本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可采用膠乳增強免疫比濁法測定人血清中涎液化糖鏈抗原含量的涎液化糖鏈抗原測定試劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
KL-6(涎液化糖鏈抗原)屬claster9MUCI類，相對分子量接近200000的糖蛋白。主要由增殖、再生的或受損的肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌，在正常肺組織中，KL-6在II型肺泡細胞，呼吸性細支氣管上皮細胞和支氣管腺漿液細胞上表達。
當(dāng)機體肺泡上皮細胞遭受一定程度的損傷時，一方面，Ⅱ型肺泡上皮細胞增生并激活，對KL-6的分泌快速增加；另一方面肺間質(zhì)基底膜通透性增加，使KL-6開始向血液循環(huán)擴散，血清KL-6水平也出現(xiàn)一定程度的升高。
間質(zhì)性肺炎，尤其是活動性高的病例，血清KL-6尤呈高值。健康者和無間質(zhì)性肺炎、肺纖維化的呼吸系統(tǒng)疾病則呈低值。
KL-6是檢測間質(zhì)性肺炎的全新血清生物標(biāo)記物(高靈敏度和高特異度)，是診斷、監(jiān)測和預(yù)后的有用指標(biāo)，可評估間質(zhì)性肺疾病的活動性，可預(yù)測ILDs的臨床轉(zhuǎn)歸，可提供有價值的解決方案。
KL-6的檢測
KL-6是一種相對穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，在-20℃下標(biāo)本可以長期保存。目前有層析定性和酶免定量的檢測方法可用，層析定性僅能在樣本濃度超過檢測限后簡單確定有無，無法準(zhǔn)確定量，不能反映病情的輕重程度及對病情進行及早的發(fā)現(xiàn)和治療，而且存在較大的假陰或假陽，酶免方法主要是被科學(xué)研究者應(yīng)用于科研，由于各自進行檢測試劑的制備，沒有統(tǒng)一的配方及工藝，沒有對檢測條件深入研究，導(dǎo)致不同批次試劑檢測結(jié)果差異較大。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種涎液化糖鏈抗原測定試劑及其制備方法。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的之一，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種涎液化糖鏈抗原測定試劑，包括預(yù)處理試劑、抗體膠乳試劑、校準(zhǔn)試劑；
所述預(yù)處理試劑包括緩沖劑、信號增強劑、防腐劑，所述預(yù)處理試劑的PH值為7.2-7.6；
所述抗體膠乳試劑包括緩沖劑、結(jié)合有抗人涎液化糖鏈抗原抗體的膠乳微球、穩(wěn)定劑，所述膠乳微球直徑為100-400nm；
所述校準(zhǔn)試劑包括定量的涎液化糖鏈抗原。
作為本發(fā)明進一步改進的技術(shù)方案，所述預(yù)處理試劑中的緩沖劑為磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸中的一種，信號增強劑為聚乙二醇10000、氟化鈉中的一種。
作為本發(fā)明進一步改進的技術(shù)方案，所述抗體膠乳試劑中與膠乳微球結(jié)合的抗人涎液化糖鏈抗原抗體為鼠抗人涎液化糖鏈抗原單克隆抗體、羊抗人涎液化糖鏈抗原單克隆抗體、兔抗人涎液化糖鏈抗原單克隆抗體中至少一種，或者是鼠抗人涎液化糖鏈抗原多克隆抗體、羊抗人涎液化糖鏈抗原多克隆抗體、兔抗人涎液化糖鏈抗原多克隆抗體中至少一種。
作為本發(fā)明進一步改進的技術(shù)方案，所述抗體膠乳試劑中的穩(wěn)定劑為環(huán)糊精、酪蛋白、抗壞血酸中的一種或多種。
