本發(fā)明涉及檢測生物樣品中細(xì)菌毒素的裝置和方法。尤其本發(fā)明涉及一種用于識(shí)別樣品中存在的金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的生物分子如殺細(xì)胞毒素(Panton-ValentineLeukocidin，PVL)和PBP2a的橫向流檢測。
背景技術(shù)：
：接下去的背景信息旨在幫助讀者理解本發(fā)明，并不局限于當(dāng)前領(lǐng)域。金黃色葡萄球菌是臨床醫(yī)學(xué)革蘭氏陽性菌。約20-30％的健康人群的粘膜上攜帶金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌可引起多種疾病，包括敗血癥，中毒性休克，肺炎，皮膚和軟組織感染，骨和人造植入物的感染。金黃色葡萄球菌也在多種動(dòng)物中被檢測到。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是含有被稱為PBP2a的另一種青霉素結(jié)合蛋白的金黃色葡萄球菌，PBP2a由基因mecA基因和不同的等位基因編碼。正如其名稱所示，MRSA的檢測是通過存在甲氧西林情況下觀察到金黃色葡萄球菌的生長，也可以是其他β-內(nèi)酰胺類抗生素如青霉素類，頭孢菌素類和碳青霉烯類。由于治理方案有限，MRSA是住院患者發(fā)病和死亡的一個(gè)重要原因，并對(duì)感染控制和公共衛(wèi)生提出了挑戰(zhàn)。由于需要昂貴的二線藥物和檢疫措施，MRSA花費(fèi)了醫(yī)療服務(wù)提供者相當(dāng)多的成本。世界上估計(jì)有5300萬MRSA攜帶者，美國有250萬MRSA攜帶者。殺白細(xì)胞毒素(PVL)的毒素是金黃色葡萄球菌的噬菌體源性致病因子。它是金黃色葡萄球菌和MRSA臨床上重要的噬菌體源性的致病因子。PVL是由兩個(gè)相鄰的共同表達(dá)基因lukS-PV和lukF-PV(lukS-PV,lukF-PV,GenBankBA000033.2:MW1378undMW1379)編碼。lukS-PV的T細(xì)胞表位能誘發(fā)LST細(xì)胞強(qiáng)烈增殖，該lukS-PV的T細(xì)胞表位目前具有以下特點(diǎn)：N169YISEVERQNSKSVQWGIKANSFIT193(Brown,etal.,OpenJ.Immunol.,2(3):111-115(2012))。這些分子的聚合物在人類白細(xì)胞細(xì)胞膜上形成孔，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和細(xì)胞因子的是否。或者，其低濃度可誘導(dǎo)粒細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。PVL與γ-溶血素(lukF/S-hlg)和其他殺白細(xì)胞素有關(guān)(金黃色葡萄球菌中的lukE/D,lukM/lukF-P83和中間葡萄球菌(S.intermedius)/假中間葡萄球菌(S.pseudintermedius)中的lukF/S-int)。PVL在結(jié)構(gòu)上，按照序列相似性，與其它殺白細(xì)胞素有關(guān)，如金黃色葡萄球菌中的lukE/D,lukM/lukF-P83和中間葡萄球菌(S.intermedius)/假中間葡萄球菌(S.pseudintermedius)中的lukF/S-int，與hlgA/lukF/S-hlg–γ-溶血素/殺白細(xì)胞素位點(diǎn)。如上所述，PVL是人類白細(xì)胞素，引物它在白血細(xì)胞的細(xì)胞膜上形成聚合微孔。白細(xì)胞死亡導(dǎo)致細(xì)胞因子的釋放并吸引新的白血細(xì)胞。PVL基因?yàn)槭删w源性并且是可移動(dòng)的；它們被發(fā)現(xiàn)有非常多樣化的克隆物(例如CC1,5,8,15,22,25,30,45,59,72,80,88,93,96/154,121,188,398)。到目前為止，PVL僅限于從人體分離的金黃色葡萄球菌菌株中。來自反芻動(dòng)物(如牛，山羊和綿羊)的金黃色葡萄球菌有另一種特異的殺白細(xì)胞素，由lukM和lukF-P83(例如,在CC479,151,133,97,30,20中)基因編碼。當(dāng)皮膚和軟組織感染(SSTI)與慢性/復(fù)發(fā)性感染有關(guān)時(shí)，如癤病，尤其是在年輕人和曾健康的成年人中，從那里分離出的金黃色葡萄球菌中PVL經(jīng)常能被檢測到。PVL陽性的金黃色葡萄球菌也可引起更嚴(yán)重的疾病，例如壞死性肺炎。這種情況偶爾是其他呼吸道感染的并發(fā)癥如感冒，其致死率可高達(dá)40％。與此相反，分離自健康攜帶者的金黃色葡萄球菌，或從那些與其他感染類型如菌血病有關(guān)的菌株中，PVL很少被分離到。雖然PVL在20世紀(jì)30年代才有描述，但在19世紀(jì)后期(28)就已假設(shè)PVL為由某些金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的一種強(qiáng)效殺白細(xì)胞素。在20世紀(jì)40年代和60年代，全球爆發(fā)PVL陽性，甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌，到20世紀(jì)90年代后期已經(jīng)出現(xiàn)PVL陽性MRSA后天免疫性群體(caMRSA)。很多臨床狀況與PVL有關(guān)，包括皮膚和軟組織感染，膿腫，癤病(癤)，和乳腺炎。這些狀況的范圍從輕微感染到威脅生命，例如壞死性筋膜炎。與PVL相關(guān)的感染往往是慢性或反復(fù)出現(xiàn)的。金黃色葡萄球菌偶爾也引起肺炎，常作為重復(fù)感染或流行感冒的并發(fā)癥。壞死性肺炎，肺炎的最嚴(yán)重形式，通常與PVL有關(guān)，并且往往是致命的。從健康攜帶者或與植入物有關(guān)的感染中分離到的金黃色葡萄球菌中，PVL是極罕見的。而來自如膿腫或癤等感染的菌株中，PVL是普遍的。由于傾向于引起慢性、復(fù)發(fā)性或特別嚴(yán)重感染，要確保對(duì)PVL陽性金黃色葡萄球菌菌株的治療不同于“正?！苯瘘S色葡萄球菌，要更加積極。在英國，這是衛(wèi)生防護(hù)局作出的指導(dǎo)方針的官方推薦。迄今為止，PVL檢測主要使用分子方法，該方法基本上局限于具有設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)的參考中心和專業(yè)實(shí)驗(yàn)室來進(jìn)行這種測定。目前檢測PVL和PBP2a的方法包括聚合酶鏈接反應(yīng)(PCR)來鑒定PVL和PBP2a的基因。PCR只能在專門的實(shí)驗(yàn)室用專用硬件和訓(xùn)練有素的人員來執(zhí)行并且需要樣品的制備。那些具有家庭醫(yī)生和初級(jí)保健中心的患者不能使用這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)施。這些不能確診案例因而可能沒有得到充分治療，對(duì)病人造成更大的健康風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)醫(yī)生和醫(yī)院造成潛在的經(jīng)濟(jì)后果。鑒定產(chǎn)生PVL的金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的其他方法，諸如那些在美國2010/0129839中公開的方法，需要預(yù)處理生物樣品(即，加熱)以變性PVL,除了要耗費(fèi)更多時(shí)間和工作的免疫性測定如ELISA。因此，最小限度樣品處理的快來速檢測PVL，PVP2a與金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)的方法和裝置，同時(shí)確保準(zhǔn)確和可靠的結(jié)果,這個(gè)需求持續(xù)存在。一個(gè)簡單，快速的檢測可以促進(jìn)在初級(jí)和二級(jí)保健機(jī)構(gòu)對(duì)PVL相關(guān)疾病的診斷，并確定該菌株是否耐甲氧西林?？焖贆z測節(jié)省時(shí)間，因?yàn)閬碜詤⒖紝?shí)驗(yàn)室的結(jié)果往往需要數(shù)天或數(shù)周。從PVL陰性MRSA菌株中區(qū)分PVL陽性的MASA菌株的測試可能最終對(duì)患者造成更大的治療益處，有助于在醫(yī)院內(nèi)預(yù)防前者的傳播。另外，從PBP2a陰性MRSA菌株中區(qū)分PBP2a陽性MRSA菌株的測試可能最終對(duì)患者造成更大的治療益處，有助于在醫(yī)院內(nèi)預(yù)防前者的傳播。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了用于檢測生物分子如生物樣品中的PVL，PBP2a和SPV的快速橫向流測定。該測定包括利用噬菌體展示技術(shù)培育針對(duì)金黃色葡萄球菌的PVL，PBP2a和SPA的重組抗體。在一些實(shí)施例中，生物樣品是培養(yǎng)物，液體培養(yǎng)物，傷口拭子，鼻拭子，或在獸醫(yī)學(xué)中，傷口或乳房拭子。在實(shí)施例中，初代培養(yǎng)物是采自感染的患者，例如可能由多種病原體引起的癤病和膿腫。本發(fā)明上述的摘要不意味著限制，從接下去的詳細(xì)描述以及權(quán)利要求中將會(huì)明顯的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1A是一個(gè)表格，所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實(shí)施例，顯示了代表菌株體外產(chǎn)生PVL的濃度。圖1B是一個(gè)圖，所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實(shí)施例，顯示了代表菌株體外產(chǎn)生PVL的濃度。圖2是一個(gè)表格，其所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明毒素抗體測定實(shí)施例，來說明產(chǎn)生不同濃度毒素的不同菌株被確認(rèn)。圖3是一個(gè)表格，其所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明毒素抗體測定實(shí)施例。描述了一個(gè)矩陣用于序列測定，來確定抗體的最優(yōu)組合。0，無反應(yīng)；(+)到+++，活性從弱到強(qiáng)。圖4是一個(gè)圖形，顯示了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例(PVL-1401)中抗體的DNA和蛋白質(zhì)序列信息。