本發(fā)明涉及一種古代酒殘留物的提取方法，具體為提供一種根據(jù)快速溶劑提取法所提取的多孔陶瓷材料中的有機(jī)酸來鑒別黃酒的方法，適用于分析古代酒器殘留物以及鑒別黃酒。

背景技術(shù)：

酒與人類的生活密切相關(guān)，酒的起源、發(fā)展和貿(mào)易，反映著古代社會(huì)政治、經(jīng)濟(jì)和科技等方面的豐富信息，因此人們常將酒文化視為古代文明的重要組成部分。但是，除了有文獻(xiàn)記載證實(shí)為酒器的青銅器之外，其他盛器——尤其是新石器時(shí)代的陶器，并沒有直接證據(jù)能夠證明其確為酒器，這就給器物功能判斷、釀酒起源研究帶來了困難，對(duì)此存在不同看法。

國外的相關(guān)研究指出，陶器為多孔材料，對(duì)曾經(jīng)裝酒的陶器，往往能吸附難以揮發(fā)的酒石酸或酒石酸鹽，如從陶片中萃取出來的有機(jī)物包含酒石酸，?？赏茰y(cè)相應(yīng)陶器和釀酒或盛酒相關(guān)。2005年山西省絳縣西周倗國墓地發(fā)掘出土的兩個(gè)酒器銅盉和銅觶中，我們發(fā)現(xiàn)器物內(nèi)壁與填土的接觸面有一黑色薄層，對(duì)此用快速溶劑萃取法提取有機(jī)殘留物，進(jìn)而再利用HPLC進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)其中含有酒石酸，說明它們下葬時(shí)有可能盛有酒。GuaschJane等人用LC/MS/MS(液質(zhì)聯(lián)用)分析圖坦卡蒙墓中雙耳細(xì)頸罐(amphorae)中的酒殘留物，根據(jù)殘留物顏色以及紅葡萄酒的標(biāo)志物為酒石酸和丁香酸，發(fā)現(xiàn)墓中白葡萄酒和紅葡萄酒分開擺放，可能有特殊的目的。不難理解，隨著水、酒精的自然蒸發(fā)和揮發(fā)，殘留酒石酸有可能沉淀在內(nèi)器壁表面。墓室崩塌、陶器積土后，直接接觸內(nèi)器壁的土壤也將吸附有酒石酸。由于古代液態(tài)酒出土的幾率甚小，因此分析陶器內(nèi)土壤的有機(jī)殘留物，借以探索陶器與酒的關(guān)系，不失為理想的選擇。

但是，很少有研究具體探索出一種完整的方法，用以提取和分析古代酒體多孔陶瓷材料中的殘留物，也很少有研究致力于具體鑒別古代三大酒體(葡萄酒、黃酒、白酒)中的黃酒。這可能是由于以下原因?qū)е碌模阂?、陶瓷材料的組成和紋理不同，導(dǎo)致殘留物的吸收和殘留程度不同，同時(shí)由于考古樣品的未知性，我們難以得知是否有殘留物被吸收以及何種殘留物被吸收，這就造成標(biāo)定物的選擇有一定的難度；二、考古樣品歷經(jīng)千百年，環(huán)境的濕度、溫度以及微生物的腐蝕都會(huì)影響殘留物的分析；三、考古樣品中殘留物含量比較小，這就對(duì)殘留物的檢測(cè)有一定的精度要求。因此本提取分析方法在考古樣品的研究和古代酒的分析中都有十分廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明提出一種古代酒體多孔陶瓷材料殘留物的提取方法，整個(gè)過程簡易可行，提取條件易于調(diào)控，提取劑廉價(jià)無毒害，檢測(cè)條件不苛刻，可用于古代酒器殘留物的分析以及黃酒的鑒別。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣解決的：

一種古代酒體多孔陶瓷材料殘留物的提取方法，具體步驟如下：

(1)稱取0.01g～0.1g陶罐碎片，在室溫下風(fēng)干，用瑪瑙研缽將其研磨成粉末，加入到圓底燒瓶中；

(2)接著，將乙醇所占總體積的比例5％～20％的乙醇水溶液加入圓底燒瓶中，震蕩使浸透充分，加上冷凝管，70～80℃超聲水浴萃取，時(shí)間為30～60min；

