技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫學(xué)中熒光免疫層析技術(shù)領(lǐng)域，包括蛋白交聯(lián)技術(shù)、膜層析技術(shù)、標記免疫分析技術(shù)等。具體地說是一種能夠快速準確的對血清、血漿和全血等樣品中25-羥基維生素d3進行定量分析的25-羥基維生素d3測定試劑盒及制作方法。

背景技術(shù)：
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vd系類固醇的衍生物是促進機體鈣磷吸收的主要元素，在自然界中以10多種形式存在，維生素的兩個最重要的形式是維生素d3和維生素d2，對動物最有營養(yǎng)意義。而vd在體內(nèi)僅是其活性代謝物的前體，只有轉(zhuǎn)化為25-羥基d3(25-oh-d3)和1,25-二羥基d3(1,25-(oh)2d3)后才有生物活性，才能有效地發(fā)揮其生理生化功能。25-oh-d3是維生素d在體內(nèi)的主要活性產(chǎn)物，是評價維生素d營養(yǎng)水平及診斷佝僂病可靠而敏感的指標。25-oh-d3的重要生理功能是調(diào)節(jié)機體ca,p的正常代謝，維持動物血鈣、血磷水平,保持骨骼的正常生長發(fā)育,防止鈣缺乏癥,如軟骨病、佝僂病等。在人體內(nèi)，維生素d3和d2與血漿中維生素d結(jié)合蛋白結(jié)合，并轉(zhuǎn)運到肝臟，兩者經(jīng)25羥基化成為25羥基維生素d，在血清中檢測出來的95％以上的25羥基維生素d為25羥基維生素d3，維生素d缺乏是繼發(fā)性甲狀旁腺機能亢進癥的常見病因。提高甲狀旁腺激素含量，特別是提高缺乏維生素d的老年人的甲狀旁腺激素含量會導(dǎo)致骨軟化癥，增加了骨轉(zhuǎn)化，降低了骨質(zhì)量，并有骨折的危險。25-羥基維生素d3含量低還與骨密度低有關(guān)。與其他臨床數(shù)據(jù)結(jié)合，其結(jié)果可作為輔助手段來判定骨代謝。

免疫分析技術(shù)是利用微量抗原與相應(yīng)的高特異性抗體之間的免疫反應(yīng)，來檢測如激素、藥物、蛋白質(zhì)、多肽、酶、腫瘤相關(guān)抗原、微生素、病毒、細菌及金屬元素等生物體內(nèi)活性物質(zhì)。免疫分析技術(shù)包括標記免疫分析、非標記免疫分析和儀器免疫分析。本試劑盒利用的含有稀土元素的羧基乳膠微球標記免疫分析技術(shù)是屬于標記免疫分析之一種。

熒光免疫分析(fia)和放射免疫分析(ria)自問世以來，經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展，但是人們越來越感覺到fia因自然本地太高，干擾檢測結(jié)果；ria采用同位素標記，對人體有極大危害并給實驗帶來不便。酶免疫分析(eia)也因酶本身不穩(wěn)定，受其他影響因素較大，推廣應(yīng)用受到限制。80年代初，人們開始研究用稀土元素代替熒光物質(zhì)和同位素標記蛋白質(zhì)或抗體，將時間分辨技術(shù)引入到生物檢測領(lǐng)域，建立了新型的超微量時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(timeresolvedfluoroimmunoassay，簡稱trfia)。該技術(shù)采用多學(xué)科先進技術(shù)，集結(jié)了其他免疫分析的特點，在免疫學(xué)、分子生物學(xué)、細胞學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，取得長足的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

trfia利用了具有獨特?zé)晒馓匦缘?價稀土離子及螯合物為示蹤物代替熒光物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細胞，待反應(yīng)體系(如抗原抗體反應(yīng)、核酸探針雜交、生物素親和素反應(yīng)以及靶細胞對效應(yīng)細胞的殺傷效應(yīng)等)發(fā)生后，用trfia檢測儀測定反應(yīng)產(chǎn)物中的熒光強度。根據(jù)產(chǎn)物熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達到定量分析。在通常的熒光測定中，由于測試樣品中含有多種熒光成分，背景熒光(來自樣品中的膠體顆粒和溶劑分子引起的散射光以及血清中蛋白質(zhì)和其他化合物發(fā)出的非特異性熒光)強度大、干擾強，成為熒光分析法大范圍推廣的瓶頸。trfia之所以能夠成為繼eia、ria之后一種新的靈敏的檢測方法，主要取決于鑭系元素獨特的熒光特點、檢測中采用的波長分辨和時間延遲技術(shù)以及解離-增強技術(shù)。

