本發(fā)明涉及檢測方法，特別是一種利用高分辨質(zhì)譜儀檢測血漿中痕量醛固酮的方法。
背景技術(shù)：
：醛固酮(Aldosterone)是由腎上腺皮質(zhì)球狀帶細(xì)胞合成和分泌的一種類固醇類激素，屬于鹽皮質(zhì)激素家族。它有三個(gè)主要功能：1)和遠(yuǎn)端小管和集尿管的主細(xì)胞內(nèi)的鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合，增加管腔膜對鉀離子和鈉離子的滲透性，同時(shí)激活基底側(cè)的Na+/K+泵，增加對鈉離子和水的重吸收，同時(shí)排出更多的鉀離子到尿液中。2)刺激集尿管對氫離子的分泌，調(diào)控血漿中碳酸氫根的濃度，保持酸堿平衡。3)通過垂體后葉作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，刺激抗利尿激素(ADH)的釋放，通過直接增加腎小管對水分的重吸收起到保水的作用。醛固酮是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的一部分，對維持血壓穩(wěn)定起著重要作用。醛固酮的分泌也是通過RAAS調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)血壓降低時(shí)，腎小球旁細(xì)胞分泌腎素，腎素促進(jìn)血管緊張素原轉(zhuǎn)變成血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ經(jīng)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ促進(jìn)血管收縮升高血壓。同時(shí)血管緊張素Ⅱ作用于腎上腺皮質(zhì)增加醛固酮的分泌，進(jìn)而升高血壓。繼發(fā)性高血壓檢驗(yàn)項(xiàng)目的臨床應(yīng)用是臨床醫(yī)生評估受檢者高血壓病因診斷、治療、預(yù)后判斷的重要依據(jù)。繼發(fā)性高血壓常與腎素-血管緊張素II-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)中的腎素(Renin)、醛固酮(Aldosterone)、血管緊張素II(AngiotensinII)，和下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)(HPA)中的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、皮質(zhì)醇(Cortisol)的異常有關(guān)。如原發(fā)性醛固酮增多癥和庫欣氏綜合征。原發(fā)性醛固酮增多癥(primaryaldosteronism，PA)是臨床上最常見的內(nèi)分泌性高血壓原因,其致病機(jī)制主要為由于腎上腺皮質(zhì)腫瘤或增生、分泌過量的醛固酮,從而導(dǎo)致水鈉儲留、血容量增加、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem)活性受抑制,臨床表現(xiàn)主要為高血壓、低血鉀。近年的研究發(fā)現(xiàn),過多醛固酮可以通過多個(gè)途徑導(dǎo)致心肌肥厚、心力衰竭和腎功能受損、甚至胰島素抵抗,是心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在過去多數(shù)學(xué)者認(rèn)為原發(fā)性醛固酮增多癥在高血壓患者中所占比率不到1％，目前研究資料顯示原發(fā)性醛固酮增多癥在高血壓患者中所占比率要超過10％。對血漿中醛固酮的定量檢測，可以輔助診斷原發(fā)性、繼發(fā)性醛固酮增多癥、腎上腺腫瘤等疾病，幫助尋找高血壓和低血鉀的病因。近年來，隨著高血壓發(fā)病率的提高，臨床檢驗(yàn)越來越重視對腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的各項(xiàng)檢測。針對醛固酮的定量檢測，市場上出現(xiàn)以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法等檢測試劑盒。其中，RIA法有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)試劑的半衰期、費(fèi)用高及廢物處理等問題也在一定程度上限制了它的應(yīng)用。酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法因檢測快速簡便而在臨床上應(yīng)用廣泛。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)是近年來發(fā)展較快的化學(xué)分析方法，這些方法可以克服類似物交叉反應(yīng)等問題。