(3)萃取結(jié)束后，冷卻至室溫，對(duì)萃取液進(jìn)行離心處理10～16min，取上清液，在4-6℃下保存；

(4)將提取液注入液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用檢測(cè)，通過液相色譜圖看出有機(jī)酸基本在t＝0.51位置出峰，而質(zhì)譜圖在t＝0.52位置也有強(qiáng)烈的信號(hào)，由此得出提取到了有機(jī)酸，同時(shí)通過質(zhì)譜中檢測(cè)m/z＝89乳酸的特征峰信號(hào)強(qiáng)烈，證明提取液中有黃酒的主要標(biāo)定物乳酸的存在；

(5)采用響應(yīng)面法按BOX設(shè)計(jì)的因素水平來對(duì)提取過程的三個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)定三因素乙醇所占總體積比例0～30％的乙醇/水溶液、溫度45℃～85℃、時(shí)間30min～90min，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)17組，重復(fù)上述步驟；

(6)對(duì)上述步驟(5)中17組實(shí)驗(yàn)所得到的提取液依次注入液相色譜，通過注入的乳酸和乙酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間判斷確實(shí)提取到了乳酸和乙酸，然后加入內(nèi)標(biāo)物蘋果酸，計(jì)算乳酸或者乙酸與蘋果酸的峰面積比值；

(7)對(duì)步驟(6)所得到的峰面積比值用design expert按二次模型進(jìn)行線性回歸分析，其方差中p值小于0.05可判斷出模型適用，得到模型方程，以簡化后的回歸方程為基礎(chǔ)，通過design expert軟件得到提取過程的最優(yōu)提取條件，即在30％的乙醇水比例，45℃下提取90min。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有顯著的特點(diǎn)與進(jìn)步：

本發(fā)明提出的提取分析古代酒體多孔陶瓷材料中的殘留物的方法完整可行，提取條件易于控制，適用于提取酒類中所含有的大部分有機(jī)酸，同時(shí)本發(fā)明探索出了最佳提取條件，鑒于考古樣品稀少珍貴，這對(duì)于考古樣品的提取來說是十分必要的。同時(shí)，本發(fā)明也致力于探索出利用液相色譜檢測(cè)有機(jī)酸的最佳條件，通過更換流動(dòng)相、調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH、檢測(cè)溫度、檢測(cè)波長、流速得到比較有利的檢測(cè)條件，這為有機(jī)酸的檢測(cè)也具有一定的指導(dǎo)意義。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施案例提供的提取液的超高效液相色譜圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施案例提供的提取液在全掃描狀態(tài)下的質(zhì)譜信號(hào)圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施案例提供的提取液在m/z為89(乳酸)的質(zhì)譜信號(hào)圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施案例提供的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的液相色譜檢測(cè)圖(依次對(duì)應(yīng)為酒石酸、草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸)；

圖5是本發(fā)明實(shí)施案例提供的提取液的液相色譜檢測(cè)圖(兩個(gè)尖銳的峰分別對(duì)應(yīng)乳酸和乙酸)；

圖6是本發(fā)明實(shí)施案例提供的溫度-組成對(duì)乳酸提取量的影響；

圖7是本發(fā)明實(shí)施案例提供的提取時(shí)間-組成對(duì)乳酸提取量的影響；

圖8是本發(fā)明實(shí)施案例提供的二次模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值分析圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施案例提供的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的超高效液相色譜圖；

圖10是本發(fā)明實(shí)施案例提供的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的超高效液相色譜圖；

圖11是本發(fā)明實(shí)施案例提供的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的超高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例進(jìn)一步描述多孔陶瓷材料中有機(jī)酸的提取和檢測(cè)方法。