鑭系元素(lanthanide,ln)屬于稀土元素，共有17中，常用于trfia主要有銪(eu)、釤(sm)、鋱(tb)、鏑(dy)。鑭系元素具有獨特的熒光發(fā)光特點，與普通熒光相比，鑭系離子螯合物熒光衰變時間長，為傳統(tǒng)熒光的10³-10⁶倍。如鑭系離子螯合物的熒光衰變時間在60-900μs，常用的eu³⁺熒光衰變時間為714μs，普通熒光免疫分析中熒光團的熒光衰變時間只有1-100μs，樣品中一些蛋白質(zhì)的熒光衰變時間僅為1-10μs，因此利用時間分辨技術(shù)，延遲一定時間后測量，便可獲得eu³⁺特異性熒光信號。同時由于衰變時間長，eu³⁺標記物在測量時間里可以反復(fù)被激發(fā)，每次激發(fā)后由激發(fā)態(tài)很快躍遷到基態(tài)，就有熒光發(fā)出，然后又可被重新激發(fā)，如此每秒可有1000次激發(fā)，使得trfia熒光標記物的相對比活性很高。鑭系元素?zé)晒夤庾V的最大特征是激發(fā)光與發(fā)射光之間的stokes位移較大，eu³⁺激發(fā)波長為337nm，發(fā)射波長為615nm，stokes位移可達278nm；同時eu³⁺被激發(fā)的熒光光帶極窄，熒光的發(fā)射峰非常尖銳，可使儀器調(diào)整在極窄的波長范圍內(nèi)測定，這樣就幾乎完全消除了背景熒光的干擾，繼而通過時間延遲和波長分辨，將強特異性熒光和背景熒光辨開(故稱為時間分辨)，使干擾達到幾乎為零。

鑒于以上標記方法及檢測技術(shù)的應(yīng)用，本試劑盒具有良好的檢測特異性、較高的靈敏度、操作的簡便性以及穩(wěn)定的熒光標記物保證了檢測的準確性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，提出了一種利用熒光免疫層析的靈敏性，結(jié)合熒光免疫層析分析儀實現(xiàn)的靈敏度高、快捷簡便，可以準確定量的25-羥基維生素d3測定試劑盒及制作方法。

本發(fā)明可以通過以下措施達到：

一種25-羥基維生素d3測定試劑盒，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：pvc板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土熒光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為100-250nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素中的一種或幾種，在基態(tài)下穩(wěn)定，在300-400nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長范圍為550-650nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的25-羥基維生素d3抗原表位的單克隆抗體細胞株。

本發(fā)明所述結(jié)合墊的稀土熒光微球的直徑優(yōu)選是150-200nm；所述稀土熒光微球優(yōu)選含有一種或幾種稀土鑭系元素；結(jié)合墊上稀土熒光微球標記的抗體優(yōu)選來源于針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

本發(fā)明所述結(jié)合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于150mmtris-hcl處理液中(含1.0％tritonx-100，2.5％bsa，ph7.4)，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用，將玻璃纖維膜放在bio-dotxyz3050三維噴點平臺上，用bio-jetquanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體偶聯(lián)復(fù)合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時后制得。

本發(fā)明中結(jié)合墊上的所述稀土熒光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體采用如下步驟制得：

步驟1：單克隆抗體細胞株的獲得：用25-羥基維生素d3純品免疫小鼠，采用標準的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細胞株，對所獲得的單抗細胞株進行配對篩選，根據(jù)配對結(jié)果和親和力數(shù)據(jù)選出用于試劑盒的單抗細胞株；

步驟2：單克隆抗體的制備：采用標準的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化抗25-羥基維生素d3單克隆抗體，分裝后保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟3：稀土熒光微球的醛基化：取5mg稀土熒光微球，用20mm，ph9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟4：稀土熒光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體的制備：選取來自2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株的單克隆抗體，按照質(zhì)量比1:1將2mg25-羥基維生素d3單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應(yīng)過夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mm，4℃反應(yīng)4小時；再加入等體積的封閉液(50mmtris-hcl，ph7.4，含2％bsa，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然后用50mmtris-hcl，ph7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mmtris-hcl緩沖液中(含1.2％nacl，0.5％bsa，0.1％tween20)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明所述包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜通過以下步驟制得：