為實現(xiàn)上述另一發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種涎液化糖鏈抗原測定試劑的制備方法，分別制備預(yù)處理試劑、抗體膠乳試劑、校準(zhǔn)試劑；
所述預(yù)處理試劑的制備方法包括以下步驟：將緩沖劑、信號增強劑、防腐劑、無機鹽與水混合調(diào)配為PH值為7.2-7.6的溶液即得；
所述抗體膠乳試劑的制備方法依次包括以下步驟：
S1、將抗人涎液化糖鏈抗原抗體在PH8.0-9.0的碳酸氫鈉緩沖溶液中，于2-8攝氏度進行至少兩次透析，以除去干擾標(biāo)記反應(yīng)的雜質(zhì)；
S2、將透析后的抗人涎液化糖鏈抗原抗體溶液用pH9.0-9.5的磷酸鹽緩沖液稀釋到1-2mg/ml，加入適量的熒光素，在25攝氏度持續(xù)、輕微混合1小時，進行標(biāo)記反應(yīng)以制得熒光素化抗人涎液化糖鏈抗原抗體溶液；
S3、將步驟S2所得溶液在pH7.5-8.0的磷酸鹽緩沖液中，于2-8攝氏度進行至少兩次透析，除去未反應(yīng)的熒光素；
S4、將透析后的熒光素化抗人涎液化糖鏈抗原抗體溶液與適量的結(jié)合有抗熒光素抗體的膠乳微球溶液混合，在25攝氏度持續(xù)、輕微混合1小時，并加入穩(wěn)定劑即得；
所述校準(zhǔn)試劑的制備方法包括以下步驟：使用稀釋液將涎液化糖鏈抗原稀釋到所需濃度即得。
作為本發(fā)明進一步改進的技術(shù)方案，所述抗體膠乳試劑的制備步驟S2中的熒光素為活化熒光素，用超純水溶解后直接進行標(biāo)記反應(yīng)。
作為本發(fā)明進一步改進的技術(shù)方案，所述抗體膠乳試劑的制備步驟S4中穩(wěn)定劑為環(huán)糊精、酪蛋白、抗壞血酸中的一種或多種。
作為本發(fā)明進一步改進的技術(shù)方案，所述抗體膠乳試劑的制備步驟S4中的膠乳微球為單一的粒徑，或由不同粒徑大小的膠乳微球混合而成。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)效果在于：
本發(fā)明通過抗人涎液化糖鏈抗原抗體與膠乳微球結(jié)合，可采用膠乳增強免疫比濁法來測定人體血清中KL-6的含量，該試劑操作簡便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，適于高通量檢測，能夠在全自動生化分析儀上使用，與酶免定量方法測定的結(jié)果有很好的符合性。
具體實施方式
以下將結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行詳細描述。但這些實施方式并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)這些實施方式所做出的結(jié)構(gòu)、方法、或功能上的變換均包含在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
本發(fā)明提供了一種涎液化糖鏈抗原測定試劑，包括預(yù)處理試劑、抗體膠乳試劑、校準(zhǔn)試劑；
所述預(yù)處理試劑包括緩沖劑、信號增強劑、防腐劑，所述預(yù)處理試劑的PH值為7.2-7.6；
所述抗體膠乳試劑包括緩沖劑、結(jié)合有抗人涎液化糖鏈抗原抗體的膠乳微球、穩(wěn)定劑，所述膠乳微球直徑為100-400nm；
所述校準(zhǔn)試劑包括定量的涎液化糖鏈抗原。
進一步的，所述預(yù)處理試劑中的緩沖劑為磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、4-羥乙基哌嗪乙磺酸中的一種，信號增強劑為聚乙二醇10000、氟化鈉中的一種。
進一步的，所述抗體膠乳試劑中與膠乳微球結(jié)合的抗人涎液化糖鏈抗原抗體為鼠抗人涎液化糖鏈抗原單克隆抗體、羊抗人涎液化糖鏈抗原單克隆抗體、兔抗人涎液化糖鏈抗原單克隆抗體中至少一種，或者是鼠抗人涎液化糖鏈抗原多克隆抗體、羊抗人涎液化糖鏈抗原多克隆抗體、兔抗人涎液化糖鏈抗原多克隆抗體中至少一種。
