專利名稱：25羥基維生素d檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及檢測試劑盒，特別是涉及25羥基維生素D檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
人體和動物每天必需從食物中攝取適量的維生素D，才能維持正常的發(fā)育和健康。成人的建議每日攝取量是5 y g，妊娠期和哺乳期女性應(yīng)當(dāng)增加I倍左右的攝入量，每天手腳露30厘米，在陽光下曬30分鐘，有效的防止維生素D的缺乏。但維生素D攝食過量會弓I起中毒，ー些學(xué)者認(rèn)為長期每日攝入25 u g維生素D可引起中毒，這其中可能包括一些對維生素D敏感的人，但長期每天攝入125 u g維生素D則肯定引起中毒。我國制定維生素D可
耐受:最聞攝入量為20 u go25 (OH) VD是最主要的血清VD的存在形式，其血清濃度反應(yīng)了機(jī)體中可利用的VD的狀態(tài)，其結(jié)果的可靠性要優(yōu)于檢測血清1，25 (OH)VD水平。血清25 (OH)VD濃度隨年齡而降低。老年人日照相對減少，老化皮膚產(chǎn)生VD數(shù)量下降，及不充分的飲食攝入，造成老年人普遍缺乏VD，增加了患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險。因此，檢測25 (OH)VD血清濃度可以輔助臨床對VD缺乏狀態(tài)的評估，也可用于檢測患者非正常血清鈣水平的原因。目前25羥基維生素D檢測試劑盒主要是以進(jìn)ロ產(chǎn)品為主，穩(wěn)定性較好的產(chǎn)品主要是酶聯(lián)免疫法和放射性免疫法類產(chǎn)品。放射性免疫法檢測25羥基維生素D試劑盒存在需操作經(jīng)驗豐富的檢驗員，存在放射性污染的問題，使用范圍受到限制。目前通常使用的利用酶聯(lián)免疫法檢測25羥基維生素D的試劑盒的血清樣本需要稀釋才可加樣，操作時間比較長，操作方法步驟比較繁瑣。

實用新型內(nèi)容基于此，有必要提供ー種敏感度高、特異性強、操作簡便、穩(wěn)定性好，無污染、重復(fù)性好的25羥基維生素D檢測試劑盒。ー種25羥基維生素D檢測試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)主要有具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶、以及置于塑料框架中的微孔板，所述微孔板的微孔內(nèi)包被有高特異性鼠25羥基維生素D單克隆抗體層，所述高特異性鼠25羥基維生素D單克隆抗體的量為0. I 0. 5 ii g ;所述試劑瓶包括裝有濃度為0. I u g/ml的生物素標(biāo)記的25輕基維生素D的試劑瓶和裝有工作濃度為0. 5 2. 0 ii g/ml的辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素蛋白的試劑瓶。在其中一個實施例中，所述試劑瓶還包括有6瓶分別裝有25羥基維生素D標(biāo)準(zhǔn)品的試劑瓶，2瓶分別裝有25羥基維生素D質(zhì)控品的試劑瓶，I瓶裝有底物溶液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶和I瓶裝有沖洗液的試劑瓶。在其中一個實施例中，所述試劑盒還包括有檢測時用于密封微孔板的封ロ膜。本實用新型的25羥基維生素D檢測試劑盒是采用競爭法原理定量測定人血清或血漿中的25羥基維生素D和其他羥基化代謝產(chǎn)物。將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣本加入至預(yù)包被高特異性鼠25 (OH)D單克隆抗體的微孔板的微孔中，再加入生物素標(biāo)記的25 (OH)D抗原室溫下孵育30分鐘，之后沖洗。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白，選擇地與生物素結(jié)合，接著沖洗，再利用底物顯色。終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)儀下45011111處讀取吸光度，25(011)0濃度與顏色強度成反比。上述25羥基纖維素D檢測試劑盒與目前通常使用的同類檢測試劑盒相比，可提高工作效率，并大幅節(jié)約成本。本發(fā)明采用單克隆抗體包被板條，靈敏度約為5nmol/L，線性范圍大于同類試劑盒，精密度和準(zhǔn)確度均在試劑盒要求范圍內(nèi)，并且血清樣本不需要稀釋即可直接加樣，操作方法比同類試劑盒簡單，一般技術(shù)人員即可操作，操作時間比同類試劑盒減少一半。且無污染，可以作為同類放射性免疫分析試劑盒的替代產(chǎn)品。

