本發(fā)明涉及納米材料的定量檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵磁性納米材料的定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
納米材料通常定義為具有非常小的組分和/或結(jié)構(gòu)特征(例如顆粒和纖維)，其中至少一個(gè)尺寸在1～100nm范圍內(nèi)。納米材料由于其尺寸處于納米級(jí)別，與傳統(tǒng)的材料相比具有優(yōu)異的光學(xué)、熱學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)等性質(zhì)。納米材料的特殊性質(zhì)，決定了納米材料將有廣泛的應(yīng)用前景。
磁性納米材料作為納米材料中的一類特殊材料，不僅具有納米材料的特殊性質(zhì)，還具有其它納米材料所不具有的性質(zhì)——磁性。目前，磁性材料已經(jīng)廣泛的應(yīng)用到各個(gè)領(lǐng)域，如生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用、工業(yè)技術(shù)應(yīng)用、環(huán)境治理應(yīng)用等，特別是生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，磁性納米材料可以作為磁共振成像的造影劑、藥物載體以及磁性分離和純化等。
近年來，人類飽受著各種疾病的折磨。如心血管疾病、糖尿病以及各種癌癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球癌癥報(bào)告2014》預(yù)測(cè)，全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，將由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，到2035年，將可能達(dá)到2400萬人。其中，報(bào)告顯示，2012年全球新病例有一半發(fā)生在亞洲，其中大部分發(fā)生在中國(guó)。
傳統(tǒng)的治療癌癥的主要手段是外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法。其中化學(xué)療法是非常普遍的一種治療手段?；瘜W(xué)療法主要是利用抗癌藥物抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)，從而達(dá)到治療的效果。但是，抗癌藥物在抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常的組織細(xì)胞造成一定的傷害，故提高抗癌藥物的靶向性對(duì)于減少抗癌藥物的副作用，提高藥效是十分必要的。
磁性納米材料可以作為藥物載體將藥物靶向作用于病變部位，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥等疾病的有效治療，但是納米載體在應(yīng)用時(shí)，其劑量尤為重要，不同的劑量可能導(dǎo)致不同效果或者副作用，準(zhǔn)確的劑量對(duì)于優(yōu)化納米藥物的功效是十分重要的，同時(shí)可以最大程度減小材料的毒性。
傳統(tǒng)的對(duì)納米材料的成分的分析方法主要有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、X射線熒光光譜法、電子探針分析法等；納米材料的結(jié)構(gòu)分析方法主要有X射線衍射法、激光拉曼物相分析等；納米材料的形貌和粒度分析主要有透射電子顯微鏡法、掃描電子顯微鏡法、激光粒度儀等；納米材料表面與界面分析常用方法主要有X射線光電子能譜、俄歇電子能譜、靜態(tài)二次離子質(zhì)譜、離子散射譜等。其中原子吸收光譜適合對(duì)納米材料中痕量金屬雜質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定，但對(duì)非金屬元素、難熔元素測(cè)定難。
這些傳統(tǒng)的納米材料的分析方法未能夠很好的實(shí)現(xiàn)對(duì)納米材料的定量分析。此外，2016年4月9-10日在廈門召開的全國(guó)環(huán)境納米技術(shù)及生物效應(yīng)學(xué)術(shù)研討會(huì)上也有研究者提出了當(dāng)前對(duì)于納米材料的定量分析方法面臨的挑戰(zhàn)如：①生物體內(nèi)納米顆粒濃度<1ppm；②靶器官納米顆粒濃度<ppb；③細(xì)胞中納米顆粒濃度<1ppt；④納米顆粒/蛋白/DNA復(fù)合物等。故實(shí)現(xiàn)納米材料的定量分析是一項(xiàng)非常有挑戰(zhàn)性的工作，尤其是對(duì)于應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)上的納米材料。
氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵(Fe3O4@O-dextran)具有許多優(yōu)異的性能如良好的水溶性、生物相容性、靶向性、強(qiáng)磁性等，這些優(yōu)異的性能決定了Fe3O4@O-dextran在生物醫(yī)學(xué)上具有巨大的應(yīng)用潛力，如磁共振造影劑、靶向藥物載體等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵磁性納米材料的定量檢測(cè)方法，基于間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法定量測(cè)定Fe3O4@O-dextran的濃度，利用了二抗放大了檢測(cè)信號(hào)，提高了實(shí)驗(yàn)分析的靈敏度，即通過測(cè)量Fe3O4@O-dextran包被抗原、Fe3O4@O-dextran抗體即一抗與HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體即二抗，三者復(fù)合物的光學(xué)性號(hào)達(dá)到定量檢測(cè)Fe3O4@O-dextran的目的，該方法快速、簡(jiǎn)潔、檢測(cè)限低，可進(jìn)行高通量測(cè)定。
本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