進一步的，所述抗體膠乳試劑中的穩(wěn)定劑為環(huán)糊精、酪蛋白、抗壞血酸中的一種或多種。
本發(fā)明還提供了一種涎液化糖鏈抗原測定試劑的制備方法，分別制備預(yù)處理試劑、抗體膠乳試劑、校準(zhǔn)試劑；
所述預(yù)處理試劑的制備方法包括以下步驟：將緩沖劑、信號增強劑、防腐劑、無機鹽與水混合調(diào)配為PH值為7.2-7.6的溶液即得；
所述抗體膠乳試劑的制備方法依次包括以下步驟：
S1、將抗人涎液化糖鏈抗原抗體在PH8.0-9.0的碳酸氫鈉緩沖溶液中，于2-8攝氏度進行至少兩次透析，以除去干擾標(biāo)記反應(yīng)的雜質(zhì)；
S2、將透析后的抗人涎液化糖鏈抗原抗體溶液用pH9.0-9.5的磷酸鹽緩沖液稀釋到1-2mg/ml，加入適量的熒光素，在25攝氏度持續(xù)、輕微混合1小時，進行標(biāo)記反應(yīng)以制得熒光素化抗人涎液化糖鏈抗原抗體溶液；
S3、將步驟S2所得溶液在pH7.5-8.0的磷酸鹽緩沖液中，于2-8攝氏度進行至少兩次透析，除去未反應(yīng)的熒光素；
S4、將透析后的熒光素化抗人涎液化糖鏈抗原抗體溶液與適量的結(jié)合有抗熒光素抗體的膠乳微球溶液混合，在25攝氏度持續(xù)、輕微混合1小時，并加入穩(wěn)定劑即得；
所述校準(zhǔn)試劑的制備方法包括以下步驟：使用稀釋液將涎液化糖鏈抗原稀釋到所需濃度即得。
抗體膠乳試劑的制備步驟S1、S3中采用的是低溫多次透析方法，可以充分保證抗人涎液化糖鏈抗原抗體的生物活性。
進一步的，所述抗體膠乳試劑的制備步驟S2中的熒光素為活化熒光素，用超純水溶解后直接進行標(biāo)記反應(yīng)。
進一步的，所述抗體膠乳試劑的制備步驟S4中穩(wěn)定劑為環(huán)糊精、酪蛋白、抗壞血酸中的一種或多種。
進一步的，所述抗體膠乳試劑的制備步驟S4中的膠乳微球為單一的粒徑，或由不同粒徑大小的膠乳微球混合而成。通過不同粒徑的膠乳微球組合，可以使該涎液化糖鏈抗原測定試劑的性能達到更高靈敏度以及更寬線性范圍。
本發(fā)明進行樣本中涎液化糖鏈抗原含量測定的原理是：利用抗原抗體反應(yīng)，先加入預(yù)處理試劑，使樣本中的涎液化糖鏈抗原的抗原位點暴露，當(dāng)加入結(jié)合有抗人涎液化糖鏈抗原抗體的膠乳微球試劑即抗體膠乳試劑，使反應(yīng)液中的抗原抗體交聯(lián)反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，使膠乳微球凝集，從而產(chǎn)生一定的濁度，樣本中涎液化糖鏈抗原的含量在一定范圍內(nèi)與產(chǎn)生的濁度成正相關(guān)，再通過校準(zhǔn)曲線進行計算，從而得到涎液化糖鏈抗原的含量。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下特點：
1)本發(fā)明的涎液化糖鏈抗原測定試劑具有高的檢測靈敏度，最低檢測能夠達到70.0U/ml，操作簡便，快速，從檢測到出結(jié)果最多只需要10分鐘，甚至更短。
2)抗體膠乳試劑中的結(jié)合抗體的膠乳微球的制備通過FITC(熒光素)-抗FITC抗體橋架使抗體連接膠乳微球，這樣有利于保證抗人涎液化糖鏈抗原抗體活性，對抗體功效無傷害，工藝簡化，產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好，批間差異小，在2-8攝氏度至少可以保存一年。
3)本發(fā)明的涎液化糖鏈抗原測定試劑對樣品中涎液化糖鏈抗原含量檢測的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計分析，與科研的酶免法無顯著性差異，檢測結(jié)果可靠，臨床評價良好，可用于臨床應(yīng)用。
以下結(jié)合一實施例對本發(fā)明進行說明
實施例一
一、制備抗體膠乳試劑