圖5是一個(gè)圖形，顯示了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例(PVL-1841)中抗體的DNA和蛋白質(zhì)序列信息。圖6是一個(gè)圖形，顯示了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例(PVL-1321)中抗體的DNA和蛋白質(zhì)序列信息。圖7是一個(gè)圖形，顯示了本發(fā)明實(shí)施例中使用Binax卡片格式描述測定程序。圖8A的表格中描述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實(shí)施例，說明產(chǎn)生不同濃度的毒素的不同菌株已經(jīng)被確認(rèn)。圖8B表格中描述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實(shí)施例，說明產(chǎn)生不同濃度的毒素的不同菌株已經(jīng)被確認(rèn)。圖9是一個(gè)表格，所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實(shí)施例，來說明不同的固體培養(yǎng)基可以被使用。圖10是一個(gè)表格，所述數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實(shí)施例，來說明不同的液體培養(yǎng)基可以被使用。圖11的表格表示數(shù)據(jù)來自本發(fā)明的毒素抗體測定實(shí)施例。通過測定588個(gè)臨床分離物和12個(gè)參考菌株，同時(shí)平行的用分子手段(DNA芯片)定性，獲得敏感性，特異性，陽性和陰性預(yù)測值。圖12A列出了菌株和克隆物，并從復(fù)合物中鑒定PVL陽性的菌株，來開發(fā)本發(fā)明實(shí)施例中的毒素抗體測定。圖12B列出了菌株和克隆物，并從復(fù)合物中鑒定PVL陽性的菌株，來開發(fā)本發(fā)明實(shí)施例中的毒素抗體測定。圖13是一個(gè)表格，所示數(shù)據(jù)是來自幾個(gè)國家的臨床分離菌株的初試驗(yàn)。圖14的表格表示通過位點(diǎn)研究獲得的PVL陰性MSSA,PVL陰性MRSA,PVL陽性MSSA和PVL陽性MRSA的概率。詳細(xì)描述本發(fā)明提供的裝置和方法用于確定樣品中被分析物的存在或存在數(shù)量。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供檢測細(xì)菌生物分子或毒素的設(shè)備和方法，例如生物樣品中的金黃色葡萄球菌PVL或PVP2a。在一個(gè)實(shí)施例中，樣品是來自患者的生物樣品。用PCR產(chǎn)物來構(gòu)建一個(gè)HisTaq-PVL融合質(zhì)粒，該P(yáng)CR產(chǎn)物包括來自已測序的參考菌株MW2/USA400中，PVL和lukF-PV兩個(gè)組分中的一個(gè)組分的完整開放讀碼框。純的lukF-PV融合蛋白被合成，分離和純化。將純化的材料作為抗原用于初次免疫，隨后通過特定的噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生抗體。用不同的技術(shù)天然和重組PV被用來來表現(xiàn)噬菌體展示技術(shù)。類似的方法被用于開發(fā)PVP2a和SPA的抗體。噬菌體展示抗體通過ELISA法初步定性，其的不同稀釋物在微量管/帶式蛋白質(zhì)微芯片中被識(shí)別(專利ArrayTubeTM(AT)或ArrayStripTM(AS)的平臺(tái)，有Alere技術(shù)有限公司開發(fā))。捕獲和檢測抗體的所有可能組合用微芯片檢測，來發(fā)現(xiàn)在已知濃度的重組和天然毒素制劑的特定條件下的最特異，最敏感的抗體對(duì)。因此，對(duì)這些抗體的每一種可能的組合進(jìn)行了測定，并且對(duì)PVL，SPA或PBP2a具有最高的靈敏度和特異性的抗體對(duì)進(jìn)行鑒定。針對(duì)重組生物分子產(chǎn)生的噬菌體展示抗體進(jìn)行活性篩選，部件針對(duì)HisTaq融合蛋白，也針對(duì)生物分子的原始形式。微芯片分析結(jié)果表明，重組抗體能識(shí)別原始生物分子。然后這些抗體被用于開發(fā)快速橫向流測定，以檢測包括PVL，SPA和PBP2a的生物分子。通過一系列毒素稀釋物，橫向流的檢測極限大約是在1納克/毫升的數(shù)量級(jí)(見下文)。固定在微芯片上的抗體被用于評(píng)估金黃色葡萄球菌臨床分離物的生物分子產(chǎn)物。一般來說，在相同培養(yǎng)條件下克隆物從屬關(guān)系和外毒素產(chǎn)量間有一定的相關(guān)性。收集的USA300臨床分離物(ST8MRSA-IV，平均產(chǎn)生約4000納克/毫升PVL，F(xiàn)組分)，昆士蘭克隆(ST93-MRSA-IV，約5000納克/毫升)，ST93-MSSA(ca.6,500納克/毫升)和ST59-MRSA-VT(約3,000納克/毫升)顯然平均產(chǎn)生比其他PVL陽性MRSA或MSSA菌株更多PVL，例如ST80-MRSA-IV(ca.250納克/毫升),和CC5-MSSA(ca.750納克/毫升)。這些實(shí)驗(yàn)證明，任何測試的菌株產(chǎn)生PVL產(chǎn)量的濃度明顯高于所選的抗體組合的檢測極限。在一個(gè)實(shí)施例中，在檢測設(shè)備中使用的抗體是PVL，SPA或PBP2a特異的重組噬菌體展示抗體。在實(shí)施例中，在檢測設(shè)備中使用的抗體是下列抗體克隆中的一個(gè)或多個(gè)：PVL-1031,PVL-1061,PVL-1101,PVL-1321,PVL-1401,PVL-1451,PVL-1631,PVL-1711,PVL-1771,PVL-1841,PVL-1881,PBP2a-1631,PBP2a-1721,PBP2a-1941,PBP2a-6G10,PBP2a-17A10,PBP2a-17C8,PBP2a-19B1,PBP2a-8A5,PBP2a-9C6,PBP2a-pc-2.1,PBP2a-pc-2.2,SPA-A135,andSPA-4412.在實(shí)施例中，抗體對(duì)包括抗體克隆PVL-1841，其可以與金顆粒軛合，包括抗體克隆PVL-1401，它可以被固定化，例如，在硝酸纖維素膜上作為捕獲抗體。在其他實(shí)施例中，抗體對(duì)包括抗體克隆PVL-1841，其可以與金顆粒軛合，包括抗體克隆PVL-1321和抗體克隆PVL-1401作為捕獲抗體被固定在，例如硝酸纖維素膜上。抗體克隆PVL-1321檢測人的PVL,而抗體克隆PVL-1401檢測人的PVL以及與牛乳腺炎的發(fā)病有關(guān)的牛變種(lukF-P83)。在一個(gè)實(shí)施例中，在基礎(chǔ)微生物實(shí)驗(yàn)室的條件下化驗(yàn)可以被用于檢測金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物中的生物分子。在一些實(shí)施方案中，使用的基本設(shè)備來執(zhí)行化驗(yàn)，例如接種環(huán)，培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱，和在細(xì)菌學(xué)和生物安全中的基本知識(shí)。本發(fā)明允許快速檢測PVL,PBP2a和SPA，例如，直接對(duì)過夜細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行化驗(yàn)，無需使用專門的設(shè)備，例如熱循環(huán)儀，不需要生物分子的變型，例如通過加熱，不需要專業(yè)分子生物學(xué)技術(shù)知識(shí)，如，核酸擴(kuò)增。在實(shí)施例中，用從患者皮膚和軟組織感染中得到的拭子來執(zhí)行化驗(yàn)，拭子樣品可以在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行過夜初培養(yǎng)，金黃色葡萄球菌克隆在初培養(yǎng)中被鑒定并檢測PVL，PBP2a和/或SPA的存在。在混合培養(yǎng)物或具有皮膚植物區(qū)系污染物的情況下，通過標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序分離金黃色葡萄球菌進(jìn)行二次培養(yǎng)。無論在初次或者二次培養(yǎng)中的生物分子都用試驗(yàn)設(shè)備檢測，例如橫向流試紙，卡或試劑盒。各種各樣的檢測設(shè)備可用于檢測生物樣品中生物分子的存在或不存在。在一個(gè)實(shí)施例中，測試裝置可以是一種免疫測定裝置，諸如橫向流測試條，其被廣泛用于測試各種分析物。然而，任何適宜的化驗(yàn)裝置可以在本發(fā)明中被使用。在一個(gè)實(shí)施例中，也可使用折疊卡片形式化驗(yàn)裝置，例如霍華德錢德勒的美國專利號(hào)5468648(完整的引用在參考文獻(xiàn)中)所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用帶盒式測定裝置。通過本發(fā)明中所述的測試裝置對(duì)各種分析物進(jìn)行檢測或定量。該被分析物可以是傳染性病原體。測試試紙可被用于多種檢測形式，如免疫或化學(xué)檢測形式，用于檢測樣品中的目的被分析物。在特異結(jié)合化驗(yàn)中，如免疫測定法，浸漬試劑測試條的使用，是眾所周知的(見，例如，May等的美國專利號(hào)5622871，完整的被引用在參考文獻(xiàn)中)。測試條也可配置在非競爭性或競爭性測定形式中。在一些格式中，具有樣品應(yīng)用區(qū)，試劑區(qū)，和測試結(jié)果區(qū)的測試試紙條具有吸水材料。樣品被施加到樣品應(yīng)用區(qū)并通過毛細(xì)管作用流入試劑區(qū)。在試劑區(qū)，樣品溶解并與檢測被分析物(如果存在)必需的試劑混合?，F(xiàn)在樣品承載著試劑，繼續(xù)流至測試結(jié)果區(qū)域中。另外一些試劑被固定在測試結(jié)果區(qū)域中，諸如與被分析物特異結(jié)合的分子。這些試劑與被分析物(如果存在的話)或者來自試劑區(qū)的第一試劑中的一種反應(yīng)，結(jié)合。用來提供可檢測的信號(hào)的標(biāo)記存在于試劑區(qū)域中，或者在一個(gè)單獨(dú)的標(biāo)記區(qū)域。一般，在非競爭性形式中，如果樣品中含有被分析物則產(chǎn)生信號(hào)，如果不存在被分析物則沒有信號(hào)產(chǎn)生。在競爭形式中，沒有被分析物存在時(shí)產(chǎn)生信號(hào)，如果被分析物存在則沒有信號(hào)產(chǎn)生。