一種氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵磁性納米材料的定量檢測(cè)方法，所述方法包括以下步驟：
a、制備Fe3O4@O-dextran包被抗原和免疫原；
b、制備Fe3O4@O-dextran抗體：
c、將Fe3O4@O-dextran包被抗原經(jīng)包被液稀釋后包被于酶標(biāo)板中，封閉、加入不同濃度的Fe3O4@O-dextran標(biāo)準(zhǔn)液，以Fe3O4@O-dextran抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體作為二抗，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法；
d、以Fe3O4@O-dextran標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而定量檢測(cè)出Fe3O4@O-dextran的濃度。
所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為A＝1.17651-0.07137lgC，其中A為490nm處吸光度值，C為Fe3O4@O-dextran濃度。
所述步驟a具體包括以下步驟：
a-1、向Fe3O4@O-dextran的PBS溶液中，加入羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和牛血清白蛋白，25℃溫育2-4小時(shí)后，將得到溶液裝入到透析袋中透析12h，即得到Fe3O4@O-dextran免疫原；
a-2、向Fe3O4@O-dextran的PBS溶液中，加入羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和雞卵清白蛋白，25℃溫育2-4小時(shí)后，將得到溶液裝入到透析袋中透析12h，即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原。
進(jìn)一步地，所述步驟a具體包括以下步驟：
a-1、Fe3O4@O-dextran 50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL濃度為1～10mg/mL的羥基琥珀酰亞胺溶液和0.2mL濃度為1～10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液，震蕩15～30min，加入0.2mL 1％牛血清白蛋白溶液，25℃反應(yīng)2～4h，將所得溶液裝入透析袋中，用蒸餾水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran免疫原；
a-2、Fe3O4@O-dextran 50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL濃度為1～10mg/mL的羥基琥珀酰亞胺溶液和0.2mL濃度為1～10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液，震蕩15～30min，加入0.2mL 1％雞卵清白蛋白溶液，25℃反應(yīng)2～4h，將所得溶液裝入透析袋中，用蒸餾水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原；
所述Fe3O4@O-dextran中含有的Fe3O4量為80mM；
所述羥基琥珀酰亞胺溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液、牛血清白蛋白溶液、雞卵清白蛋白溶液均為相應(yīng)的PBS溶液。
所述步驟b具體包括以下步驟：
b-1、首次免疫：將Fe3O4@O-dextran免疫原與福氏完全佐劑等體積比混合后，背部皮下多點(diǎn)注射到動(dòng)物體內(nèi)，注射8～10個(gè)點(diǎn)，注射量為1～2mL/只；首次免疫三周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫；
b-2、加強(qiáng)免疫：將Fe3O4@O-dextran免疫原與福氏不完全佐劑等體積比混合后，采取同樣的方式注射到動(dòng)物體內(nèi)，注射量為1mL/只；此后每隔兩周再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，期間采血測(cè)效價(jià)，直到抗體效價(jià)達(dá)到1:64000，進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，從動(dòng)物頸動(dòng)脈采血，取血清部分制得Fe3O4@O-dextran抗體。
所述步驟c具體包括以下步驟：
c-1、包被：用包被緩沖液稀釋將Fe3O4@O-dextran包被抗原溶液稀釋200倍加入到96孔酶標(biāo)板中，100μL/孔，4℃過夜；
c-2、封閉：PBST溶液洗滌96孔酶標(biāo)板3次，每次3min，然后加入1wt％酪蛋白封閉，每孔200μL，37℃溫育1～2h；
c-3、加樣競(jìng)爭(zhēng)：PBST溶液洗滌96孔酶標(biāo)板3次，每次3min，然后將50μL不同濃度的Fe3O4@O-dextran標(biāo)準(zhǔn)液和50μLFe3O4@O-dextran抗體分梯度加入各孔中，37℃溫育1.5～2h；
c-4、加酶：PBST溶液洗滌96孔酶標(biāo)板3次，每次3～5min，然后每孔加入100μLPBS稀釋的稀釋比為1/5000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體，37℃溫育2～4h；
c-5：顯色:PBST溶液洗滌96孔酶標(biāo)板3次，每次3～5min，然后每孔加入100μL鄰苯二胺底物液進(jìn)行顯色反應(yīng)，37℃顯色30min；
c-6、終止：每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在490nm處的吸光值。
本發(fā)明建立了一種基于間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法定量測(cè)定Fe3O4@O-dextran的新方法。利用免疫分析方法抗原和抗體的特異性反應(yīng)達(dá)到檢測(cè)抗原或抗體的目的。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