因這些方法需要對生物樣品進(jìn)行前處理，所消耗時(shí)間及花費(fèi)使其在臨床檢測的應(yīng)用上受到一定的限制。醛固酮在人血漿中的濃度較低，為皮克每毫升級別，且其物質(zhì)結(jié)構(gòu)本身不易被質(zhì)子化，使之在GC-MS和LC-MS/MS上的準(zhǔn)確定量檢測成為一個(gè)難題。特別是GC-MS檢測法，需對樣品需要做衍生化等處理，而LC-MS檢測法則無需復(fù)雜的衍生步驟。隨著液質(zhì)儀器的在靈敏度等方面的提高，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對醛固酮的檢測在2005年以后得到較多的關(guān)注與研究。有多篇外文文獻(xiàn)報(bào)道液質(zhì)方法檢測人血漿或血清樣本中醛固酮，2008年Yamashita等利用安捷倫1100HPLC系統(tǒng)串聯(lián)ABSciexAPI3000三重四級桿質(zhì)譜(PESciex)建立了一個(gè)高靈敏度的醛固酮定量方法，實(shí)現(xiàn)了對醛固酮的準(zhǔn)確測定。Taylor等在2009年開發(fā)并驗(yàn)證了一個(gè)在線半自動化的醛固酮液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的測定方法。2014年Das等利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測醛固酮，并做了兩種抗壓藥物的研究。2015年Meunier等也開發(fā)并驗(yàn)證了醛固酮的HPLC-MS/MS測定方法，該測定方法的批內(nèi)批間精密性＜10％，線性范圍為1.44×10-5μg/mL-1.175×10-3μg/mL。賽默飛公司的QE質(zhì)譜儀是新興的一種高分辨質(zhì)譜儀。QE結(jié)合高選擇性四極桿離子過濾與Orbitrap高分辨準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)(HR/AM)測量技術(shù)，在分辨率、掃描速度和靈敏度上進(jìn)一步提升，可進(jìn)行高通量的目標(biāo)物或非目標(biāo)物篩選，實(shí)現(xiàn)高可靠性的確證定量分析。但至今未見有利用賽默飛QE質(zhì)譜儀檢測人血漿樣本中的醛固酮方法的公開報(bào)導(dǎo)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種利用高分辨質(zhì)譜儀檢測血漿中痕量醛固酮的方法，可有效解決利用質(zhì)譜儀檢測血漿中痕量醛固酮的問題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，本發(fā)明方法包括以下步驟：(1)、配制標(biāo)準(zhǔn)品工作液和內(nèi)標(biāo)物工作液：將醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解，制成梯度質(zhì)量濃度為2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品工作液；取內(nèi)標(biāo)物Aldosterone-D7用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度2×10-5μg/mL的內(nèi)標(biāo)物工作液；(2)、血漿樣本(即待測血漿)處理：取血漿樣本加入內(nèi)標(biāo)物工作液混勻，后加入蛋白沉淀劑，渦旋，離心，上清液過活化的HLB固相萃取柱，待上清液全部流出，用水淋洗兩次，抽干，再用甲醇洗脫，收集洗脫液，吹干，得抽提物，抽提物用甲醇水溶液復(fù)溶，過濾，濾液用液相色譜-質(zhì)譜儀檢測；所述的蛋白沉淀劑是：0.5mol/L乙酸鋅溶液和甲醇以體積比計(jì)1︰5混合在一起制成；(3)、設(shè)定液相色譜-質(zhì)譜儀的檢測條件：檢測用的液相色譜-質(zhì)譜儀為賽默飛QE質(zhì)譜儀(賽默飛公司生產(chǎn)的QE質(zhì)譜儀)，液相色譜條件為：色譜條件：色譜柱：HypersilGOLDC18色譜柱；柱溫：30℃；流動相A為甲醇，流動相B為乙酸銨水溶液；進(jìn)行梯度洗脫，流速：0.3mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；質(zhì)譜條件離子模式：ESI-；蒸發(fā)溫度：350℃；噴霧電壓：2500V；鞘氣：45psi；輔助氣：15psi；質(zhì)量掃描范圍：133.4～2000m/z；檢測模式：全掃描自動觸發(fā)二級掃描(FullMS-MS2)；一級掃描分辨率：70000，二級分辨率：17500；Aldosterone定性離子對：359.19>331.19，碰撞電壓：25.00eV定量離子對：