在被分析物通過信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)被檢測的實(shí)施例中，例如通過與被分析物特異性反應(yīng)的一種或多種酶，信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)組件可以與測試條材料上的被分析物檢測區(qū)綁定，綁定的方式與上述的特異結(jié)合成分與檢測試紙條材料的相同?？商娲幕蚋郊拥模ㄔ跇悠窇?yīng)用區(qū)，試劑區(qū)，或測試條的分析物檢測區(qū)的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的組成部分，或者被包括在整個(gè)測試條中的部分，可被浸漬到測試條的一種或多種材料中?？梢酝ㄟ^這些組分溶液的表面處理，或通過一個(gè)或多個(gè)測試條材料浸沒入這些組分溶液來實(shí)現(xiàn)。一個(gè)或多個(gè)表面處理或一個(gè)或多個(gè)浸沒之后，測試條材料被干燥?？商娲幕蚋郊拥?，包括在樣品應(yīng)用區(qū)，試劑區(qū)，或測試條的被分析物檢測區(qū)的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的組分，或包含在整個(gè)測試條中的組分，可被應(yīng)用到一個(gè)或多個(gè)測試條的測試條材料表面，如同標(biāo)記試劑一樣。使用過程中，一個(gè)取樣裝置，例如拭子，可用于收集生物樣品，如來自患者受感染的傷口的樣品。一旦樣品被收集，可以在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或直接施加到測定裝置。生物樣品可以在應(yīng)用到測定裝置之前，先在固體或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，下面的例子中有進(jìn)一步描述。該樣品被施加到一個(gè)測定裝置以確定目的被分析物的存在或存在濃度。在實(shí)施例中，測定可用于單獨(dú)檢測金黃色葡萄球菌PVL、金黃色葡萄球菌PBP2a、SPA的存在，不存在，或存在濃度，或者用于檢測它們的任意組合，或包括其他相關(guān)標(biāo)記組合例如，中毒性休克綜合征毒素(TST1編碼)，腸毒素A(entA或sea)，腸毒素B(entB或seb)，來自S.pseuintermedius，S.intermedius，或Sdelphinii的殺白細(xì)胞毒素，α毒素(α-溶血素，HLA)或β-溶血素(HLB)。在其它實(shí)施例中，上述的方法和裝置可用于檢測來源于動(dòng)物樣品的金黃色葡萄球菌或其毒素。例如，在反芻動(dòng)物的各種物種中，包括,金黃色葡萄球菌克隆物CC151和479占主導(dǎo)地位，它們是引起牛乳腺炎的常見原因。顯然，大多數(shù)牛菌株攜帶殺白細(xì)胞素基因lukM/lukF-P83，它可以作為偶然在人菌株間傳播的牛群流行菌株變異的一個(gè)標(biāo)記。如本文中所討論的，本發(fā)明提供了抗體，或能特異結(jié)合PVL毒素的功能性結(jié)合片段。所述抗體或抗體片段不需要預(yù)處理就能夠特異性結(jié)合生物分子，例如，通過生物分子的變性。在一個(gè)實(shí)施例中，抗體或它的功能性結(jié)合片段，其特異性結(jié)合下面的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物：LUKS-PV，lukF-PV，lukM，lukF-P83，mecA和spa。例如，本發(fā)明的抗體可以是對(duì)LUKS-PV的T細(xì)胞表位具有特異性的抗體：N169YISEVERQNSKSVQWGIKANSFIT193(Brown,etal.,OpenJ.Immunol.,2(3):111-115(2012))。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體包括克隆PVL-1031，PVL-1061，PVL-1101，PVL-1321，PVL-1401，PVL-1451，PVL-1631，PVL-1711，PVL-1771，PVL-1841，PVL-1881，PBP2a-1631，PBP2a-1721，PBP2a-1941，PBP2a-6G10，PBP2a-17A10，PBP2a-17C8，PBP2a-19B1，PBP2a-8A5，PBP2a-9C6，PBP2a-PC-2.1，PBP2a-PC-2.2，SPA-A135和SPA-4412。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，相同或基本相同的抗體可通過本領(lǐng)域已知的很多方法產(chǎn)生。特別地，對(duì)本文演示的PVL具有親和力的抗體可被鑒定，例如，通過使用公開抗體的競爭化驗(yàn)法，特別是那些對(duì)PVL具有高親和力的公開抗體即，PVL-1321，PVL-1401和PVL-1841。抗體也可以是共享PVL表位結(jié)合區(qū)域的那些抗體。在這方面，這些領(lǐng)域的技術(shù)人員將熟悉那些識(shí)別抗體中結(jié)合區(qū)域的技術(shù)，包括但不限于Whitelegg和Rees，Marcatili，和Sivasubramanian所公開的模式技術(shù)(ProteinEngineering13(12):819–824(2000)；Marcatili,etal.Bioinformatics,24(17):1953–1954(2008)；andSivasubramanian,etal..Proteins,74(2):497–514(2009))。特別地，對(duì)本文演示的PVL具有親和力的抗體可被鑒定，例如，通過使用公開抗體的競爭化驗(yàn)法，特別是那些對(duì)PVL具有高親和力的公開抗體即，PVL-1321，PVL-1401和PVL-1841?？贵w也可以是共享PVL表位結(jié)合區(qū)域的那些抗體。在這方面，這些領(lǐng)域的技術(shù)人員將熟悉那些識(shí)別抗體中結(jié)合區(qū)域的技術(shù)，包括但不限于Whitelegg和Rees，Marcatili，和Sivasubramanian所公開的模式技術(shù)(ProteinEngineering13(12):819–824(2000)；Marcatili,etal.Bioinformatics,24(17):1953–1954(2008)；andSivasubramanian,etal..Proteins,74(2):497–514(2009))。如本文所用，術(shù)語“抗體”廣義上包括多克隆和單克隆抗體，以及這些抗體的功能性結(jié)合片段。在本發(fā)明中有用的抗體，或它的功能性結(jié)合片段的特征在于，例如，對(duì)PVL毒素的表位具有特異性結(jié)合活性。就抗體而言，使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合活性”是指抗體的互作，或其功能性結(jié)合片段，與特定表位的相互作用具有一個(gè)解離常數(shù)，至少約為1×10-6，一般至少約1×10-7，通常至少約1×10-8，和特別地至少約1×10-9或1×10-10或更小。就此而言，保留了與PVL的表位特異性結(jié)合的抗體的Fab，F(xiàn)(AB')2，F(xiàn)d和Fv片段被包括在抗體的定義內(nèi)。此外，本文所用的術(shù)語“抗體”包括天然存在的抗體以及非天然存在的抗體，包括，例如，單鏈抗體，嵌合抗體，雙功能和人源化抗體，以及它的抗原結(jié)合片段。在不同實(shí)施例中，PVL，PBP2a和/或SPA的檢測可以組合一種或多種另外的被分析物。例如，本發(fā)明采用的方法和裝置可適于檢測一個(gè)或多個(gè)腸毒素A(entA)的，腸毒素B(entB)，毒素休克綜合癥毒素(tst1)，α毒素，α溶血素(HLA)，β溶血素(HLB)，和葡萄球菌激酶(SAK)。下列實(shí)例被用來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施例，但不意味著限制本發(fā)明的范圍。雖然這些實(shí)例是使用實(shí)例中的典范，也可以選擇使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它程序，方法或技術(shù)。實(shí)施例子毒素抗體分析圖1A和1B顯示了PVL的濃度和許多金黃色葡萄球菌菌株(包括MRSA和MSSA)的克隆物的從屬關(guān)系。實(shí)施例子1培養(yǎng)參數(shù)以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌(產(chǎn)量高水平的，低水平的生產(chǎn)菌株和牛的變體)生長在Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)產(chǎn)生PVL。培養(yǎng)物上清液用橫向流測定法檢測(試紙片形式)。如圖2所示，與微芯片測定的結(jié)果幾乎完全一致。在金黃色葡萄球菌菌株NCTC8235上觀察到微弱的假陽性結(jié)果。實(shí)施例子2培養(yǎng)參數(shù)以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌(產(chǎn)量高水平的，低水平的生產(chǎn)菌株和牛的變體)在Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時(shí)用于檢測，用橫向流PVL試紙檢測PVL的產(chǎn)量。結(jié)果與微芯片測定的結(jié)果幾乎完全一致。實(shí)施例子3培養(yǎng)參數(shù)以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌(高水平的生產(chǎn)菌株，低水平的生產(chǎn)菌株和牛菌株變體，lukM/lukF-P83)被接種到血瓊脂平板上過夜培養(yǎng)，從過夜瓊脂平板上分離的克隆被直接檢測PVL的產(chǎn)量。結(jié)果與微芯片測定的結(jié)果幾乎完全一致。實(shí)施例子4培養(yǎng)參數(shù)以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌菌株(PVL陽性ST8-MRSA-IVUSA300和ST22-MRSA-IV)在不同的固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)后被直接檢測PVL的產(chǎn)量。從過夜瓊脂平板上分離的克隆被直接用于橫向流PVL測定(試紙形式)。所有的固體培養(yǎng)基都是陽性結(jié)果。