將10mg抗人涎液化糖鏈抗原抗體在PH9.0的0.05mol/L，1L碳酸氫鈉緩沖溶液中，于2-8攝氏度進行3次透析，每次1小時，除去防腐劑等干擾標(biāo)記反應(yīng)的雜質(zhì)。
將透析后的抗體溶液用pH9.0的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋到1mg/ml，用1ml超純水溶解1mg活化熒光素FITC，加入到抗體溶液中，在25攝氏度持續(xù)、輕微混合1小時進行標(biāo)記反應(yīng)。
將熒光素化抗人涎液化糖鏈抗原抗體溶液在pH7.5，0.05mol/L，5L磷酸鹽緩沖液中于2-8攝氏度進行3次透析，除去未反應(yīng)的熒光素。
將透析后的熒光素化抗體用pH7.5，0.01mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋到0.2mg/ml與等體積的0.1％的結(jié)合有抗FITC抗體膠乳微球溶液混合，在25攝氏度持續(xù)、輕微混合1小時后，加入0.1g環(huán)糊精，0.1g酪蛋白，1g抗壞血酸溶解并混合均勻即得抗體膠乳試劑。
二、制備預(yù)處理試劑
配制0.01mol/L，pH7.4，含聚乙二醇10000 20g/L，氯化鈉9g/L，proclin3000.1％的磷酸鹽緩沖液即得。
三、制備校準(zhǔn)試劑
配制0.05mol/L，pH7.4，含環(huán)糊精1g/L，酪蛋白1g/L，抗壞血酸10g/L，氯化鈉8g/L，proclin300 0.1％的磷酸鹽緩沖液即得稀釋液。
按照需要的涎液化糖鏈抗原參考校準(zhǔn)試劑濃度將純化過的重組涎液化糖鏈抗原用稀釋液稀釋到所需濃度即得。
以下對涎液化糖鏈抗原測定試劑的測定方法進行說明
校準(zhǔn)試劑濃度：10000U/ml、5000U/ml、2500U/ml、1250U/ml、625U/ml、0U/ml；
測定波長：570nm；
預(yù)處理試劑：抗體膠乳試劑：樣本＝150μl∶50μl∶3μl；
校準(zhǔn)方式：spline。
檢測過程：預(yù)處理試劑與樣本加入，反應(yīng)5分鐘，然后加入抗體膠乳試劑后20秒，讀取反應(yīng)液吸光度A1，加入抗體膠乳試劑后5分鐘，再讀取反應(yīng)液吸光度A2，計算吸光度的變化ΔA＝A2-A1。
用校準(zhǔn)試劑濃度做橫軸，ΔA做縱軸，建立校準(zhǔn)曲線。未知樣本的濃度通過其反應(yīng)的ΔA從校準(zhǔn)曲線計算得到。
以下對本發(fā)明涎液化糖鏈抗原測定試劑的性能指標(biāo)進行說明
1.空白檢測限測定
用涎液化糖鏈抗原測定試劑對空白樣本(校準(zhǔn)試劑稀釋液)重復(fù)測定20次，空白檢測限濃度為均值濃度加上二個標(biāo)準(zhǔn)差，得到空白檢測限濃度要求≤10U/ml。
2.線性范圍70-10000U/ml。
3.與酶聯(lián)免疫方法的試劑盒測定結(jié)果的相關(guān)性。
通過測定100例標(biāo)本(樣本濃度在70-10000U/ml范圍內(nèi)均勻分布)本試劑制備的試劑盒與酶聯(lián)免疫方法的試劑盒的相關(guān)系數(shù)R2＝0.977，相關(guān)方程為：Y＝0.973X-17.26。
其中，X為本試劑的檢測值，Y為酶免方法檢測值。
4.精密度
同一試劑檢測同一樣本10次，用10次測值的標(biāo)準(zhǔn)差除以平均值即重復(fù)性變異系數(shù)，≤5％。
最后應(yīng)說明的是：以上實施方式僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施方式對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施方式所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施方式技術(shù)方案的精神和范圍。