359.19>189.10，碰撞電壓：25.00eVAldosterone-D7定性離子對：366.23>194.12，碰撞電壓：25.00eV定量離子對：366.23>338.23，碰撞電壓：25.00eV(4)、檢測血漿中痕量醛固酮：根據(jù)醛固酮在液相色譜-質(zhì)譜儀檢測條件下的響應(yīng)量，以醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品工作液的6個(gè)濃度作為工作點(diǎn)，每一濃度點(diǎn)中的內(nèi)標(biāo)物含量均為1.6×10-6μg/mL；將血漿樣本用賽默飛QE質(zhì)譜儀測出的結(jié)果與已知濃度的6個(gè)工作點(diǎn)的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品工作液的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，即可得出未知樣本中的醛固酮濃度，實(shí)現(xiàn)血漿中痕量醛固酮的檢測。本發(fā)明方法簡單，易操作，檢測準(zhǔn)確，效果好，可有效解決血漿中痕量醛固酮的檢測，為免疫檢測篩選合適原材料(抗原、抗體)、提高檢測特異性等提供技術(shù)支持，也為臨床診斷和醫(yī)藥研究提供科學(xué)依據(jù)，具有很強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，經(jīng)濟(jì)和社會效益顯著。附圖說明圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。圖2本發(fā)明血漿樣本中醛固酮的抽提與純化工藝流程圖。圖3標(biāo)準(zhǔn)品和血漿樣本檢測圖譜。圖4、圖5為醛固酮兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.999，線性回歸方程圖。圖6本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品在儀器中的定量限圖。圖7為10種類似物在醛固酮檢測方法下的離子圖。圖8為10種類似物和醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品共同檢測的離子圖。圖9為氫化潑尼松和醛固酮離子圖。圖10為氫化潑尼松離子圖。圖11為可的松和醛固酮的離子圖。圖12為可的松離子圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和具體情況對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。本發(fā)明在具體實(shí)施中，包括以下步驟：(1)、配制標(biāo)準(zhǔn)品工作液和內(nèi)標(biāo)物工作液：將凍存的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，恢復(fù)至室溫，用色譜級甲醇溶解成質(zhì)量濃度為100μg/mL的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品母液，再用色譜級甲醇進(jìn)行梯度稀釋至2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，成醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品工作液；取內(nèi)標(biāo)物Aldosterone-D75.0mg，用色譜級甲醇溶解成質(zhì)量濃度為500μg/mL作為內(nèi)標(biāo)物母液，再用色譜級甲醇稀釋至2×10-5μg/mL，成內(nèi)標(biāo)物工作液；(2)、血漿樣本處理：取1mL血漿樣本置于10mL的離心管里，加入2×10-5μg/mL的內(nèi)標(biāo)物工作液40μl，放振蕩器中振蕩1小時(shí)充分混勻，后加入2mL的蛋白沉淀劑，渦旋1min，5000r/min離心10min，上清液過HLB固相萃取柱；HLB固相萃取柱使用前依次用3mL甲醇、3mL水活化，將上述離心后的上清液轉(zhuǎn)移至HLB固相萃取柱中，待上清液全部流出后用3mL水淋洗兩次，使柱體保持抽干5min，3mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃，氮?dú)獯蹈?