實(shí)施例子5A培養(yǎng)參數(shù)以前鑒定的產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌菌株(很多不同克隆物)用MRSAID顯色瓊脂(BioMerieux)過夜培養(yǎng)后在平板上被直接檢測PVL的產(chǎn)量。從過夜瓊脂平板上分離的克隆被直接用于橫向流PVL測定(試紙形式)。所有克隆物都是陽性結(jié)果。實(shí)施例子5B培養(yǎng)參數(shù)以前鑒定的PVL陰性的金黃色葡萄球菌菌株(很多不同克隆的復(fù)合物)用MRSAID顯色瓊脂(BioMerieux)過夜培養(yǎng)后在平板上被直接檢測PVL的產(chǎn)量。從過夜瓊脂平板上分離的克隆被直接用于橫向流PVL測定(試紙形式)。其結(jié)果與以不同克隆物為陰性對(duì)照的微芯片的結(jié)果幾乎完全一致。實(shí)施例子6金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923(從文化的加藤和野田肉湯上清中純化)產(chǎn)生的一系列PVL毒素稀釋物被用來確定試紙檢測形式的檢測極限?？乖瓭舛葹?0微克/毫升。按手冊(cè)中所描述的，不同稀釋物(終濃度)被施加并應(yīng)用到橫向流PVL檢測(試紙片形式)中。作為參考，用蛋白質(zhì)芯片(ArrayStripTM)的檢出極限被確定為約0.5毫微克/毫升。加入200μl試劑A后的終濃度33.3ng/mL10ng/mL1ng/mL0.1ng/mL0.01ng/mL0.001ng/mL檢測極限被確定為～1納克/毫升。實(shí)施例子7來自金黃色葡萄球菌菌株ATCC25923上清液的未純化的PVL毒素用來確定橫向流PVL測定(浸漬片形式)受Kato和Noda培養(yǎng)基的所有組分影響的檢測極限。不同稀釋物(終濃度)如手冊(cè)上描述的那樣被施加并應(yīng)用到橫向流PVL測定(浸漬片形式)上。檢測的檢出限被確定為約1納克/毫升。這些結(jié)果與實(shí)施例6相結(jié)合表明Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基的組分似乎不影響測定的檢出極限。實(shí)施例子8通過凝固酶陰性的葡萄球菌(CNS)菌株作為陰性對(duì)照來確定橫向流PVL測定的特異性。在Columbia血瓊脂上和Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)一批CNS菌株。從Columbia血瓊脂以及Kato&Noda上清液直接分離的菌落用橫向流PVL測定(浸漬片形式)進(jìn)行檢測。生長在Columbia血瓊脂上的所有CNS菌株的PVL檢測結(jié)果呈陰性。當(dāng)CNS菌株在Kato&Noda中生長，那些在人體中經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)的CNS菌株的小種，其PVL檢測結(jié)果呈陰性。實(shí)施例子9此前鑒定的包括高產(chǎn)PVL和低產(chǎn)PVL的金黃色葡萄球菌株，PVL陰性的菌株和產(chǎn)生假陽性結(jié)果的菌株(NCTC8325)，在Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中生長后，分別劃線接種到Columbia血瓊脂上過夜培養(yǎng)。分離的克隆在葡萄糖肉湯和腦心浸劑肉湯中過夜再培養(yǎng)。每個(gè)生長培養(yǎng)基的樣品上清液直接用橫向流PVL檢測(試紙形式)PVL的產(chǎn)量。PVL陰性菌株在兩種培養(yǎng)基中仍然保持PVL陰性。在Kato&Noda肉湯培養(yǎng)基中呈假陽性的菌株在兩種培養(yǎng)基中PVL是陰性。用兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)高產(chǎn)和低產(chǎn)PVL的菌株的橫向流PVL檢測是陽性。實(shí)施例子10以前鑒定的金黃色葡萄球菌(冷凍庫存珠子)，包括高產(chǎn)PVL和低產(chǎn)PVL的菌株，劃線接種到哥倫比亞血瓊脂過夜。分離的克隆在葡萄糖肉湯與增加了人體血液或Fe++的葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中過夜再培養(yǎng)。同樣的，分離的菌落在Schaedler液體肉湯培養(yǎng)基與增加了人體血液或Fe++的Schaedler肉湯培養(yǎng)基過夜再培養(yǎng)。每種生長培養(yǎng)基的上清液樣品直接用橫向流PVL檢測(試紙形式)PVL的產(chǎn)量。無論是培養(yǎng)基平板還是添加有Fe++的培養(yǎng)基都無PVL產(chǎn)生。然而，添加了人血到兩種培養(yǎng)基中的任意一種都導(dǎo)致PVL的表達(dá)。實(shí)施例子11設(shè)計(jì)一個(gè)研究來確定是否鼻腔樣品中的正常細(xì)菌群落和分泌物會(huì)干擾橫向流PVL的檢測。具體地說，使用Puritan25-3316鼻拭子從具有陽性和陰性的金黃色葡萄球菌的患者上收集鼻樣品。以前鑒定的金黃色葡萄球菌菌株加標(biāo)后(～105CFU)直接進(jìn)入鼻腔樣品。用該拭子樣品接種Kato&Noda液體培養(yǎng)基并培養(yǎng)過夜。用橫向流PVL測定(試紙片形式)檢測培養(yǎng)基中的PVL。正常鼻腔菌群并不干預(yù)PVL的檢測。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該試驗(yàn)具有篩選鼻腔樣品的潛力，并且這些樣品可被培養(yǎng)并用來檢測PVL。實(shí)施例子12為了評(píng)估在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件下使用的潛力，不同的接種時(shí)間和生長培養(yǎng)基被檢測。金黃色葡萄球菌用下列液體培養(yǎng)基中的一種在36℃搖床上生長3-12小時(shí)：葡萄糖肉湯，腦心浸液，或Kato和Noda培養(yǎng)基。用橫向流PVL測定(試紙片形式)過夜培養(yǎng)物中PVL的產(chǎn)量。測定按照提供的手冊(cè)進(jìn)行。200微升檢測試劑移入含有測定軛合物沉淀的反應(yīng)管中。渦旋管子直到測定軛合物(紫色沉淀)被懸浮。加入100微升過夜培養(yǎng)物并晃動(dòng)管子。試紙插入含有檢測試劑和培養(yǎng)物樣品的反應(yīng)管中。10分鐘后結(jié)果可被讀取。觀察到兩個(gè)條帶或線(檢測與對(duì)照)被視為陽性結(jié)果。僅觀察到對(duì)照線被認(rèn)為是陰性結(jié)果。可選擇使用固體培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌在下列固體生長培養(yǎng)基的一種上36℃過夜生長：瓊脂，MuellerHinton瓊脂，MRSAIDTM顯色培養(yǎng)基(BioMerieux)，Columbia血瓊脂，加血的MuellerHinton瓊脂，C.A.P.瓊脂和“巧克力”瓊脂。生長過夜后挑取分離的克隆并重懸浮在100微升下列緩沖液中的一種：緩沖液A1(來自AlereStaphytype測定),PBS,orTRIS/EDTA。200微升檢測試劑被移入含有軛合物(紫色的沉淀)的反應(yīng)管。沉淀通過渦旋重懸浮。100微升重懸浮細(xì)菌加入反應(yīng)管，通過渦旋混勻?；蛘咛羧∫粋€(gè)接種環(huán)的菌落直接溶解在含有200微升檢測試劑的反應(yīng)管中。試紙片放入含有反應(yīng)試劑和檢測樣品的反應(yīng)管中。10分鐘后結(jié)果可讀取。觀察到兩個(gè)條帶或線(試驗(yàn)與對(duì)照)被視為陽性結(jié)果。僅觀察到對(duì)照線被認(rèn)為是陰性結(jié)果。PVL濃度大概從1-5納克/毫升開始，大于這個(gè)濃度可以被這個(gè)測定檢測到。實(shí)施例子13在本實(shí)例中，從臨床條件下分離的培養(yǎng)物被檢測，該臨床條件中PVL占合理的比例。分離物來自下面的條件：皮膚膿腫，“蜘蛛咬傷”病變(尤其是慢性/復(fù)發(fā))，癤病(“疔瘡”)，癰，膿腫形成乳腺炎，蜂窩組織炎，以及不尋常的或嚴(yán)重的皮膚及軟組織感染，如熱帶性膿皮病或壞死性筋膜炎。分別對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，以及通過分子手段檢測PVL基因并分配到克隆物和菌株。231個(gè)金黃色葡萄球菌分離物被檢測的，其來自美國、歐洲、澳大利亞、非洲和中東。屬于26個(gè)不同金黃色葡萄球菌菌種的123個(gè)分離物為PVL陽性。屬于33個(gè)金黃色葡萄球菌菌種的108個(gè)分離物是PVL陰性。橫向流PVL測定(試紙片形式)產(chǎn)生的結(jié)果如下列表1所示(包括重復(fù)試驗(yàn))。表1：橫向流PVL測定(試紙片形式)結(jié)果陽性結(jié)果124陰性結(jié)果108假陽性結(jié)果2假陰性結(jié)果0靈敏性100％特異性98.18％陽性預(yù)測值98.41％陰性預(yù)測值100％橫向流PVL測定(卡片形式)產(chǎn)生的結(jié)果如下列表2所示(包括重復(fù)試驗(yàn))。表2：橫向流PVL測定(卡片形式)結(jié)果陽性結(jié)果23陰性結(jié)果48假陽性結(jié)果6假陰性結(jié)果0靈敏性100％特異性88.89％陽性預(yù)測值79.31％陰性預(yù)測值100％實(shí)施例子14一項(xiàng)涉及快速檢測金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物中的PVL的研究被執(zhí)行，該研究使用單克隆抗體的橫向流測定。研究的目的是為了評(píng)估檢測PVL的橫向流測定。如這里所述，PVL是金黃色葡萄球菌噬菌體源的致病因子。它包含2個(gè)部件(S和F組分)，由2個(gè)雖然共定位共表達(dá)但獨(dú)立的基因編碼。這些分子的聚合物在人類白血球膜上形成孔導(dǎo)致細(xì)胞死亡。PVL與慢性/復(fù)發(fā)性皮膚和軟組織感染(SSTI)有關(guān)，尤其是在年輕人和以前健康的成年人中，和壞死性肺炎。由于其臨床相關(guān)性，攜帶PVL基因的金黃色葡萄球菌的檢測授權(quán)積極治療和感染控制措施(見萬維網(wǎng)hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1218699411960)。然而，因?yàn)镻VL檢測是用分子的方法進(jìn)行，目前該檢測基本上限制于參照中心和專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。為了促進(jìn)快速，非分子的檢測在臨床實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用，單克隆抗體被培育，橫向流測定被開發(fā)。