步驟1：采用與結(jié)合墊上所用抗25-羥基維生素d3單克隆抗體細胞株不同的細胞株，采用標準的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化抗25-羥基維生素d3單克隆抗體，保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

步驟2：分別用包被稀釋液將上述鼠源抗25-羥基維生素d3單克隆抗體和羊抗小鼠igg抗體調(diào)整濃度到1-3mg/ml，膜液量為0.5-2μl/cm，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質(zhì)控線間隔為3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

本發(fā)明所述樣品墊通過以下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0％tritonx-100，2.5％bsa，0.15mtris緩沖液，ph7.5的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

本發(fā)明還提供了一種如上所述試劑盒實現(xiàn)的25-羥基維生素d3制作方法，其特征在于包括以下步驟：

步驟1：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：讀卡：將ic卡放置在干式熒光免疫分析儀標注位置，讀取相關(guān)信息，所述熒光免疫層析分析儀是一種光學(xué)檢測系統(tǒng)，對25-羥基維生素d3的測定范圍為3.00-120ng/ml；步驟3：加樣：血清/血漿：取100μl血清/血漿樣本垂直滴加至測試卡加樣處；全血：取150μl全血樣本垂直滴加至測試卡加樣處；取樣時注意不要吸入氣泡。

步驟4：檢測，可采用自動測試或即時測試兩種模式進行檢測；自動測試：將測試卡插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，按測試鍵，儀器將自動對測試卡進行掃描分析檢測；即時測試：測試卡室溫放置15min后，插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，點擊即時測試。

本發(fā)明提供一種利用稀土羧基乳膠微球標記的熒光免疫層析技術(shù)制備的25-羥基維生素d3測定試劑盒，同時適合血清、血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測，相對于25-羥基維生素d3定性膠體金試劑，能定量檢測樣本中的25-羥基維生素d3含量，具有更明確的臨床指導(dǎo)意義，具有操作簡便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。

附圖說明：

附圖1是本發(fā)明中試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖2是本發(fā)明中實施例2的準確度分析結(jié)果示意圖。

附圖3是本發(fā)明中實施例2的準確度分析結(jié)果示意圖。

附圖4是本發(fā)明中實施例2的準確度分析結(jié)果示意圖。

附圖標記：pvc板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5。

具體實施方式：

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明：

如附圖1所示，本發(fā)明首先提出了一種25-羥基維生素d3測定試劑盒，盒內(nèi)設(shè)有試紙卡，所述試紙卡由下至上依次設(shè)有：pvc板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5，其中結(jié)合墊上吸附有稀土eu³⁺熒光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體-微球偶聯(lián)復(fù)合物，所述稀土熒光微球的直徑為150nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素eu³⁺，在基態(tài)下穩(wěn)定，在337nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長615nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的25-羥基維生素d3抗原表位的單克隆抗體細胞株。

所述結(jié)合墊3的稀土熒光微球的直徑優(yōu)選是150nm；所述稀土熒光微球優(yōu)選含有稀土鑭系元素銪(eu³⁺)；結(jié)合墊上稀土熒光微球標記的抗體優(yōu)選來源于針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

實施例1：

25-羥基維生素d3測定試劑盒中試紙卡的各組成部分可以通過以下措施制得：

1、樣品墊2的制備：

將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0％tritonx-100，2.5％bsa，0.15mtris緩沖液，ph7.5的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

2、吸附熒光微球標記抗體的結(jié)合墊3的制備：

將玻璃纖維膜浸泡于150mmtris-hcl處理液中(含1.0％tritonx-100，2.5％bsa，ph7.4)，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用，將玻璃纖維膜放在bio-dotxyz3050三維噴點平臺上，用bio-jetquanti300非接觸式微定量噴頭將稀土eu³⁺熒光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體偶聯(lián)復(fù)合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時后制得。

稀土熒光納米微球的醛基化：取5mg稀土熒光納米微球，用20mm，ph9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆茫?/p>