，得抽提物，抽提物用質(zhì)量濃度30％甲醇水溶液0.5mL復(fù)溶，過0.22μm濾膜后，濾液用液相色譜-質(zhì)譜儀檢測；(3)、設(shè)定液相色譜-質(zhì)譜儀的檢測條件：檢測用的液相色譜-質(zhì)譜儀為賽默飛QE質(zhì)譜儀(賽默飛公司生產(chǎn)的QE質(zhì)譜儀)，液相色譜條件為：色譜條件：色譜柱：HypersilGOLDC18色譜柱，50×2.1mm，1.9μm；柱溫：30℃；流動相A為甲醇，流動相B為0.1mmol/L乙酸銨水溶液；色譜梯度為：0min，30％A相和70％B相；2.5min，30％A相和70％B相；4min，80％A相和20％B相；4.1min，80％A相和20％B相；8min，30％A相和70％B相，流速：0.3mL/min；進(jìn)樣體積：20μL；質(zhì)譜條件離子模式：ESI-；蒸發(fā)溫度：350℃；噴霧電壓：2500V；鞘氣：45psi；輔助氣：15psi；質(zhì)量掃描范圍：133.4～2000m/z；檢測模式：全掃描自動觸發(fā)二級掃描(FullMS-MS2)；一級掃描分辨率：70000，二級分辨率：17500；Aldosterone定性離子對：359.19>331.19，碰撞電壓：25.00eV定量離子對：359.19>189.10，碰撞電壓：25.00eVAldosterone-D7定性離子對：366.23>194.12，碰撞電壓：25.00eV定量離子對：366.23>338.23，碰撞電壓：25.00eV(4)、檢測血漿中痕量醛固酮：根據(jù)醛固酮在液相色譜-質(zhì)譜儀檢測條件下的響應(yīng)量，以醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品工作液的6個(gè)濃度作為工作點(diǎn)，這些工作點(diǎn)覆蓋檢測濃度的范圍在低值區(qū)域的點(diǎn)更多，6個(gè)工作點(diǎn)的濃度為：2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，其每一濃度點(diǎn)中的內(nèi)標(biāo)物含量均為1.6×10-6μg/mL；將血漿樣本用賽默飛QE質(zhì)譜儀測出的結(jié)果與已知濃度的6個(gè)工作點(diǎn)的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品工作液的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，即可得出未知樣本中的醛固酮濃度，實(shí)現(xiàn)血漿中痕量醛固酮的檢測。本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)和實(shí)地應(yīng)用，具有操作方便，實(shí)用性強(qiáng)，準(zhǔn)確、穩(wěn)定可靠，可有效用于對血漿中醛固酮痕量的檢測，開拓了血漿中醛固酮痕量檢測的新途徑，為免疫檢測篩選合適原材料(抗原、抗體)、提高檢測特異性等提供技術(shù)支持，也為臨床診斷和醫(yī)藥研究提供技術(shù)支撐和科學(xué)依據(jù)，有關(guān)試驗(yàn)資料如下：1材料、試劑、儀器醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品：Sigama公司，Aldosterone，分子式：C21H28O5分子量：360.44，結(jié)構(gòu)式：內(nèi)標(biāo)物：Sigama公司，aldosterone-2,2,4,6,6,21,21-d7，分子式：C21D7H21O5分子量：367.49，結(jié)構(gòu)式：試劑：色譜級甲醇、純水(去離子水)、乙酸鋅、乙酸銨。蛋白沉淀劑：0.5mol/L乙酸鋅溶液：甲醇(V/V,1:5)；復(fù)溶液：30％甲醇-水溶液儀器：賽默飛液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀(ThermoFisher/QExactive)，24位固相萃取裝置(德國CNW公司)，OASISHLB固相萃取柱(3mL/60mg，美國Waters公司)。2.醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物工作液的配制取出凍存的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品，恢復(fù)至室溫。取一個(gè)干凈的50mL容量瓶，置十萬級電子天平上調(diào)零，用吸水紙擦干凈小藥匙，稱取醛固酮純品放置容量瓶底部，盡量避免醛固酮純品粉末沾到容量瓶上部，共稱5.0mg，色譜級甲醇溶解，甲醇定容到50mL，上下顛倒混勻。醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品母液最終濃度為100μg/mL，取一定量的保存液，稀釋至2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，將其作為醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品；稱取5.0mg的Aldosterone-D7，用色譜級甲醇溶解，容量瓶定容到50mL，上下顛倒混。