(1)首次制備了Fe3O4@O-dextran多克隆抗體，為建立間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法提供了核心試劑；
(2)建立了一種基于間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法定量測(cè)定Fe3O4@O-dextran的新方法，為Fe3O4@O-dextran的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供了劑量測(cè)定方法，同時(shí)也為定量測(cè)定納米材料提供了一種新方法；
(3)該方法具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、安全、檢測(cè)限較低等特點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
福氏完全佐劑、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體、牛血清白蛋白和雞卵清白蛋白購買自生工生物工程(上海)股份有限公司。
其他試劑均可從市場(chǎng)上的銷售廠家購買得到。
本發(fā)明涉及到的各溶液的制備方法為：
PBS緩沖液：稱取NaCl 8.0g、KCl 0.1g、NaH2PO4·2H2O 0.29g、Na2HPO4·12H2O 2.96g溶解于蒸餾水中并定容至1000mL，即可得到0.01mol/L pH＝7.4的PBS緩沖液；
PBST溶液：在1000mL PBS中加入500μL Tween-20，混合均勻；
包被緩沖液CB：稱取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.94g溶解于蒸餾水中并定容至1000mL；即可得到0.05mol/L pH＝9.6的包被緩沖液；
鄰苯二胺底物液：稱取1.85g Na2HPO4·12H2O、0.51g C6H8O7溶解于蒸餾水中并定容至50mL，稱取4mg鄰苯二胺溶于10mL上述溶液中，臨用前加入15μL 30％H2O2；
1wt％酪蛋白：稱取1mg酪蛋白溶于1mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS緩沖液中，混合均勻。
1％牛血清白蛋白溶液：1g牛血清白蛋白溶于100mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS緩沖液中，混合均勻；
1％雞卵清白蛋白溶液：1g雞卵清白蛋白溶于100mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS緩沖液中，混合均勻；
實(shí)施例1
一種氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵磁性納米材料的定量檢測(cè)方法，包括以下步驟：
a、制備Fe3O4@O-dextran包被抗原和免疫原；
Fe3O4@O-dextran的制備參照文獻(xiàn)J.Phys.Chem.C 2012，116，20558-20563公開的方法，其具體步驟如下：
取0.5g葡聚糖40(Mw＝40000)溶解在10mL去離子水中，然后加入7.5mL NaIO4(0.4g)水溶液，在80℃攪拌30分鐘，移除加熱器加入5mL的乙二醇阻止葡聚糖進(jìn)一步氧化，最后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7；
FeCl3·6H2O(1mmol)和Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O(2mmol)混合溶解在10mL去離子水中，然后與氧化葡聚糖溶液混合，快速加入5mL NaOH(0.6g)溶液大力攪拌10分鐘，轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓釜中，160℃水熱處理10h，最后冷卻到室溫離心或磁分離收集。即可得到Fe3O4@O-dextran。
Fe3O4@O-dextran(80mM Fe3O4)50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL濃度為1mg/mL的羥基琥珀酰亞胺溶液和0.2mL濃度為1mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液，震蕩15～30min，加入0.2mL 1％牛血清白蛋白溶液(10mg/mL)，25℃反應(yīng)2～4h，將所得溶液裝入透析袋中，用蒸餾水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran免疫原；
Fe3O4@O-dextran(80mM Fe3O4)50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL濃度為1mg/mL的羥基琥珀酰亞胺溶液和0.2mL濃度為1mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液，震蕩15～30min，加入0.2mL 1％雞卵清白蛋白溶液(10mg/mL)，25℃反應(yīng)2～4h，將所得溶液裝入透析袋中，用蒸餾水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原；
所述羥基琥珀酰亞胺溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液、牛血清白蛋白溶液、雞卵清白蛋白溶液均為相應(yīng)的PBS溶液。
b、制備Fe3O4@O-dextran抗體；
取4只體重2～2.5kg健康的雄性新西蘭大白兔，其中一只作為空白對(duì)照，其他三只作為實(shí)驗(yàn)兔，空白對(duì)照組不做任何處理。
實(shí)驗(yàn)組的處理方法為：
將弗氏完全佐劑與Fe3O4@O-dextran免疫原按照體積比1:1混合乳化均勻，在雄性新西蘭大白兔背部皮下注射約8～10個(gè)點(diǎn)，總量共1mL/只。疫接種的方式有注射免疫、口服免疫、氣霧免疫等，其中注射免疫又有皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射靜脈注射等方式，背部皮下注射操作方便，藥物擴(kuò)散較慢，有利于刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，繼而產(chǎn)生抗體；而雄兔作為免疫對(duì)象可以避免其生理周期對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。