稀土eu³⁺熒光微球標記的抗25-羥基維生素d3單克隆抗體的制備：選取來自2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株的單克隆抗體，按照質(zhì)量比1:1將2mg抗25-羥基維生素d3單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應(yīng)過夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mm，4℃反應(yīng)4小時；再加入等體積的封閉液(50mmtris-hcl，ph7.4，含2％bsa，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然后用50mmtris-hcl，ph7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mmtris-hcl緩沖液中(含1.2％nacl，0.5％bsa，0.1％tween20)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

3、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜4的制備：

采用與結(jié)合墊上所用抗25-羥基維生素d3單克隆抗體細胞株不同的細胞株，采用標準的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化抗25-羥基維生素d3單克隆抗體，保存于-20℃?zhèn)溆茫?/p>

分別用包被稀釋液將上述鼠源抗25-羥基維生素d3單克隆抗體和羊抗小鼠igg抗體調(diào)整濃度到1.5mg/ml，膜液量為1.5μl/cm，將它們分別作為檢測線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質(zhì)控線間隔為4mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

試紙卡的組裝：在pvc板1上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊2、吸附有稀土熒光標記的抗體的結(jié)合墊3、包被有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜4和吸水墊5，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。

上述各步驟中選用的設(shè)備及原料優(yōu)選以下原料：

25-羥基維生素d3特異性配對抗體；25-羥基維生素d3質(zhì)控品：英國朗道實驗診斷有限公司；稀土熒光微球：上海甄準生物科技有限公司；硝酸纖維素(nc)膜：millipore公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(bsa)，聚乙二醇peg20000，水解酪蛋白：sigma產(chǎn)品，其它常用試劑均為分析純試劑。

實施例2：準確度試驗

選用上述試紙卡以及熒光免疫層析分析儀(型號：neo-007)，

熒光免疫分析儀參數(shù)的設(shè)定：在熒光免疫分析儀上設(shè)定好試紙卡工藝參數(shù)后，取上述組裝好的試紙卡，分別用4、10、20、40、60、80、100ng/ml的25-羥基維生素d3校準品，用試紙卡進行測定，得到各校準品的熒光強度值，將結(jié)果輸入到分析儀的參數(shù)中，完成分析儀的參數(shù)的設(shè)定。

主要檢測材料：臨床樣本由相關(guān)醫(yī)院獲得，共300份膠乳增強免疫比濁法定值樣本，其中血清樣本100份，血漿樣本100份，全血樣本100份，25-羥基維生素d3含量分布區(qū)間為3.00-120ng/ml之間。

檢測方法：

步驟1：將檢測試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；

步驟2：讀卡：檢查ic卡與試劑盒的批號是否一致。將ic卡放置在干式熒光免疫分析儀標注位置，讀取相關(guān)信息；

步驟3：加樣：血清/血漿：取100μl血清/血漿樣本垂直滴加至測試卡加樣處，全血：取150μl全血樣本垂直滴加至測試卡加樣處；取樣時注意不要吸入氣泡。

步驟4：檢測，可采用自動測試或即時測試兩種模式進行檢測，自動測試：將測試卡插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，按測試鍵，儀器將自動對測試卡進行掃描分析檢測；即時測試：測試卡室溫放置15min后，插入干式熒光免疫分析儀的承載器上，點擊即時測試。

試驗結(jié)果分析：

臨床樣本檢測試劑制備完成后，按檢測方法對所有臨床樣本進行檢測，并分析檢測結(jié)果。

試驗結(jié)果：

如附圖2至附圖4所示，以實驗系統(tǒng)的檢測值為y軸，以對照系統(tǒng)的測驗值為x軸，繪制散點圖，并進行相關(guān)性分析。臨床樣本檢測對300份臨床定值樣本檢測，樣本平均偏差值小于10％，最大偏差小于20％，r2>0.98，一致性系數(shù)>0.90。檢測結(jié)果表明制備的檢測試劑盒性能良好，適合用于臨床檢測，滿足不同客戶不同檢測場合的差異化需要。

本發(fā)明提供一種利用稀土熒光免疫層析技術(shù)制備的25-羥基維生素d3快速定量免疫層析檢測試劑盒，同時適合血清/血漿和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測，相對于25-羥基維生素d3定性膠體金試劑，能定量檢測樣本中的25-羥基維生素d3含量，具有更明確的臨床指導(dǎo)意義，具有操作簡便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強、適合現(xiàn)場檢測和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。