通過噬菌體展示法過表達(dá)的PVL，F(xiàn)組分被用于產(chǎn)生單克隆抗體。接下去免疫小鼠，分離B細(xì)胞的mRNA并擴(kuò)增。得到對(duì)抗體的抗原結(jié)合部分特異的cDNA，連接入噬菌體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。得到純化的抗體，通過ELISA初步定性，不同稀釋物在microtiterstrip-mounted蛋白質(zhì)芯片上顯跡。這樣可以快速地確定捕捉和檢測抗體的最佳組合。這些抗體被用來設(shè)計(jì)橫向流測定如，免疫層析測定，在該測定中金標(biāo)檢測抗體與樣品材料(金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物)混合，通過毛細(xì)作用向固定了檢測抗體的區(qū)域流動(dòng)。在陽性情況下，可觀察到一個(gè)明顯的線形成。制作兩種不同的測定形式(試紙和Binax卡)平行處理來優(yōu)化操作過程和和條款。這個(gè)試驗(yàn)被用于來自皮膚和軟組織感染的金黃色葡萄球菌分離物，平行的，分離物通過芯片雜交測定基因型，來確定菌株和克隆物的從屬關(guān)系以及它們的PVL狀態(tài)圖7描述了Binax卡片形式的檢測過程。對(duì)于試紙片形式，用接種環(huán)挑取培養(yǎng)物并攪拌放入含有標(biāo)記抗體緩沖液的管子中。然后，試紙片放入管子中，10分鐘后結(jié)果可讀取。為了選擇捕捉和標(biāo)記抗體的最優(yōu)組合，每一種抗體的4種不同濃度在蛋白芯片上顯跡。這些芯片用重組PVLF組分，原始PVL(2種不同濃度，來自菌株ATCC25923)或來自獸醫(yī)CC705分離物的“牛殺白細(xì)胞素”lukM/lukF-P83以及所有抗體的所有生物素標(biāo)記的制備物來檢測。根據(jù)這些結(jié)果，抗體5和抗體10的組合物被選定來建立檢測PVL(F組分)以及l(fā)ukF-P83基因產(chǎn)物的橫向流測定。在最初的一系列的實(shí)驗(yàn)中，檢測在不同的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)的已知菌株。如Kato&Noda或Schaedler描述的，在肉湯中，在腦心浸液中以及從普通瓊脂挑取的克隆材料中，具有或不具有血液的MuellerHinton瓊脂中，MRSAID瓊脂(BioMerieux)，Columbia血，C.A.P.和“巧克力”瓊脂中被注意到有可檢測的PVL產(chǎn)量。在葡萄糖肉湯上偶爾觀察到假陰性結(jié)果，以及來自Kato&Noda肉湯或血瓊脂的克隆物CC8菌株的假陽性結(jié)果。這些橫向流測定用于篩選來自SSTI診斷標(biāo)本中的共計(jì)450個(gè)臨床分離物。這些菌株源于澳大利亞，特立尼達(dá)和多巴哥，美國，英國，德國，瑞典，西班牙，挪威，日本，烏干達(dá)和沙特阿拉伯。258株被證明是陽性。它們所屬的分離物屬于20個(gè)克隆物的37個(gè)不同的菌株。已檢測了192PVL陰性分離物屬于29克隆物的47個(gè)不同的菌株。PVL陽性分離物的比例在被檢測的全部SSTI分離物中占10.5％(瑞典樣本)到81.4％(澳大利亞樣本)。該檢測允許PVL快速檢測在不能夠進(jìn)行分子檢測的常規(guī)細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行。因?yàn)樗脴?biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的過夜純培養(yǎng)(包括顯色瓊脂篩選MRSA)，可以很容易地與這樣的實(shí)驗(yàn)室的工作流程相結(jié)合。因此，預(yù)計(jì)將有助于及時(shí)干預(yù)治療PVL相關(guān)感染病例，以及幫助選取一些分離物遞交參考中心進(jìn)一步分型。實(shí)施例子15用篩選測定對(duì)使用PBP2a結(jié)合抗體的PBP2a檢測進(jìn)行評(píng)估，PBP2a結(jié)合抗體通過這里所討論的噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生。一系列來自金黃色葡萄球菌USA300的稀釋過的PBP2a被用于檢測評(píng)估。很多克隆物(數(shù)據(jù)未顯示)具有陽性結(jié)果。實(shí)施例子16此前鑒定的金黃色葡萄球菌(很多不同的克隆物)用本發(fā)明的抗體檢測PBP2a和SPA產(chǎn)量。很多克隆物(數(shù)據(jù)未顯示)具有陽性結(jié)果。實(shí)施例子17此前鑒定的金黃色葡萄球菌(很多不同的克隆物)用本發(fā)明的抗體檢測PVL，PBP2a和SPA產(chǎn)量。很多克隆物(數(shù)據(jù)未顯示)具有陽性結(jié)果。實(shí)施例子18這個(gè)實(shí)例描述了橫向流檢測法的發(fā)展，使用這里所述的單克隆抗體在常規(guī)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室建立快速，非分子的PVL檢測。該測定對(duì)生長在各種不同培養(yǎng)基的分離物進(jìn)行了驗(yàn)證，然后利用從SSTI重新獲得的國際金黃色葡萄球菌對(duì)檢測進(jìn)行評(píng)估。為了開發(fā)快速的表型測定，通過噬菌體展示法，重組PVL的F組分被用于產(chǎn)生單克隆抗體。在蛋白芯片上顯跡，用不同的lukF制備物和測定抗體篩選這些抗體。這樣就鑒定出了用于建立橫向流測定的最優(yōu)抗體組合。這個(gè)試驗(yàn)被用來檢測金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物中的PVL。對(duì)純化的天然和重組抗原的檢測極限被確定為約1納克/毫升。各種固體和液體培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物都適用于PVL檢測。600個(gè)被測定的菌株和臨床分離物來自美國、歐洲、澳大利亞，非洲和中東的患者。平行的分離物通過DNA芯片雜交確定基因型來證實(shí)PVL類型并被轉(zhuǎn)移到克隆表達(dá)中。這個(gè)試驗(yàn)中測定的靈敏性，特異性，陽性和陰性預(yù)測值分別是99.7％,98.3％,98.4％和99.7％。302個(gè)臨床分離物和參考菌株是PVL陽性并被歸屬到21個(gè)不同的克隆物?？偟膩碚f，橫向流檢測允許在常規(guī)細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速的經(jīng)濟(jì)的PVL檢測。因?yàn)闄z測利用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的培養(yǎng)物，不需要高級(jí)設(shè)備，可以簡單的整合到實(shí)驗(yàn)室的工作流程中，有助于及時(shí)治療PVL相關(guān)感染病例。下面為所用的材料和方法重組PVL，F(xiàn)組分PVLF組分基因(lukF-PV)用在5’和3’端包含一個(gè)EcoR1酶切位點(diǎn)和Not1酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)引物(lukF-PV_fw_5Eco,CCTGAATTCATGAAAAAAATAGTCAAATC(SEQIDNO:13)和lukF-PV_rev_5Not,ATAGCGGCCGCTTAGCTCATAGGATTTT(SEQIDNO:14))進(jìn)行擴(kuò)增。來自全測序ST1-MRSA-IV參考菌株MW2的DNA作為模板。PCR產(chǎn)物被克隆到一個(gè)市售載體(TOPOII,Invitrogen,Karlsruhe,德國)上并測序。得到的序列與GenBank登記的相應(yīng)序列比較(BA000033.2；1529381:153035)。確認(rèn)的克隆用EcoR1/Not1酶切，包含開放性讀碼框的DNA片段被插入pet28a表達(dá)載體(Novagen,Darmstadt,德國)連接后，表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21.用50毫升異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，1毫摩爾)誘導(dǎo)后，在50毫升LB培養(yǎng)基中(LB培養(yǎng)基，添加了卡那霉素)獲得表達(dá)重組蛋白。離心收集大腸桿菌細(xì)胞并冰凍過夜。表達(dá)重組蛋白在鎳-次氮基三乙酸-瓊脂糖(Ni-NTA-瓊脂糖)柱(Qiagen,Hamburg,德國)上按照生產(chǎn)商家的說明書純化。每個(gè)步驟取出部分試樣通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析重組蛋白的存在。每一個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)濃度用二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce公司，波恩，德國)測定。噬菌體展示過程和抗體的初測定通過噬菌體展示法過表達(dá)的PVLF組分被用于產(chǎn)生單克隆抗體。接下去免疫小鼠，分離擴(kuò)增B-細(xì)胞的mRNA。獲得對(duì)抗體的抗議結(jié)合部分特異的cDNA，被連入噬菌體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。獲得的抗體被純化，通過ELISA初鑒定，不同的稀釋物在microtiterstrip-mounted蛋白芯片顯跡。根據(jù)此前描述的手冊(cè)使用抗體芯片。為了選擇捕捉和標(biāo)記抗體的最優(yōu)組合，每一個(gè)選定的11種抗體中的5個(gè)不同濃度被點(diǎn)樣到蛋白芯片上。為了測定所有可能的組合，這些芯片用重組PVLF組分，天然的PVL(2種不同濃度，來自CC30-MSSA菌株ATCC25923)或“牛殺白細(xì)胞素”lukM/lukF-P83(來自獸用CC151/705分離物)作為抗原，以及用生物素標(biāo)記的所有11種抗體的制備物作為檢測抗體來測定。然后通過鏈霉親和素-辣根過氧化物酶軛合物和通過過氧化物酶引發(fā)的染料沉淀來進(jìn)行染色。這個(gè)途徑能確定捕捉檢測抗體的最優(yōu)組合(見圖3).橫向流測定PVL的原理檢測金黃色葡萄球菌初代培養(yǎng)中PVL的橫向流測定是免疫層析膜測定，該測定用上述芯片選定的2個(gè)高靈敏性的噬菌體展示重組單克隆抗體。針對(duì)PVL的2個(gè)選定抗體被用于設(shè)計(jì)橫向流測定，其中一個(gè)抗體在檢測試紙上作為抗原俘虜，而第二種抗體在反應(yīng)管內(nèi)被金標(biāo)記并包被。