Aldosterone-D7保存液最終濃度為500μg/mL。取一定量的Aldosterone-D7保存液，稀釋至2×10-5μg/mL，將其作為內(nèi)標(biāo)物工作液。3.3樣本前處理(見圖2)樣本前處理主要包括血漿蛋白沉淀和固相萃取柱抽提兩個(gè)步驟。取1mL血漿樣本置于10mL的離心管里，加入2×10-5μg/mL的內(nèi)標(biāo)40μl，放振蕩器中振蕩1小時(shí)，使內(nèi)標(biāo)與樣本中充分混勻。后加入2mL的蛋白沉淀劑，渦旋1min，5000r/min離心10分鐘，上清液待過固相萃取柱；HLB柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，將上述離心后的上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，待樣液全部流出后用3mL水淋洗兩次，使柱體保持抽干5min，3mL甲醇洗脫，洗脫步驟取干凈玻璃管收集洗脫液，40℃，氮?dú)獯蹈?。氮?dú)獯蹈傻某樘嵛镔|(zhì)用0.5mL30％甲醇-水溶液復(fù)溶，過0.22μm濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶待進(jìn)液相色譜-質(zhì)譜儀檢測。4儀器條件：4.1液相色譜條件Ultimate3000液相色譜系統(tǒng)色譜條件：色譜柱：HypersilGOLDC18色譜柱，50×2.1mm，1.9μm；柱溫：30℃；流動相A為甲醇，流動相B為0.1mmol/L乙酸銨水溶液。色譜梯度為：0min，30％A相和70％B相；2.5min，30％A相和70％B相；4min，80％A相和20％B相；4.1min，80％A相和20％B相；8min，30％A相和70％B相。流速：0.3mL/min；進(jìn)樣體積：20μL。4.2QE質(zhì)譜條件離子模式：ESI-；蒸發(fā)溫度：350℃；噴霧電壓：2500V；鞘氣：45psi；輔助氣：15psi；質(zhì)量掃描范圍：133.4～2000m/z；檢測模式：全掃描自動觸發(fā)二級掃描(FullMS-MS2)；一級掃描分辨率：70000，二級分辨率：17500。Aldosterone定性離子對：359.19>331.19，碰撞電壓：25.00eV定量離子對：359.19>189.10，碰撞電壓：25.00eVAldosterone-D7定性離子對：366.23>194.12，碰撞電壓：25.00eV定量離子對：366.23>338.23，碰撞電壓：25.00eV5標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(見圖3)根據(jù)醛固酮在儀器條件下的響應(yīng)量，標(biāo)準(zhǔn)曲線選擇了6個(gè)點(diǎn)，這6個(gè)點(diǎn)覆蓋檢測濃度范圍更廣，在低值區(qū)域的點(diǎn)更多，6個(gè)濃度點(diǎn)：2×10-3μg/mL、1×10-3μg/mL、5×10-4μg/mL、1×10-4μg/mL、5×10-5μg/mL、2×10-5μg/mL，這6個(gè)點(diǎn)由醛固酮的母液梯度稀釋而成，其每一濃度點(diǎn)中的內(nèi)標(biāo)含量為1.6×10-6μg/mL。在液相色譜條件和QE質(zhì)譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)曲線6個(gè)點(diǎn)和制備好的樣本溶液進(jìn)儀器檢測。根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣本中的醛固酮濃度。6方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)(見圖4、圖5)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.999，線性回歸方程如圖4、圖5：6.2定量限(LOQ，見圖6)血漿樣本中的醛固酮含量極低，醛固酮分子結(jié)構(gòu)在液質(zhì)上較難質(zhì)子化，且響應(yīng)值與儀器本身的靈敏度也有很大關(guān)系，定量限為響應(yīng)信號與噪音信號比為S/N＝10時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，該方法下，檢測3×10-5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，信噪比為S/N＝46，以此計(jì)算信噪比為10時(shí)的LOQ＝6.5×10-6μg/ml。6.3準(zhǔn)確度和基質(zhì)效應(yīng)(見表1)基質(zhì)效應(yīng)是指除被測量以外的樣品特性，對特定測量程序測定被測量及其測量值的影響。