本發(fā)明屬于殺菌劑檢測技術領域，尤其涉及一種檢測三氯生和甲基三氯生的微萃取方法。

背景技術：

目前，2，4，4'-三氯-2'-羥基二苯醚(三氯生，TCS)是一種廣譜性殺菌劑，可廣泛應用于個人護理產(chǎn)品及家居清潔劑中如牙膏、洗發(fā)水、洗手液等。由于過度的濫用，TCS已經(jīng)成為一種在很多基質中無處不在的污染物，這些基質包括水樣、生物體液和各類食品。大量研究表明：TCS在光照條件下能轉化成2，8-二氯二苯并-對-二惡英(2，8-DCDD)，這種化合物被世界上公認為的毒性致癌物質。甲基三氯生(MTCS)是TCS的甲基化產(chǎn)物，與TCS相比，它的log^Kow值為5.4，而TCS的log^Kow值為4.8，因此MTCS具有更高的親脂性致使它能更容易、也更持久的在生物體內積累。TCS與MTCS均屬于內分泌干擾物，在魚類、藻類和人體中都能檢測到它們的存在，并且同時對TCS和MTCS進行檢測能夠更真實的反應TCS的污染情況。目前有關TCS與MTCS對人類健康存在的潛在威脅已經(jīng)引起了環(huán)境科學界的廣泛關注。

目前為止，已經(jīng)有幾種樣品預處理方法被應用于檢測樣品中的TCS和MTCS，這些方法包括固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、中空纖維結合液相微萃取(HF-LPME)、攪拌棒萃取(SBSE)、液液萃取(LLE)、分散液微萃取(DLLME)。除DLLME外，其它樣品預處理方法具有顯著的缺點如耗時、高成本、不環(huán)保等。盡管DLLME與其他方法相比有很多顯著的優(yōu)點，如在實驗過程中需要的萃取劑和分散劑量在微升級，萃取時間短等。但是它的最主要缺點是使用對環(huán)境和人體有害的有機溶劑作為萃取劑和分散劑。因此，更加環(huán)保的基于離子液體的分散微萃取技術越來越受人們關注和歡迎。

綜上所述，現(xiàn)有的樣品預處理方法存在耗時長、成本高、不環(huán)保。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測三氯生TCS和甲基三氯生MTCS的微萃取方法，旨在解決現(xiàn)有的樣品預處理方法存在耗時長、成本高、不環(huán)保的問題。

本發(fā)明所述離子液體為[C₄MIM][NPA]；

所述離子液體合成包括：N-甲基咪唑于單口燒瓶中和1-氯代甲烷；1-氯代甲烷為N-甲基咪唑摩爾量的1.1～1.5倍。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述離子液體的制備方法，所述離子液體的制備方法包括以下步驟：

(1)稱取N-甲基咪唑于單口燒瓶中，再稱取1-氯代甲烷，滴加入單口燒瓶中，滴加完畢后，于80℃下回流反應24h，反應完全后，冷卻體系中液體，蒸去多余的1-氯代甲烷，得淡黃色固體；

(2)稱取NaOH于燒杯中，用水溶解，再稱取1-萘甲酸于單口燒瓶中，將溶解完全的NaOH加入體系中，于80℃反應24h，反應得黃色的溶液，反應完畢后，蒸去部分水，剩余溶液作下步反應用。

(3)稱取淡黃色固體，加入到黃色溶液中，60℃下反應24h，反應完畢后，減壓蒸餾去體系中的水，加入無水乙醇，有NaCl析出，放入冰箱冷凍3h，抽濾掉體系中NaCl固體，懸蒸干溶劑即得產(chǎn)品[C₄MIM][NPA]。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述離子液體檢測三氯生TCS和甲基三氯生MTCS的微萃取方法，所述方法包括以下步驟：

(1)將處理好的樣品1mL加入到15mL的離心管中，用水稀釋至5mL，加入20-120μL咪唑六氟磷酸鹽類離子液體[C_nMIM][PF₆](n＝4-8)、45-135μL咪唑四氟硼酸鹽類離子液體[C_nMIM][BF₄](n＝2-4)和45-135μL 1-丁基-3-甲基-咪唑萘甲酸類離子液體[C₄MIM][NPA]的混合物加入到離心管中，振蕩后形成牛奶狀均勻液體，隨后超聲0-10min，并加入0-0.17g的NH₄PF₆鹽，渦旋后放入冰浴中冷卻1-11min；