測定試紙由固定在膜支撐物上的PVL捕獲抗體和對(duì)照蛋白組成，加樣品和吸收劑后形成兩條明顯的線。T執(zhí)行檢測時(shí)，金黃色葡萄球菌分離物或培養(yǎng)物上清液被加到包被的反應(yīng)管中，反應(yīng)管含有與已添加的萃取劑共軛的金標(biāo)。然后PVL檢測試紙條被放入反應(yīng)管支持液體樣品和軛合物。10分鐘后根據(jù)粉色到紫色樣品線的存在或不存在對(duì)檢測的結(jié)果進(jìn)行解釋。兩條帶(PVL線和對(duì)照線)說明是有效的陽性結(jié)果，而一條線(對(duì)照線)說明有效的陰性結(jié)果。沒有明顯的對(duì)照線說明這是無效的檢測。執(zhí)行測定對(duì)來自SSTI(見下文)的金黃色葡萄球菌的分離物進(jìn)行檢測，該菌通過芯片雜交檢測基因型來確定菌株和克隆物的從屬關(guān)系和PVL狀態(tài)。280微升萃取劑被特異的加入含有凍干抗體-金軛合物的包被反應(yīng)管。挑取一個(gè)接種環(huán)的金黃色葡萄球菌克隆材料，放入管子，用接種環(huán)徹底混合直到細(xì)胞和軛合物沉淀全部溶解。使用液體培養(yǎng)基時(shí)，200微升緩沖液和100微升過夜液體培養(yǎng)物被加入反應(yīng)管并混合。然后檢測試紙被插入反應(yīng)管，在室溫下培養(yǎng)10分鐘后，檢測試紙離開管子并進(jìn)行讀取。菌株和分離物檢測共計(jì)600個(gè)金黃色葡萄球菌菌株和分離物的lukF-PV產(chǎn)量，同時(shí)包括甲氧西林敏感(MSSA)和抗加氧西林(MRSA)的金黃色葡萄球菌。PVL陰性參考菌株是SangerMSSA476(測過序的ST1-MSSA-SCC/us,GenBank檢索號(hào)BX571857.1),Mu50andN315(同時(shí)測過序的ST5-MRSA-II,GenBankBA000017.4andBA000018.3),NCTC8325(測過序的ST8-MSSA,GenBankCP000253.1),COL(測過序的CC8/ST250-MRSA-I,GenBankCP000046.1)以及澳大利亞(WA)MRSA-8(ST75-MRSA-IV03-17848；(23))和WA-MRSA-59(具有非典型SCCmec元件的CC12-MRSA)PVL陽性參考菌株是MW2-USA400(測過序的ST1-MRSA-IV,GenBankBA000033.2),USA300-FPR3757(測過序的ST8-MRSA-IV,GenBankCP000255.1),ATCC25923(以質(zhì)量控制為目的廣泛用于診斷生物學(xué)的著名分離物ST30-MSSA)，昆士蘭caMRSA(ST93-MRSA-IV03-16790)和WA-MRSA-60/孟加拉海灣caMRSA(ST772-MRSA-V)。另外，包括從具有SSTI的患者上收集到的588個(gè)臨床分離物。源自澳大利亞的臨床分離物(作為全國性的澳大利亞集團(tuán)金黃色葡萄球菌的耐藥性監(jiān)測項(xiàng)目SAP2008andSAP2010的部分)可在萬維網(wǎng)www.agargroup.org/files/FED％20REP0RT％20SAP2008％20MRSA％20final.pdf和www.agargroup.org/files/FED％20REP0RT％20SAP210％20MRSA％20FINAL％20shrink.pdf上獲得。更多的臨床分離物來自德國的診斷實(shí)驗(yàn)室(Dresden大學(xué)醫(yī)院)，沙特阿拉伯(法赫德國王醫(yī)學(xué)城，利雅得)，西班牙(HospitalUniversitariGermans,TriasiPujol，巴達(dá)洛納)，瑞典(Oerebro大學(xué)附屬醫(yī)院)，特立尼達(dá)和多巴哥共和國(從全國各地區(qū)醫(yī)院)，烏干達(dá)(在恩德培的醫(yī)學(xué)研究理事會(huì))和英國(包括在布里斯托爾西南部的一個(gè)醫(yī)院，和國家葡萄球菌參考單位，HPA，倫敦)。所有來自英格蘭的分離物和來自其他國家(8個(gè)來自沙特阿拉伯，7個(gè)來自德國，3個(gè)來自澳大利亞)分離物的PVL狀態(tài)是已知的。這些菌株被包括是為了最大限度地代表廣泛的克隆物范圍，在對(duì)來源于不同的國家的PVL進(jìn)行概率分析時(shí)，這些菌株被排除在外。另外，檢測17個(gè)分離物的LukF-P83；包括屬于家畜相關(guān)菌系CC133,CC151/705和CC479的獸醫(yī)來源(牛和羊)的P83陽性分離物。這些分離物來自以前的研究或參考弗里德里希洛弗勒研究所，德國耶拿。作為對(duì)照，3個(gè)lukM/lukF-P83陰性分離物被包括：2個(gè)CC133分離物，一個(gè)來自疣鼻天鵝，一個(gè)是來自Dresden大學(xué)醫(yī)院的人類分離物和來自牛的CC479分離物。沒有l(wèi)ukF-P83陰性CC151/705分離物可用于檢測。用不同培養(yǎng)基驗(yàn)證橫向流測定液體培養(yǎng)基包括葡萄糖肉湯(OXOID，目錄為Nr.CM67加葡萄糖)，腦心浸液(OXOID，CM225)，2XTY(胰蛋白胨/酵母提取物)，Schaedler肉湯+維生素K3(梅里埃，42106)和Kato和Noda所描述的肉湯T接下去所用的固體培養(yǎng)基為：普通瓊脂(OXOID，CM3),加血與不加血的MuellerHinton瓊脂(OXOID，CM337)，哥倫比亞血瓊脂(瓊脂主要成分OXOID，CM331和羊血OXOID，F(xiàn)SR1055)，CAP瓊脂，“巧克力”瓊脂(瓊脂基礎(chǔ)OXOID，CM331和羊血OXOIDFSR1055加血晶素，賽瓦，24410，和NAD，默克，1.024542)和市售葡萄球菌MRSA顯色培養(yǎng)基(MRSAID瓊脂，bioMerieux，43459)。芯片程序?yàn)榱舜_認(rèn)PVL狀態(tài)并分配給相應(yīng)的克隆物和菌株，所用分離物用DNA芯片雜交定性。根據(jù)生產(chǎn)商家的說明執(zhí)行程序；引物、標(biāo)記和進(jìn)一步的細(xì)節(jié)同上所述。酶裂解后簡單的制備DNA。多重引物延伸來擴(kuò)增和標(biāo)記(通過混合生物素-16-dUTP)大概對(duì)應(yīng)170個(gè)基因的共計(jì)333條靶序列。單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物與具有相應(yīng)探針的芯片進(jìn)行雜交。添加了能結(jié)合生物素標(biāo)記的鏈霉親和辣根過氧化物酶結(jié)合物，并用過氧化物酶-引發(fā)染料沉淀，使雜交可視化。對(duì)由此產(chǎn)生的芯片上的斑點(diǎn)圖案進(jìn)行掃描，分析，與此前模式菌株的參考數(shù)據(jù)相比較。在補(bǔ)充文件中提供了所有菌株和分離株的全雜交圖。獲得下列試驗(yàn)結(jié)果抗體篩選根據(jù)圖3顯示的篩選結(jié)果，抗體1401(這里也指PVL-1401)和抗體1841(這里也指PVL-1841)的組合被選定來建立能檢測PVL(F組分)以及l(fā)ukF-P83基因產(chǎn)物的橫向流測定。通過一些了稀釋，確定橫向流測定對(duì)純化的天然和重組抗原的檢測極限約為1納克/毫升。對(duì)不同生長培養(yǎng)基的橫向流檢測試驗(yàn)在最初的一系列實(shí)驗(yàn)中，檢測在不同生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)的已知菌株。培養(yǎng)PVL陰性Mu50(ST5-MRSA-II)，NCTC8523(ST8-MSSA)，ST398-MRSA-V和ST8-MSSA的已知菌株以及PVL陽性的USA300-FPR3757(ST8-MRSA-IV，USA300)，CC30-MSSA和ST93-MRSA-IV(昆士蘭克隆)分離物的液體生長培養(yǎng)基中(葡萄糖肉湯，腦心浸液，2XTY，Schaedler，Kato&Noda)被檢測。PVL陰性ST8-MSSA菌株NCTC8325在Kato&Noda所描述的生長培養(yǎng)基中具有微弱但一致的假陽性結(jié)果。用ST8-MSSA相同表型的臨床分離菌株沒有觀察到相同情況。所有其他的結(jié)果是正確的。從產(chǎn)生正確陽性結(jié)果的普通瓊脂，無血和有血MuellerHinton瓊脂，哥倫比亞血，C.A.P和“巧克力”瓊脂上挑取克隆材料(USA300-FPR3757和PVL陽性的ST22-MRSA-IV)。然后從哥倫比亞血瓊脂的過夜培養(yǎng)菌落篩選臨床分離株(見下文)。除了前述的生長培養(yǎng)基，對(duì)市售的用于檢測MRSA的發(fā)光培養(yǎng)基進(jìn)行了測試(MRSAID瓊脂來自梅里埃公司)。對(duì)以下的PVL陽性菌株進(jìn)行了測試，并取得了正確的結(jié)果：CC1-MRSA-IV(MW2，USA400)，CC5-MRSA-IV，ST8-MRSA-IV(USA300-FPR3757)，ST22-MRSA-IV，ST30-MRSA-四(西南太平洋克隆)，ST59/ST952-MRSA-V(T)(臺(tái)灣克隆)，CC80-MRSA-IV(歐洲caMRSA克隆)，CC88-MRSA-IV和CC152-MRSA-V。PVL陰性菌株CC1-MRSA-IV&SCC/us(WA-MRSA-1/45)，ST22-MRSA-IV(UK-EMRSA-15/Barnim)，ST45-MRSA-IV(柏林EMRSA)，ST75-MRSA-IV(WA-MRSA-8)，ST239-MRSA-III(維也納/匈牙利/巴西流行株)，以及在MRSAID瓊脂上產(chǎn)生準(zhǔn)確(陰性)結(jié)果的CC80-MRSA-IV的一個(gè)PVL陰性變體。LukF-P83的檢測14個(gè)lukF-P83陽性分離物(2個(gè)CC133，4個(gè)CC479和8個(gè)CC151)在橫向流測定中產(chǎn)生陽性結(jié)果。3個(gè)lukF-P83陰性分離物(2個(gè)CC133和1個(gè)CC479)被正確的鑒定為陰性。用橫向流測定和芯片篩選臨床分離物與芯片的基因分型數(shù)據(jù)比較時(shí)，301個(gè)實(shí)驗(yàn)是真陽性，293個(gè)是真陰性；有5個(gè)假陽性，和1個(gè)假陰性。這相當(dāng)于靈敏性99.7％，特異性98.3％，PPV98.4％和NPV99.7％。隨后對(duì)這六個(gè)錯(cuò)誤結(jié)果的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)并取得正確的結(jié)果，這說明在初級(jí)測定時(shí)操作錯(cuò)誤。