和FHL2標準蛋白濃度分別為900pg/mL，600pg/mL，300pg/mL，150pg/mL，75pg/mL溶液50μL加入包被抗體的酶標板繪制標準曲線；
(2)分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔，在酶標板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；
(3)用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘；
(4)小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干；
(5)每孔加入酶標試劑50μL；
(6)溫育，洗滌，步驟同上；
(7)每孔先加入TMB底物溶液A 50μL，再加入TMB底物溶液B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘；
(8)每孔加終止液50μL，終止反應；
(9)以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)，計算各血清樣本中蛋白含量。
實施例4 ELISA試劑盒的臨床檢測
1、病例
選取20例待篩查的脊柱側彎患者，取樣來源于2012年10月到2015年12月期間在北京協和醫(yī)院骨科就診的的病人。采集所有研究對象的血液樣本，編號后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對患者進行知情告知并經本醫(yī)院倫理委員會通過。
2、方法
標本處理用血清分離膠真空采血管采集靜脈血2mL，先室溫3000r/min離心10min，轉移上層血清，再于4℃、16000×g離心10min，吸取上層無細胞血清分裝每管200μL，置-70℃保存。上述操作于標本采集后2h內完成。以試劑盒中正常人AB血清為陽性對照，使用實施例3中ELISA試劑盒檢測血液樣本中LACC1和FHL2蛋白表達量相對正常人AB血清變化。
3、結果
結果顯示，待篩查的20例前脊柱側彎患者的血液樣本中有7例患者樣本中LACC1和FHL2蛋白表達量和正常人AB血清中表達量無顯著差異；有13例患者血液樣本中LACC1和FHL2蛋白表達量是正常人AB血清中表達量的60％以下，其中有9例患者血液樣本中LACC1和FHL2蛋白的表達量是正常人AB血清表達量的40％以下。經臨床進一步檢測，20例待篩查的患者中確診9例前脊柱側彎，這9例前脊柱側彎患者與本發(fā)明制備的試劑盒檢測結果一致。據此推斷，本前脊柱側彎的診斷試劑盒可以明確區(qū)分出前脊柱側彎患者，并以此為臨床提供診斷線索。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
序列表
<110> 北京賽爾達生物技術有限公司
<120> LACC1和FHL2基因在制備脊柱側彎檢測產品中的應用
<130> p16zjcw18
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggctctggtt cctgttcctc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaaataaat cacctcgccg c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcctggctg agaactgtg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgccggtcc ttgtaagaca 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggctgttgtc atacttctca tgg 23