(2)將離心管放入離心機中以3000rpm離心0-10min，實現(xiàn)相分離后去除上層的水相，然后用移液槍取出下層的沉淀相放入1mL的離心管中，用流動相稀釋后再用濾膜過濾后，進高效液相色譜-二極管陣列檢測器對目標物進行分析。

進一步，所述高效液相色譜-二極管陣列檢測器分析條件是：流動相為乙腈A、甲醇B和超純水C以1.5mL/min流速進行二元梯度洗脫；梯度洗脫程序如下：0min,75％A；3min,65％A；5min,50％A；7min 80％A and 8-14min 70％A；總運行時間為8min，進樣量為20μL，檢測波長為280nm，柱溫30℃。

進一步，所述分散劑[C₄MIM][BF₄]+[C₄MIM][NPA]總體積為150μL，二者的體積比為4:1。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述離子液體檢測血樣中TCS和MTCS的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述離子液體檢測尿樣中TCS和MTCS的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述離子液體檢測牛奶中TCS和MTCS的方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述離子液體檢測雞蛋中TCS和MTCS的方法。

本發(fā)明提供的檢測三氯生TCS和甲基三氯生MTCS的微萃取方法，前處理技術與常規(guī)的分散液液微萃取技術相比，將1-萘甲酸引入咪唑環(huán)中合成了一種新型的離子液體1-丁基-3-甲基咪唑萘甲酸鹽([C₄MIM][NPA])。在微萃取過程中，將新型的離子液體與1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C₄MIM][BF₄])按一定比例混合作為一種混合型分散劑，新型離子的應用具有：提高了TCS和MTCS的回收率10-20％；新型的萘甲酸鹽離子液體具強酸性，故其自身可以做為pH調節(jié)劑，避免了微萃取程序中的pH調節(jié)步驟，使微萃取技術更加操作簡單化；是一種簡單、快速以及環(huán)境友好型的檢測方法。

本發(fā)明可用于人體體液(如血樣、尿樣)和食品中的TCS和MTCS分析；在該發(fā)明中我們合成了離子液體(1-丁基-3-甲基-咪唑萘甲酸鹽，[C₄MIM][NPA])并將其應用于在“全離子液體微萃取”中。該離子液體的合成條件成熟，重復性好；新的離子液體與常規(guī)離子液體混合使用作為分散劑，可提高TCS和MTCS的回收率達10-20％；此外，其強酸性功能可作為pH調節(jié)劑使用，避免了微萃取程序中的pH調節(jié)步驟，使微萃取技術更加操作簡單化；是一種簡單、快速以及環(huán)境友好型的前處理方法，可用于人體體液(如血樣、尿樣)和食品中的TCS和MTCS分析，屬于“綠色分析化學”研究領域。

本發(fā)明所使用的新型萘甲酸鹽離子液體具有相對低的水溶性，促進了萃取劑的非極性環(huán)境，進而增加了沉淀相的體積，因此提高了TCS和MTCS的回收率達10-20％；前處理技術由于新型的萘甲酸鹽離子液體本身具有強酸性，所以其自身可以做為pH調節(jié)劑，因此避免了微萃取程序中的pH調節(jié)步驟；在因子優(yōu)化條件下，在血漿、尿樣、雞蛋和牛奶等基質中的TCS和MTCS回收率可達98.6-106.1％；最低檢出限低至0.12-0.66μg/L?；诖?，本發(fā)明具有檢測限低、萃取率高、操作時間短、沒有使用任何有機溶劑等優(yōu)點。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的檢測三氯生TCS和甲基三氯生MTCS的微萃取方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實施例提供的[C₄MIM][NPA]的核磁譜示意圖。