而本發(fā)明中采用乳酸和乙酸作為黃酒的主要標(biāo)定物，采用的樣品均為模擬考古樣品，這些模擬樣品為粗泥或細(xì)泥捏制的杯子，未經(jīng)燒制，在不同的酒中浸泡半年以上。大致的思路為：先是根據(jù)文獻(xiàn)中提供的有機(jī)酸提取方法和條件對(duì)模擬樣品中的殘留物進(jìn)行提取，然后對(duì)提取樣品進(jìn)行定性分析，確定提取到了理想的標(biāo)定物-乳酸，以證實(shí)提取方法可靠有效。探索到有效的提取方法之后，采用響應(yīng)面法對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)模擬樣品進(jìn)行不同提取劑、溫度、時(shí)間條件下的提取，完成一系列實(shí)驗(yàn)，然后通過液相色譜進(jìn)行檢測(cè)來定性和定量，最后通過軟件Design Expert處理數(shù)據(jù)以得到提取的最佳條件。

發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

(1)稱取0.01g～0.1g陶罐碎片，在室溫下風(fēng)干，用瑪瑙研缽將其研磨成粉末，加入到圓底燒瓶中；

(2)接著，將5％～20％(乙醇所占總體積的比例)乙醇水溶液加入圓底燒瓶中，震蕩使浸透充分，加上冷凝管，70～80℃超聲水浴萃取，時(shí)間為30～60min；

(3)萃取結(jié)束后，冷卻至室溫，對(duì)萃取液進(jìn)行離心處理10～16min，取上清液，在4-6℃下保存；

(4)將提取液注入液相色譜-質(zhì)譜儀聯(lián)用檢測(cè)，通過液相色譜圖可以看出有機(jī)酸基本在t＝0.51位置出峰，而質(zhì)譜圖在t＝0.52位置也有強(qiáng)烈的信號(hào)，由此可以得出提取到了有機(jī)酸，同時(shí)通過質(zhì)譜中檢測(cè)m/z＝89(乳酸)的特征峰信號(hào)強(qiáng)烈，證明提取液中有黃酒的主要標(biāo)定物乳酸的存在；

(5)采用響應(yīng)面法按BOX設(shè)計(jì)所得的因素水平來對(duì)提取劑(0～30％乙醇/水溶液)、溫度(45℃～85℃)、時(shí)間(30min～90min)三個(gè)因素安排實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如表1所示，只改變這三個(gè)條件，其他實(shí)驗(yàn)步驟同上；

(6)對(duì)步驟(5)中得到的提取液注入液相色譜，通過注入乳酸和乙酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品可以通過保留時(shí)間判斷出確實(shí)提取到了乳酸和乙酸，然后加入內(nèi)標(biāo)物蘋果酸，計(jì)算乳酸(或者乙酸)與蘋果酸的峰面積比值，如表1所示；

(7)對(duì)步驟(6)所得到的數(shù)據(jù)用design expert按二次模型進(jìn)行線性回歸分析，通過p值小于0.05判斷出模型適用，得到模型方程，如表2所示。以簡化后的回歸方程為基礎(chǔ)，通過design expert軟件得到其建議最優(yōu)的提取條件，即在30％的乙醇水比例，45℃下提取90min。

表1響應(yīng)面法及各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下提取乳酸和乙酸量

本發(fā)明技術(shù)方案步驟(4)中對(duì)提取的樣品進(jìn)行初次定性通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，具體的檢測(cè)條件為：色譜柱溫25～40℃，整體程序運(yùn)行時(shí)間10～20min，色譜檢測(cè)波長210nm到400nm。流動(dòng)相由兩個(gè)部分組成，組分A為含有0.1％甲酸的純水溶液，組分B為乙腈。(水溶液中0.1％的甲酸是為了殺菌保存好色譜中而加入的，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)有影響。)

表2響應(yīng)面法對(duì)乳酸量二次模型的方差分析

本發(fā)明技術(shù)方案步驟(6)中對(duì)提取的樣品定性和定量通過液相色譜實(shí)現(xiàn)，具體的檢測(cè)條件為：流動(dòng)相為pH＝2.0～2.9的KH2PO4-磷酸緩沖液，流速為0.5～1mL/min，色譜柱溫25～40℃，色譜檢測(cè)波長210～219nm。