圖I是本實用新型實施例I所述盒體與下凹瓶位的的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是本實用新型實施例I所述微孔板的結(jié)構(gòu)示意圖；附圖標(biāo)記1、盒體；2、下凹瓶位；3、框架；4、微孔板；5、微孔。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖和具體實施例來詳細(xì)說明本實用新型。實施例I請參考圖1-3，所述25羥基維生素D檢測試劑盒的盒體I內(nèi)具有固定泡沫模具形成的下凹瓶位2 (共有14個下凹瓶位)，下凹瓶位2用于放置裝有溶液的試劑瓶；位于塑料框架3中的微孔板4，微孔板4中的微孔5內(nèi)包被有包被量為0. g的高特異性鼠25羥基維生素D單克隆抗體層。試劑瓶包括裝有濃度為0. I u g/ml的生物素標(biāo)記的25羥基維生素D的試劑瓶和裝有工作濃度為I. Oii g/ml的辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素蛋白的試劑瓶。本實施例所述的25羥基維生素D檢測試劑盒的主要組成成份如下I、包被有高特異性鼠25羥基維生素D單克隆抗體的微孔板所述微孔板的每個微孔內(nèi)高特異性鼠25羥基維生素D單克隆抗體的包被量為0. 2 u g ;條形微孔板(12條X8孔)，置于框架中。2、25羥基維生素D標(biāo)準(zhǔn)品0. I. 2. 3. 4. 5可直接使用，共6瓶，每瓶300ul，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的線性濃度分別為A 0 ；B :6. 5 ；C 26 ；D 60 ；E 180 ；F :360ng/ml，分別對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品 0. I. 2. 3. 4. 5。3、25羥基維生素D質(zhì)控品I. 2可直接使用，共2瓶，每瓶300ul，濃度分別為30ng/ml和100ng/ml。4、生物素標(biāo)記的25羥基維生素D可直接使用，濃度為0. Iii g/ml，I瓶，每瓶3ml。5、酶結(jié)合物可直接使用的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白(溶于含去污劑、防腐劑和BSA緩沖溶液中)，工作濃度為I. Oii g/ml，I瓶，6. OmL。6、底物溶液[0029]可直接使用的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(溶于酸性溶液中)，I瓶，12. OmL。7、終止液可直接使用的鹽酸溶液(HCl、100ml/L ;エ藝用水、900ml/L)。I瓶，12. OmL。8、濃縮洗液(20 X)含有去污劑和防腐劑的濃縮清洗緩沖液。I瓶，50. OmL。9、封 ロ 膜孵育時密封微孔板的粘性薄膜。所述試劑盒的制備如下(一)標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品(I)標(biāo)準(zhǔn)品的配制是由濃度為lmg/ml的25輕基VD母液及人工血清、proclin300配制而成。配制1000人份標(biāo)準(zhǔn)品，具體配制過程如下(從高濃度配起):F :取 25 羥基 VD lmg/ml 的母液 252 U 1+699. 048ml 人工血清 +0. 7mlproclin300 ；分裝；E :取配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液F150ml+149. 7ml人工血清+0. 3ml proclin300 ;分裝；D :取配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液F50ml+249. 7ml人工血清+0. 3ml proclin300 ;分裝；C :取配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液F21. 65ml+278. 05m人工血清+0. 3mlproclin300 ;分裝;B :取配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液F5. 4ml+294. 3ml人工血清+0. 3ml proclin300 ;分裝；A :加入300ml人工血清，分裝。(2)質(zhì)控品的配制質(zhì)控品I (100ng/ml) :25 羥基 VD 標(biāo)準(zhǔn)品 F (360ng/ml) 83. 35ml+216. 35ml 人工血清+0.3ml proclin300,分裝;質(zhì)控品2 (30ng/ml) :25 羥基 VD 標(biāo)準(zhǔn)品 F (360ng/ml) 25ml+274. 7ml 人工血清+0.3ml proclin300,分裝。( ニ)包被高特異性鼠25 (OH) D單克隆抗體的微孔板外購高特異性鼠25 (OH) D單克隆抗體。按100 u L/孔將包被液(包被液抗體2. 5mg+包被緩沖液IOOOml ;包被緩沖液為Na2CO3O. 423g/L, NaHCO3L 344g/L)加入酶標(biāo)板的微孔內(nèi)，4°C過夜(> 17h);采用稀釋后的25 (OH) VD 濃縮洗液(X20 =Na2HPO4 12H20116g/L、NaH2PO4 2H2011. 84g/L、NaCl 180g/L、Tween-2010ml/L、proclin3001ml/L)進(jìn)行洗滌，200 y L/孔，洗兩次；按 200 yl/孔往微孔中加入封閉液(Na2HPO4 12H20 5. 8g/L、NaH2PO4 2H20 0. 592g/L、NaCl 9. Og/L、蔗糖 50g/L、乳糖 50g/L、BSA 10g/L、proclin3001ml/L,過濾)，室溫放置(18 26°C )，4°C過夜進(jìn)行封閉；在干燥房(18-26°C )抽干后，真空密封(2-8°C )，得到包被高特異性鼠25(0H)D單克隆抗體的微孔板，干燥保存。