圖3是本發(fā)明實施例提供的“全離子液體微萃取”操作程序示意圖。

圖4是本發(fā)明實施例提供的血樣和尿樣中的TCS和MTCS色譜峰示意圖。

圖5是本發(fā)明實施例提供的牛奶和雞蛋中的TCS和MTCS色譜峰。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的檢測TCS和MTCS的方法包括以下步驟：

S101：首先將處理好的實際樣品1mL加入到15mL的離心管中，用水稀釋至5mL，加入20-120μL咪唑六氟磷酸鹽類離子液體[C_nMIM][PF₆](n＝4-8)、45-135μL咪唑四氟硼酸鹽類離子液體[C_nMIM][BF₄](n＝2-4)和45-135μL 1-丁基-3-甲基咪唑萘甲酸鹽類離子液體[C₄MIM][NPA]的混合物迅速加入到離心管中，振蕩后形成牛奶狀均勻液體，隨后超聲0-10min，并加入0-0.17g的NH₄PF₆鹽，渦旋后放入冰浴中冷卻1-11min；

S102：將離心管放入離心機中以3000rpm離心0-10min，實現(xiàn)相分離后去除上層的水相；

S103：用移液槍取出下層的沉淀相放入5mL的離心管中，用流動相稀釋后過濾膜(0.22_um)，高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-DAD)對目標物進行分析。

本發(fā)明實施例提供的檢測三氯生TCS和甲基三氯生MTCS的微萃取方法具體包括以下步驟：

本發(fā)明的全離子液體分散微萃取技術來檢測人體液及各種食品中的TCS和MTCS含量，依次包括如下步驟：

第一步：萘甲酸鹽離子液體的制備：

以N-甲基咪唑和1-氯代正丁烷為原料，40℃反應，反應完成后引入萘甲酸鈉，最終形成目標產(chǎn)物。反應共需三步，總產(chǎn)率約為62.64％。

合成化學方程式如方程式如下：

第二步：首先將處理好的實際樣品1mL加入到15mL的離心管中，用水稀釋至5mL，加入20-120μL咪唑六氟磷酸鹽類離子液體[C_nMIM][PF₆](n＝4-8)、45-135μL咪唑四氟硼酸鹽類離子液體[C_nMIM][BF₄](n＝2-4)和45-135μL 1-丁基-3-甲基-咪唑萘甲酸類離子液體[C₄MIM][NPA]的混合物迅速加入到離心管中，振蕩后形成牛奶狀均勻液體，隨后超聲0-10min，并加入0-0.17g的NH₄PF₆鹽，渦旋后放入冰浴中冷卻1-11min，最后將離心管放入離心機中以3000rpm離心0-10min，實現(xiàn)相分離后去除上層的水相，然后用移液槍取出下層的沉淀相放入5mL的離心管中，用流動相稀釋后過濾膜(0.22um)，HPLC-DAD對目標物進行分析，梯度洗脫，進樣量為20μL，檢測波長為280nm，柱溫30℃。

下面結合具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步的描述。

實施例1：[C₄MIM][NPA]的合成

步驟1：稱取N-甲基咪唑4g(48.7mmol)于單口燒瓶中，再稱取1-氯代甲烷6.68g(72.2mmol)(約為N-甲基咪唑摩爾量的1.1～1.5倍)，緩慢滴加入單口燒瓶中，滴加完畢后，于80℃下回流反應24h，薄層色譜法監(jiān)測反應，反應完全后，冷卻體系中液體，蒸去多余的1-氯代甲烷，得白色固體，產(chǎn)率為90％。步驟2：稱取1.8g NaOH(45mmol)于燒杯中(NaOH稍過量)，用極少量水溶解，再稱取1-萘甲酸7.53g(43.8mmol)于單口燒瓶中，將溶解完全的NaOH加入體系中，于80℃反應24h，反應得黃色的溶液，點板監(jiān)測，反應完畢后，蒸去部分水，剩余溶液作下步反應用。步驟3：稱取步驟1中固體7.67g(43.8mmol)，加入到步驟2得到的黃色溶液中，60℃下反應24h，高效液相色譜法監(jiān)測反應，反應完畢后，減壓蒸餾去體系中的水，加入無水乙醇，有N_aCl析出，放入冰箱冷凍3h，抽濾掉體系中NaCl固體，懸蒸干溶劑即得產(chǎn)品，產(chǎn)品為棕色結晶，產(chǎn)率為62％。[C₄MIM][NPA]的¹H NMR表征如下圖2。