本發(fā)明技術(shù)方案中對(duì)提取條件的優(yōu)化以及最終數(shù)據(jù)的處理采用design expert軟件進(jìn)行。

本發(fā)明提出的方法的關(guān)鍵步驟在于提取條件的優(yōu)化和檢測(cè)條件的優(yōu)化。通過控制提取劑的組成、溫度和時(shí)間來提取最多的乳酸和乙酸，這一點(diǎn)對(duì)于考古樣品來說是十分重要的，畢竟考古樣品中的殘留物是十分微量的。有機(jī)酸的檢測(cè)過程中，流動(dòng)相的選取，流動(dòng)相的pH值會(huì)直接影響有機(jī)酸是否被檢測(cè)得到。

提取階段的實(shí)施例1

(1)稱取0.01g陶罐碎片，在室溫下風(fēng)干。用瑪瑙研缽將其研磨成粉末，加入到圓底燒瓶中；

(2)接著，將配置好的乙醇水(體積比15:85)溶液加入圓底燒瓶中，震蕩使浸透充分。加上冷凝管，85℃超聲水浴萃取，時(shí)間為90min；

(3)萃取結(jié)束后，冷卻至室溫，對(duì)萃取液進(jìn)行離心處理10～16min。取上清液，在4-6℃下保存；

(4)對(duì)提取液注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

提取階段的實(shí)施例2

(1)稱取0.01g陶罐碎片，在室溫下風(fēng)干。用瑪瑙研缽將其研磨成粉末，加入到圓底燒瓶中；

(2)接著，將配置好的乙醇水(體積比10:90)溶液加入圓底燒瓶中，震蕩使浸透充分。加上冷凝管，45℃超聲水浴萃取，時(shí)間為90min；

(3)萃取結(jié)束后，冷卻至室溫，對(duì)萃取液進(jìn)行離心處理離心10～16min。取上清液，在4-6℃下保存；

(4)對(duì)提取液采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。

采用提取階段的實(shí)施案例1和實(shí)施案例2得到不同提取條件下的多孔陶瓷材料中的酒液殘留物，通過超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)均得到如圖1、圖2、圖3所示結(jié)果，通過強(qiáng)烈的乳酸(m/z＝89)峰信號(hào)可以證明提取方法可靠有效。通過對(duì)不同提取條件的探索試驗(yàn)，綜合處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到圖6、圖7、圖8所示結(jié)果，反映出提取劑中乙醇比例、溫度、時(shí)間對(duì)乳酸提取量的影響，通過響應(yīng)面法二次模型的方差分析，可以看出溶劑組成對(duì)乳酸的提取量影響比較顯著，而溫度和提取時(shí)間對(duì)乳酸的提取影響不顯著，溶劑組成和時(shí)間相互影響乳酸的提取量也比較顯著。由此模型在design expert軟件中建議的提取乳酸的最佳條件是在30％的乙醇水比例，在45℃下提取90min。

檢測(cè)階段的實(shí)施案例1：

液相色譜檢測(cè)條件：流動(dòng)相為pH＝2.85的KH2PO4-磷酸緩沖液，流速為0.8mL/min，柱溫30℃；

檢測(cè)階段的實(shí)施案例2：

液相色譜檢測(cè)條件：流動(dòng)相為pH＝2.7的KH2PO4-磷酸緩沖液，流速為0.8mL/min，柱溫40℃；

檢測(cè)階段的實(shí)施案例3：

液相色譜檢測(cè)條件：流動(dòng)相為pH＝2.9的KH2PO4-磷酸緩沖液，流速為1mL/min，柱溫30℃；

圖9、圖10顯示，流速為0.8mL/min，30℃或者40℃下檢測(cè)均不能得到有效的液相色譜圖，有部分峰型過寬，個(gè)別峰與峰之間沒有得到有效的分離，拖尾嚴(yán)重，效果并顯著。后調(diào)整為pH＝2.9的KH2PO4-磷酸緩沖液，流速為1mL/min，柱溫21℃；便得到如圖11所示的有機(jī)酸分離圖，有機(jī)酸峰型尖銳，且有效分離，效果相對(duì)來說比較好。