在該研究中，采取HLB固相萃取小柱對血漿進(jìn)行抽提、純化。HLB柱具有較好的除鹽、除雜效果，抽提后的物質(zhì)用液質(zhì)的流動相溶液進(jìn)行復(fù)溶。加標(biāo)回收率，是在定值血漿中加入不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，儀器檢測換算回收率。它可以驗(yàn)證所建方法的準(zhǔn)確性，在一定程度上可以表明檢測是否有其他物質(zhì)干擾，同時(shí)也可以作為一種簡單直接的測定基質(zhì)效應(yīng)的方法。選定一已知濃度的血漿，加入3種梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為3組，每組至少兩管，與血漿樣本做同樣的抽提、純化處理，隨后進(jìn)液質(zhì)儀器檢測，計(jì)算回收率。表1加標(biāo)回收率注：單位為μg/mL6.4精密度實(shí)驗(yàn)(見表2)以天為單位分組，設(shè)立3組，每組包含3種不同濃度的血漿，每一濃度血漿至少3管。前處理方法同血漿樣本制備。表2精密度實(shí)驗(yàn)單位：μg/mL6.5干擾實(shí)驗(yàn)(見表3、圖9-12)類固醇類激素有著相同的甾體環(huán)，其合成途徑復(fù)雜，中間代謝產(chǎn)物較多。醛固酮作為其中的一種，有較多的同分異構(gòu)體和結(jié)構(gòu)類似物，免疫檢測方面會有較多的交叉干擾反應(yīng)，影響檢測的特異性。LC-MS/MS檢測可以對待測物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，排除類似物的干擾，所以是很多種分析物檢測的決定性方法。本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)中，對醛固酮代謝物或其他類固醇的代謝物進(jìn)行分析，以確定這些物質(zhì)是否會干擾醛固酮的定量檢測。在液質(zhì)檢測中，將各代謝類似物標(biāo)準(zhǔn)品制備成混標(biāo)，具有相同分子量的物質(zhì)，結(jié)構(gòu)上的差異影響它們在色譜柱上的保留時(shí)間，通過液相色譜達(dá)到分離不同物質(zhì)的目的。對分子量不同而結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)，質(zhì)譜的多反應(yīng)選擇檢測模式可以將其與醛固酮分子區(qū)分開來。在本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)目標(biāo)物的性質(zhì)和檢測儀器的特點(diǎn)，選取了以下10種可能對目標(biāo)物產(chǎn)生干擾的物質(zhì)對所建立目標(biāo)物檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證。表310種類似物編號名稱分子式分子量1#PrednisoloneC21H28O5360.442#CortisoneC21H28O5360.443#HydrocortisoneC21H30O5362.464#DehydroisoandosteroneC19H28O2288.425#5β-PREGNAN-3α,11β,17,21-TETROL-20-ONEC21H34O5366.496#5β-PREGNAN-3α,17,20α-TRIOLC21H36O3336.517#4-PREGNAN-17,20β,21-TRTOL-3,11-DIONEC21H30O5362.58#4-PREGNEN-11β,17,20β,21-TETROL-3-ONEC21H32O5364.489#4-PREGNEN-17,20α,21-TEIOL-3,11-DIONEC21H30O5362.4610#3α-Hydroxy-5β-tetrahydroaldosteroneC21H32O5364.49從圖9和圖10可以看出，10種醛固酮干擾物中母離子為359的物質(zhì)在全掃描條件下有峰出現(xiàn)，與醛固酮有相近的保留時(shí)間，有可能影響到醛固酮的定量檢測。后續(xù)對氫化潑尼松和可的松進(jìn)行了單獨(dú)檢測，以驗(yàn)證是否對醛固酮檢測有影響。由圖11和圖12可看出，氫化潑尼松和醛固酮出峰時(shí)間不同，可以區(qū)分開來。并且，氫化潑尼松在正離子模式下離子碎片較少，對其的檢測應(yīng)選擇正離子模式。故氫化潑尼松在該檢測方法下不會對醛固酮檢測造成影響。同樣，對于分子量和醛固酮相同的可的松這種物質(zhì)，其分子量360.44，負(fù)離子模式下，離子對為359.20＞329.10，359.20＞301.10，二者在液相條件下出峰時(shí)間不一致，可以區(qū)分開來，且醛固酮的離子對為359.19＞331.19，359.19＞189.10，質(zhì)譜條件下也可區(qū)分，故可的松也不會對醛固酮的檢測有影響。