實施例2：血樣中TCS和MTCS的檢測

血液前處理：在10mL離心管中加入1mL健康自愿者血清，然后加入4mL乙腈振蕩2min，之后放在85℃的水浴鍋中加熱15min，冷卻后以5000rpm轉速離心15min，離心后取上清液過濾(0.45μm濾膜)，再以10000rpm轉速離心5min，取上層清液為實際樣品。后續(xù)的“全離子液體微萃取”操作程序見下圖3。

HPLC檢測條件：流動相為乙腈(A)、甲醇(B)和超純水(C)以1.5mL/min流速進行二元梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0min,75％乙腈；3min,65％乙腈；5min,50％乙腈；7min，80％乙腈和8-14min，70％乙腈，總運行時間為8min。進樣量為20μL，檢測波長為280nm柱溫30℃。進樣量20μL。血樣中TCS和MTCS檢測色譜峰見圖4。

實施例3：尿樣中的TCS和MTCS檢測

尿液前處理：在10mL離心管中加入3mL健康自愿者尿液，然后以4000rpm離心10min，再取上清液過濾(0.22μm濾膜)，取上層清液為處理好的實際樣品。

HPLC檢測條件：流動相為乙腈(A)、甲醇(B)和超純水(C)以1.5mL/min流速進行二元梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0min,75％乙腈；3min,65％乙腈；5min,50％乙腈；7min 80％乙腈和8-14min 70％乙腈.總運行時間為8min。進樣量為20μL，檢測波長為280nm，柱溫30℃，進樣量20μL。尿樣中TCS和MTCS檢測色譜峰見圖4。

實施例4：雞蛋中的TCS和MTCS檢測

雞蛋前處理：將買來的雞蛋取出1mL(約1g)蛋清，加入2mL的超純水，0.5mL的20％的冰醋酸，4mL的乙腈，然后放到離心管里，通過渦旋儀振蕩5min后放到80℃的水浴鍋上蒸發(fā)至混合液體積約3mL，然后通過4800rpm的低速，取上清液1mL加入到10mL的離心管中，用水稀釋至5mL。接下來的步驟和DLLME相似。用渦旋儀振蕩后加入30-110μL的萃取劑，40-120μL的分散劑，振蕩超聲3-11min后，加入0-0.2g鹽，超聲3min后，冷卻20min，然后在3000rpm離心8min，去除上層的水相后用移液槍取出下層的有機相，加入60μL甲醇，HPLC-DAD檢測。

HPLC檢測條件：流動相為乙腈(A)和超純水(B)以1.5mL min^-1流速進行二元梯度洗脫。洗脫用75％(A)和25％(B)，總運行時間為11min。進樣量20μL，檢測波長280nm,柱溫30℃。雞蛋中的TCS和MTCS色譜峰見圖5。

實施例5：牛奶中的TCS和MTCS檢測

牛奶前處理：準確量取牛奶1.00mL，將其加入200μL 20％乙酸和2.80mL的超純水中，震蕩1min，再于4℃下保存15min，然后在3000rpm離心15min，取出上清液過0.22μm的濾膜，加入5mL的正己烷，渦旋1min，在4500rpm離心10min，去除正己烷層，過0.22μm的濾膜，得牛奶上清液。取1mL的上清液加入4mL乙腈，震蕩2min，在95℃條件下加熱15min，蒸發(fā)至2mL，利用離心機在5000rpm條件下離心15min，最后取上清液用0.45μm的濾膜過濾保存，其過濾液供HPLC分析。

HPLC檢測條件：流動相為乙腈(A)超純水(B)以1.5mL/min流速進行二元梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0min,75％乙腈；3min,65％乙腈；5min,50％乙腈；7min 80％乙腈和8-14min 70％乙腈，總運行時間為8min，進樣量為20μL，檢測波長為280nm，柱溫30℃，進樣量20μL。牛奶中的TCS和MTCS色譜峰見圖5。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。