首次免疫三周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫是將弗氏不完全佐劑和Fe3O4@O-dextran免疫原按照體積比1:1混合均勻，注射過程同首次免疫注射一樣，每次加強(qiáng)免疫之間間隔兩周，中間周采血用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定抗血清的效價(jià)，直到抗體效價(jià)達(dá)到1:64000，進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，對(duì)新西蘭大白兔頸動(dòng)脈采血，進(jìn)行血清的純化和分離，將得到的抗體儲(chǔ)存在-80℃或-25℃待用。
弗氏不完全佐劑的制備是將液體石蠟和羊毛脂按照用量比2:1，即液體石蠟100mL，羊毛脂50g混合，用超聲儀分多次超聲，每次超聲半小時(shí)冷卻到室溫，再繼續(xù)超聲，這樣反復(fù)乳化混合，直到滴一滴混合物于冰水混合液中半分鐘不擴(kuò)散即為弗氏不完全佐劑制備成功。
抗血清效價(jià)的測(cè)定方法為：將Fe3O4@O-dextra包被抗原用包被緩沖液(CB)稀釋50倍包被在96孔酶標(biāo)板上過夜。第二天早上取出，用洗滌液(PBST)洗滌3次，每次3min，加入1wt％酪蛋白200μL/孔，37℃溫育1h。待1h之后取出，用PBST洗滌3次，每次3min，加入用PBS稀釋一系列稀釋比1/2000～1/256000的抗血清，100μL/孔，37℃溫育2h。待2h之后取出洗滌3次，每次3min，加入用PBS稀釋的稀釋比為1/5000的HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體lgG 100μL/孔，37℃溫育2h。待2h之后取出洗滌3次，每次3min，加入底物液100μL/孔，37℃反應(yīng)30min。30min之后取出加入2mol/L H2SO4 50μL/孔終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的吸光度值。比較實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組在同一抗血清稀釋倍數(shù)下的吸光值A(chǔ)，當(dāng)A實(shí)驗(yàn)組≥2倍A對(duì)照組時(shí)對(duì)應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)即抗血清的效價(jià)。
c、間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法定量測(cè)定Fe3O4@O-dextran
c-1、包被：用包被緩沖液將Fe3O4@O-dextran包被抗原稀釋200倍，包被于96孔酶標(biāo)板中的24個(gè)孔中，即每行取3個(gè)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每孔100μL，冰箱4℃過夜；
c-2、封閉：PBST洗滌三次，每次3min拍干，加入1wt％酪蛋白200μL/孔進(jìn)行封閉(減少非特異性吸附)，37℃溫育1h；
c-3、加樣競(jìng)爭(zhēng)：PBST洗滌3次，每次3min，將50μL濃度分別為0.0232ng/mL、0.232ng/mL、2.32ng/mL、23.2ng/mL、232ng/mL、2320ng/mL的Fe3O4@O-dextran標(biāo)準(zhǔn)液依次加入到酶標(biāo)板的各行中，即每個(gè)濃度梯度重復(fù)三次，然后向各孔中加入50μL Fe3O4@O-dextran抗體，37℃溫育2h；
不同濃度的Fe3O4@O-dextran標(biāo)準(zhǔn)液的制備方法為：用0.01mol/L pH＝7.4的PBS緩沖溶液將Fe3O4@O-dextran稀釋到指定的濃度；
c-4、加酶：PBST洗滌3次，每次3min，每孔加入100μLPBS稀釋的稀釋比為1/5000的HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體IgG，37℃溫育3h；
c-5：顯色:PBST溶液洗滌96孔酶標(biāo)板3次，每次3min，然后每孔加入100μL鄰苯二胺底物液進(jìn)行顯色反應(yīng)，37℃溫育30min；
c-6、終止：每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在490nm處的吸光度值，同一濃度梯度的取平均值計(jì)算吸光度值；
d、以Fe3O4@O-dextran標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：A＝1.17651-0.07137lgC，相關(guān)系數(shù)R＝-0.9991，線性范圍為2.32×10-2～2.32×103，檢出限為0.0297ng/mL。
e、重復(fù)以上各步驟，只是將步驟c-3中的不同濃度的Fe3O4@O-dextran標(biāo)準(zhǔn)液替換為未知濃度的Fe3O4@O-dextran待測(cè)液，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在490nm處的吸光度值，求取平均吸光度值，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線A＝1.17651-0.07137lgC，即可計(jì)算出Fe3O4@O-dextran待測(cè)液的濃度。
以上方法為多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后的最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)方法，此方法所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系最好，線性范圍最寬。
上述參照實(shí)施例對(duì)氧化葡聚糖包被的四氧化三鐵磁性納米材料的定量檢測(cè)方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。