總的來說，297個(gè)檢定分離物和5個(gè)參考菌株是PVL陽性。通過芯片雜交，它們被分配到21個(gè)克隆物中，CC1(包括ST772),CC5,CC8(包括ST72),CC15,CC22,CC25,CC30,CC45,CC49,CC59,CC80,CC88,CC93,CC96,CC121,CC152,CC188,CC398和3個(gè)未鑒定的菌系(圖13)。它們中的一個(gè)產(chǎn)生1-141-1-1-128-3的MLST屬性(與STs1279/1496/1982有關(guān)).最常分離到的PVL陽性菌系是CC12(來自不同區(qū)域的50個(gè)分離物，都是MSSA)，CC8(46個(gè)分離物包括來自特立尼達(dá)島和多巴哥島的MSSA，以及來自各區(qū)域的“US300”)和CC93(42個(gè)分離物，MSSA和ST93-MRSA-IV，昆士蘭caMRSA克隆，幾乎全部來自澳大利亞)。287個(gè)PVL陰性檢測分離物和7個(gè)參考菌株屬于31個(gè)不同克隆物：CC1,CC5,CC6,CC7,CC8(包括ST72和ST239),CC9(ST834),CC12,CC15,CC20,CC22,CC25,CC30(包括ST34),CC45,CC50,CC59,CC75,CC80,CC88,CC96,CC97,CC101,CC121,CC140,CC188,CC398,CC425,CC509,CC707和CC1021.一個(gè)CC不能分派2個(gè)分離物。陽性金黃色葡萄球菌在不同國家的流行在所有SSTI的分離物中流行的PVL陽性分離物在不同國家之間存在廣泛的變化。在澳大利亞的樣本中觀察到的PVL陽性率最高，有82.2％(90中的72)為PVL陽性。PVL陽性菌株的一半(74個(gè)中的37個(gè))是CC93，并且其中大部分是MRSA(37個(gè)CC93分離物的29個(gè)，78％)，這反映了目前所謂的昆士蘭caMRSA克隆所造成的負(fù)擔(dān)。第2位和第3位常在澳大利亞被分離到的PVL陽性克隆是CC121-MSSA(N＝15)和CC93-MSSA(N＝8)。僅有兩個(gè)ST8-MRSA-IV(USA300)菌株被鑒定。PVL陰性金黃色葡萄球菌菌株分別來自多個(gè)CC菌系，包括CC1，CC5，CC8，CC8/ST72，CC15，CC22，CC30，CC45，CC88和CC188，包括兩個(gè)MRSA克??；ST22-MRSA-IV(UK-EMRSA-15/BarnimEMRSA)和ST5-MRSA-IV(小兒克隆/WA-MRSA-65)。來自德國的SSTI分離物中，有PVL概率是40％(50個(gè)中20個(gè))。最常見的菌株是CC121-MSSA(n＝7)和CC30-MSSA(n＝4)。每一個(gè)ST8-MRSA-IV(USA300)和ST93-MRSA-IV(昆士蘭caMRSA克隆)分離物都被鑒定，后者與傳播到澳大利亞有關(guān)。在PVL陰性之中，CC30和CC8是最常被分離到的；其他CC包括CC5,CC7,CC8/ST72,CC15,CC22,CC45,CC101和CC398。屬于CC7-MRSA-IV,CC22-MRSA-IV(UK-EMRSA-15/BarnimEMRSA),ST5/ST225-MRSA-II(UK-EMRSA-3/Rhine-HesseEMRSA)和CC45-MRSA-IV(柏林EMRSA)的PVL陰性的MRSA單菌落被鑒定。對(duì)于來自沙特阿拉伯的分離物，47.3％被證實(shí)是PVL陽性。大約一半是MRSA(n＝13)，該MRSA具有屬于CC80-MRSA-IV(歐洲caMRSA克隆)的最常見的PVL陽性單克隆。最常見的分離物PVL-MSSA克隆是CC30-MSSA(n＝4)和還未被鑒定的MSSA(n＝3)。PVL陰性菌株屬于CC1,CC5,CC6,CC7,CC8,CC9/ST834,CC15,CC22,CC25,CC30,CC45,CC75(與ST1667有關(guān)),CC80,CC96,CC97,CC398(ST291/813),和一個(gè)未鑒定菌系。MRSA的比例高(29個(gè)PVL陰性中8個(gè)是MRSA)；最常見的菌株是ST239-MRSA-III(維也納/匈牙利/巴西克隆，n＝4)。其他MRSA屬于CC22-MRSA-IV的tstl-陽性變種，CC80-MRSA-IV的PVL陰性變種，僅知道來自馬耳他(27)的CC5-MRSA-IV&SCC/us菌株和CC9/ST834-MRSA-VI。第二高的PVL概率被發(fā)現(xiàn)在西班牙，具有75％(44個(gè)中33個(gè))的PVL基因和分泌LukF-PV蛋白陽性。這里最常見的克隆是ST8-MRSA-IV(USA300)的ACME陰性變種，有10個(gè)分離物被分配給該變種。接著是CC30-MSSA(n＝6)和CC22-MSSA(n＝5)。PVL陰性屬于各種各樣的CC(CC5,CC8/ST72,CC15,CC30,CC45,CC121,CC188和CC707)，不包括任何MRSA。最低的PVL流行率在瑞典分離物中被發(fā)現(xiàn)，僅16.7％(114個(gè)中19個(gè))是PVL陽性，都是MSSA。最常見的PVL陽性菌株是CC30-MSSA(n＝4)和CC121-MSSA(n＝3)。PVL陰性分離物是CC1,CC5,CC7,CC8,CC12,CC15,CC20,CC22,CC30,CC45,CC50,CC88,CC97,CC101,CC121,CC188,CC509andCC1021。CC45(n＝19)和CC15(n＝18)是最常見的CC分離物。MRSA沒有被發(fā)現(xiàn)。在特立尼達(dá)島和多巴哥島共和國，PVL流行率是50％(80個(gè)中40個(gè)分離物)。最豐富的PVL陽性菌株是CC8-MSSA(n＝18),該菌株另外攜帶腸毒素基因sed,sej,ser,sek和seq。兩個(gè)CC8-MRSA-IV分離物被鑒定為具有相同的毒素屬性，但缺乏ACME，因此與WA-MRSA-62類似。ST8-MRSA-IV(USA300)，即攜帶ACME位點(diǎn)和腸毒素基因sek和seq，在三種情況下被鑒定。其他分離到的常見的PVL陽性菌株是CC30-MSSA(n＝10)和CC5-MSSA(n＝5)。PVL陰性分離物包括CC1,CC6,CC7,CC8,CC8/ST72,CC8/ST239,CC12,CC15,CC45,CC59,CC101,CC121,CC188和與CC75(ST1223,ST1667)有關(guān)的不尋常菌株。PVL陰性MRSA菌株是CC59-MRSA-V&SCC/us和ST239-MRSA-III(維也納/匈牙利/巴西克隆)。與來自其他國家的收集菌株相對(duì)應(yīng)的，英國的分離物的PVL狀態(tài)是已知的，因此其PVL率不能與其他國家的進(jìn)行比較。很多不同的PVL-MRSA菌株在倫敦的分離物中被鑒定出，CC30-MRSA-IV(西南太平洋caMRSA克隆),CC5-MRSA-IV(小兒克隆),CC5-MRSA-V,CC80-MRSA-IV(歐洲caMRSA克隆),ST59/ST952-MRSA-V(T)(臺(tái)灣caMRSA克隆),ST772-MRSA-V(孟加拉海灣caMRSA克隆/WA-MRSA-60),ST8-MRSA-IV(USA300)和ST93-MRSA-IV(昆士蘭caMRSA克隆).PVL陰性分離物屬于CC1,CC8,CC8/ST239,CC12,CC22,CC25,CC30,CC45,CC59,CC121,CC425包括MRSA菌株CC1-MRSA-IV(WA-MRSA-1/57),ST239-MRSA-III(維也納/匈牙利/巴西克隆),CC22-MRSA-IV(UK-EMRSA-15/BarnimEMRSA)和ST59-MRSA-V。進(jìn)一步包括來自英國西南部第二中心的已知為PVL陽性的28個(gè)分離物。這些分離物被排除在PVL概率分析之外，但他們的種群結(jié)構(gòu)是值得注意的。這個(gè)組僅包括2個(gè)PVL陽性MRSA，ST772-MRSA-V(孟加拉海灣caMRSA克隆/WA-MRSA-60)andCC1-MRSA-IV(USA400)。也包括一個(gè)CC59-MSSA可能是ST59/ST952-MRSA-V(T)(臺(tái)灣caMRSA克隆)的SCCmec檢測突變體，根據(jù)抗性基因和毒性標(biāo)記(erm(B),apha3,sat,tet(K),cat,fexA,seb/k/q,lukF/S-PV)的雜交屬性。這個(gè)組中最常見的菌株是PVL陽性CC22-MSSA(n＝10)。另外5個(gè)具有SPA類型t417或t1601的PVL陽性CC22分離物攜帶“SCCfus”組件(ccrA/B-1,andQ6GD50,orfusC)。這些分離物來自平均年齡接近94歲的患者。這在PVL陽性中是不尋常的發(fā)現(xiàn)，這說明這個(gè)克隆物與這個(gè)區(qū)域護(hù)理設(shè)備間的可能聯(lián)系。PVL是金黃色葡萄球菌獨(dú)特的毒力標(biāo)志，與臨床癥狀的關(guān)聯(lián)非常普遍，這些癥狀往往要么慢性/反復(fù)發(fā)作，或偶爾進(jìn)展迅速而危及生命。因此PVL的診斷檢測能滿足目標(biāo)患者的管理的需要。這里所述的橫向流測定允許在不能輕易進(jìn)行分子測定的常規(guī)細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行PVL快速檢測。當(dāng)利用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的過夜培養(yǎng)物時(shí)，例如Columbia血瓊脂，這樣就能輕易的整合入常規(guī)診斷實(shí)驗(yàn)室的工作流程中。因此測定可能有助于及時(shí)干預(yù)PVL相關(guān)感染病例，也能幫助選擇一些需要遞交參考中心進(jìn)一步分型的菌株。金黃色葡萄球菌體外分泌的PVL有廣泛的變化，然而基因型和表型間的高度一致說明lukS/F-PV陽性菌株在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基條件下通常能表達(dá)可檢測數(shù)量的PVL。在這個(gè)研究中沒有鑒定到含有PVL基因卻不產(chǎn)生體外毒素的分離物。由于缺少體外表達(dá)造成假陰性的可能性是很低的。這個(gè)研究中所包括的PVL和lukM/lukF-P83陽性菌株的多樣性說明，可能的PVL序列特異變體菌系不會(huì)對(duì)PVL檢測造成障礙，PVL檢測使用這里所述的抗體。這里描述的菌株收集物進(jìn)一步提供了與SSTI相關(guān)的金黃色葡萄球菌的分子流行病學(xué)的快照。在PVL陽性甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌中，CC121(總計(jì)50個(gè)分離物)和CC30(35個(gè)分離物)占主導(dǎo)地位。