(三)酶結(jié)合物配方如下=Na2HPO4 12H20、2. 9g/L ;KH2P04、0. 4g/L ;NaCL、8g/L ;KCL、0. 4g/L ;BSA、10g/L ;proclin300、lml/L ;辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白(外購原料)、lg/L ;過濾。[0055](四)其他生物素標(biāo)記的25羥基維生素D、底物溶液、終止液、濃縮洗液(20X)、封ロ膜均由其他商業(yè)公司提供。實施例2運用實施例I的試劑盒對樣本中的25羥基維生素D進(jìn)行檢測被測樣本的要求采用血清或血漿(EDTA、枸櫞酸鈉或肝素)樣本。樣本采集后應(yīng)盡快分離，樣本在15-25°C放置不超過4小時；2-8°C放置時不超過12小時；-20°C或以下放置時可保存2個月，_80°C下可長期保存，應(yīng)避免樣品的反復(fù)凍融，最多只能凍融一次。溶血樣本、微生物污染樣本不能用于測定。 實施例I的試劑盒的操作步驟如下I)按照所需測定的樣本數(shù)量及布局在板條上放好微孔板條。2)加入生物素標(biāo)記的25羥基維生素D 25 ill。3)加入25羥基維生素D標(biāo)準(zhǔn)品、25羥基維生素D質(zhì)控品和樣本各25 U I至待測孔中。4)用封ロ膜將微孔板板孔封好，置于室溫下30分鐘。5)用稀釋好的濃縮洗液洗板五次。a.自動洗板設(shè)置洗板機(jī)分配每孔至少300 ill沖洗液。重復(fù)洗5次。b.手動洗板迅速顛倒倒出孔內(nèi)物。每孔加入250 U I沖洗液。重復(fù)洗板5次。在進(jìn)入下ー步之前，于吸水紙上用カ拍打倒置的板以去除多余的洗液。6)每孔加入酶結(jié)合物50 U 1，置于室溫30分鐘。7)重復(fù)步驟5。8)每孔加入TMB底物溶液100 U I，封上封ロ膜，避光溫育15分鐘。注TMB底物溶液易受到污染。移取所需要的量，用后的液體請勿再倒回瓶內(nèi)。9)每孔加入終止液100 ill。10)加入終止液30分鐘內(nèi)在450nm波長(參考波長是650nm)處讀取吸光度。表1-3為運用實施例I的試劑盒隨即抽取大人和小孩血清樣本中的25羥基維生素D的檢測結(jié)果。大人和小孩的正常值為50-150nmol/L。表I
權(quán)利要求1.一種25羥基維生素D檢測試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)主要有具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶、以及置于塑料框架中的微孔板，其特征在于，所述微孔板的微孔內(nèi)包被有高特異性鼠25羥基維生素D單克隆抗體層，所述高特異性鼠25羥基維生素D單克隆抗體的量為O. I O. 5 μ g ;所述試劑瓶包括裝有濃度為O. I μ g/ml的生物素標(biāo)記的25羥基維生素D的試劑瓶和裝有工作濃度為O. 5 2. O μ g/ml的辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素蛋白的試劑瓶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的25羥基維生素D檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑瓶還包括有6瓶分別裝有25羥基維生素D標(biāo)準(zhǔn)品的試劑瓶，2瓶分別裝有25羥基維生素D質(zhì)控品的試劑瓶，I瓶裝有底物溶液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶和I瓶裝有沖洗液的試劑瓶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的25羥基維生素D檢測試劑盒，其特征在于，還包括有檢測時用于密封微孔板的封口膜。
專利摘要本實用新型公開了一種25羥基維生素D檢測試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)主要有具有放置試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶、以及置于塑料框架中的微孔板，所述微孔板的微孔內(nèi)包被有高特異性鼠25羥基維生素D單克隆抗體層，所述高特異性鼠25羥基維生素D單克隆抗體的量為0.1～0.5μg；所述試劑瓶包括裝有濃度為0.1μg/ml的生物素標(biāo)記的25羥基維生素D的試劑瓶和裝有工作濃度為0.5～2.0μg/ml的辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素蛋白的試劑瓶本實用新型25羥基纖維素D檢測試劑盒靈敏度約為5nmol/L，線性范圍大于同類試劑盒，精密度和準(zhǔn)確度均在試劑盒要求范圍內(nèi)，操作方法比同類試劑盒簡單，操作時間短。
文檔編號G01N33/82GK202522564SQ20122013407
公開日2012年11月7日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者郭志程 申請人:廣州菲康生物技術(shù)有限公司