并按上述實(shí)驗(yàn)方法，經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn)(12次待測血漿進(jìn)行檢測試驗(yàn))均取得了相同或相近似的結(jié)果，表明方法穩(wěn)定可靠，檢測準(zhǔn)確，具有可行性。結(jié)論OasisHLB固相萃取柱是獨(dú)特創(chuàng)新的水可浸潤性反相吸附劑，可提取復(fù)雜樣品中各種不同的酸性、堿性和中性化合物，同時(shí)去除樣品中不保留的基質(zhì)組份(如：鹽、糖、極性脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等)，具有高吸附容量、高保留能力、寬PH0-14范圍的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、環(huán)境樣品以及生物樣品中目標(biāo)化合物的樣品前處理。該檢測技術(shù)中采用OasisHLB柱對樣本中的醛固酮進(jìn)行純化與抽提，有效去除了血漿樣本中的復(fù)雜基質(zhì)組分，抽提效率高，重復(fù)性好。本發(fā)明采用賽默飛QE(ThermoFisher/QExactive，配備的液相系統(tǒng)為ThermoUltiMate3000)儀器為主要檢測工具。QExactive是以高分辨靜電場軌道阱orbitrap為核心的串聯(lián)質(zhì)譜，具有分辨率高、質(zhì)量精度高、靈敏度高、質(zhì)量軸穩(wěn)定性好、可快速正負(fù)切換掃描等優(yōu)點(diǎn)，可有效提高代謝物研究的分析通量和分析效果，尤其對于復(fù)雜基體中的痕量代謝組分的識別效率好、同時(shí)定性和定量能力強(qiáng)，適用于小分子激素、多肽、蛋白類物質(zhì)的檢測。在本發(fā)明檢測方法中，醛固酮在儀器中的響應(yīng)量遠(yuǎn)高于其他質(zhì)譜儀器，其定量限LOQ達(dá)到6.5×10-6μg/ml，可以滿足對血漿中含量極低的醛固酮準(zhǔn)確定量檢測的需求。制備的6個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從2×10-5μg/mL到2×10-3μg/mL，涵蓋了臨床檢測中高、低值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性系數(shù)R2≥0.999，這表明所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有非常好的線性相關(guān)性，為醛固酮的準(zhǔn)確定量奠定了良好的基礎(chǔ)。在連續(xù)3天的精密度實(shí)驗(yàn)中，高、中、低值樣本每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。高值樣本的不精密度為2.09％，低值樣本的不精密度小于5％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于一般臨床不精密度要求(≤15％)。在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，在固定的血漿樣本中加入了不同倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測結(jié)果表明，不同添加量的回收率在95％-105％間，這個(gè)回收率也高于臨床要求(85％-115％)。同時(shí)，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)也證明樣本抽提純化后進(jìn)儀器檢測沒有明顯基質(zhì)效應(yīng)。在干擾檢測實(shí)驗(yàn)里，所選擇的類似物與目標(biāo)物醛固酮具有相同的甾體母環(huán)，其中氫化潑尼松和內(nèi)源性的可的松與醛固酮具有相同的分子量。該檢測方法中，優(yōu)化后的液相色譜梯度流動相成功的將氫化潑尼松、可的松與醛固酮分離開，三者具有不同的出峰時(shí)間。質(zhì)譜分析儀將與醛固酮分子量不同的物質(zhì)有效區(qū)分。這10種類似物對醛固酮的定量檢測沒有干擾。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了對血漿樣本中醛固酮的準(zhǔn)確定量檢測，可為醫(yī)院臨床檢驗(yàn)開展醛固酮質(zhì)譜檢測提供一種新模式。同時(shí)，對體外診斷企業(yè)醛固酮免疫檢測試劑盒的開發(fā)與量值確認(rèn)具有重要的指導(dǎo)意義，有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會效益。當(dāng)前第1頁1 2 3