在特立尼達(dá)和多巴哥共和國中PVL陽性CC8-MSSA是非常豐富的，雖然這個(gè)菌株在其他地方罕見。這印證了USA300菌株在加勒比海/拉丁美洲地區(qū)出現(xiàn)的假說。這個(gè)研究還顯示了MRSA在世界的不同部分造成了嚴(yán)重的問題。MRSA(在這個(gè)研究中)流行率低或沒的國家是瑞典和烏干達(dá)，瑞典在MRSA感染控制是具有非常嚴(yán)格的政策，烏干達(dá)在醫(yī)療保健和獸醫(yī)中使用抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的選擇壓力比其他國家有更多的限制。在別的地方，由PVL陽性/ACME陽性ST8-MRSA-IV(USA300),PVL陽性/ACME陰性ST8-MRSA-IV,PVL陽性ST80-MRSA-IV(歐洲caMRSA克隆)和ST93-MRSA-IV(昆士蘭caMRSA克隆)和PVL陰性ST239-MRSA-III主導(dǎo)的MRSA經(jīng)常被分離到。橫向流測定與MRSA顯色篩選培養(yǎng)基相結(jié)合的可能性促進(jìn)了新興的PVL陽性caMRSA菌株的快速篩選。這有助于捕獲它們的傳播和進(jìn)一步的擴(kuò)散。在澳大利亞和西班牙分離物中PVL陽性的高百分率以及ST93-MRSA-IV(昆士蘭caMRSA克隆)和ST8-MRSA-IV在這兩個(gè)國家的主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)說明，PVL陽性caMRSA的擴(kuò)展沒有發(fā)生，是以建立PVL陽性MSSA種群為代價(jià)的，但除它之外。除了限制β-內(nèi)酰胺的功效作為主要的治療選擇，PVL陽性caMRSA的出現(xiàn)可能因此導(dǎo)致PVL疾病相關(guān)的負(fù)擔(dān)增加。雖然在當(dāng)前研究中分離物的數(shù)量不足以明白的證明這樣的趨勢(shì)，還需進(jìn)行關(guān)于PVL陽性金黃色葡萄球菌的分子流行學(xué)的進(jìn)一步研究。這里所述的發(fā)明可以在缺少未具體公開的任何要素或多個(gè)要素，一個(gè)或多個(gè)限制的情況下實(shí)施。所采用的術(shù)語或表達(dá)被用作描述術(shù)語而不是限制，并且，這里也沒有任何意圖在使用本發(fā)明的術(shù)語和解釋的時(shí)候，并沒有排除那些與本發(fā)明描述的特征等同的例子，但是，可以認(rèn)識(shí)到，很多機(jī)遇本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)的改動(dòng)也是可能的。以你，可以理解，盡管本發(fā)明機(jī)遇很多的實(shí)施例子進(jìn)行了揭示和描述，基于發(fā)明描述的精髓進(jìn)行改進(jìn)或改變是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以進(jìn)行的，這樣的改變和活便也被認(rèn)為是屬于本發(fā)明哪些從屬權(quán)利要求所限定的范圍。本發(fā)明說明書中提到的所有專利和出版物都表示這些是本領(lǐng)域的公開技術(shù)，本發(fā)明可以使用。這里所引用的所有專利和出版物都被同樣列在參考文獻(xiàn)中，跟每一個(gè)出版物具體的單獨(dú)被參考引用一樣。這里采用的術(shù)語和表達(dá)方式所為描述方式，而不受其限制，這里也沒有任何意圖來指明此書描述的這些術(shù)語和解釋排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本發(fā)明和權(quán)利要求的范圍內(nèi)做任何合適的改變或修改?？梢岳斫?，本發(fā)明所描述的實(shí)施例子都是一些優(yōu)選的實(shí)施例子和特點(diǎn)，任何本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都可以根據(jù)本發(fā)明描述的精髓下做一些更改和變化，這些更改和變化也被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍和獨(dú)立權(quán)利要求以及附屬權(quán)利要求所限制的范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>美艾利爾圣地亞哥公司<120>檢測殺細(xì)胞的毒素（PVL）的裝置和方法<150>US61/714,649<151>2012-10-16<150>US61/617,974<151>2012-03-30<150>US61/561,767<151>2011-11-18<150>US61/558,848<151>2011-11-11<160>14<170>PatentInversion3.5<210>1<211>660<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Syntheticconstruct<400>1gacgttgtgatgtcacagtctccatcctccctgactgtgacagcaggagagaaggtcact60atgagctgcaagtccagtcagagtctgttactcagtggaaatcaaaagaacctcttgacc120tggttccagcagaaaccagggcagcctcctaaactgttgatctactgggcatccactagg180gaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctggaacagatttcactctcacc240atcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgattataattat300ccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgggctgatgctgcaccaact360gtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgc420ttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaa480cgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagc540atgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgt600gaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtct660<210>2<211>220<212>PRT<213>ArtificialSequence<220><223>Syntheticconstruct<400>2AspValValMetSerGlnSerProSerSerLeuThrValThrAlaGly151015GluLysValThrMetSerCysLysSerSerGlnSerLeuLeuLeuSer202530GlyAsnGlnLysAsnLeuLeuThrTrpPheGlnGlnLysProGlyGln354045ProProLysLeuLeuIleTyrTrpAlaSerThrArgGluSerGlyVal505560ProAspArgPheThrGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThr65707580IleSerSerValGlnAlaGluAspLeuAlaValTyrTyrCysGlnAsn859095AspTyrAsnTyrProTyrThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIle100105110LysArgAlaAspAlaAlaProThrValSerIlePheProProSerSer115120125GluGlnLeuThrSerGlyGlyAlaSerValValCysPheLeuAsnAsn130135140PheTyrProLysAspIleAsnValLysTrpLysIleAspGlySerGlu145150155160ArgGlnAsnGlyValLeuAsnSerTrpThrAspGlnAspSerLysAsp165170175SerThrTyrSerMetSerSerThrLeuThrLeuThrLysAspGluTyr180185190GluArgHisAsnSerTyrThrCysGluAlaThrHisLysThrSerThr195200205SerProIleValLysSerPheAsnArgAsnGluSer210215220<210>3<211>681<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>Syntheticconstruct<400>3caggtccagctgcagcagtctgggcctcagctggttaggcctggggcttcagtgaagata60tcctgcaaggcttctggtcactcattcaccacctactggatgcactgggtgaagcagagg120cctggacaaggtcttgagtggattggcatgattgatccttccgatagtgaaactaggtta180aatcagaagttcaaggacaaggccacattgactgtagacaaatcctccagcacagtctac240atgcaactcagcagcccgacatctgaagactctgtggtctattactgtgcaagctactat300ggcaattctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagccaaaacg360acacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtg420accctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactct480ggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacact540ctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaac600gttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtcat660catcaccatcaccatcactaa681<210>4<211>226<212>PRT<213>ArtificialSequence<220><223>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