本發(fā)明涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的熒光檢測(cè)方法及系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

在分子生學(xué)領(lǐng)域，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱PCR)是常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，是體外酶促進(jìn)合成特異DNA片段的一種方法，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR基本由變形、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，而且越來越廣泛地應(yīng)用于臨床疾病的診斷。實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的儀器稱為實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，其本質(zhì)上就是一個(gè)溫控設(shè)備，能對(duì)變性溫度、復(fù)性溫度、延伸溫度進(jìn)行準(zhǔn)確控制?；驹硎牵汗庠礋舭l(fā)出激發(fā)光，通過光學(xué)組件到達(dá)具有樣本的反應(yīng)管，樣本被激發(fā)后發(fā)出熒光。被激發(fā)出的熒光再經(jīng)過光學(xué)組件到達(dá)檢測(cè)器。濾光鏡是光學(xué)組件的一個(gè)部件，可以使特定波長(zhǎng)的光通過，從而達(dá)到區(qū)分產(chǎn)物的目的。通過濾光鏡的熒光經(jīng)過光學(xué)組件后被檢測(cè)器捕獲，捕獲后的熒光通過一系列光電轉(zhuǎn)換后，輸入計(jì)算機(jī)進(jìn)行計(jì)算分析。熒光PCR常見的檢測(cè)器有攝像頭、PMT(光電倍增管)、光電二極管等。

傳統(tǒng)的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，通過光源發(fā)出激發(fā)光，激發(fā)光經(jīng)過入射光濾光鏡后進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)后的熒光再通過檢測(cè)光濾光鏡后到達(dá)檢測(cè)器(如光電二極管、攝像頭)。但無論采用光電二極管還是攝像頭做為檢測(cè)器，都是使用濾光鏡來得到所需的波長(zhǎng)的熒光。多通道熒光檢測(cè)需要多種濾光鏡，不同波長(zhǎng)的熒光選擇或者通過濾光輪轉(zhuǎn)動(dòng)濾光鏡；或者各種濾光鏡安裝在一個(gè)光頭上，通過光頭來回運(yùn)動(dòng)，逐孔掃描。這兩種濾光方式，都需要機(jī)械運(yùn)動(dòng)裝置，否則無法得到所需要的熒光。而機(jī)械移動(dòng)結(jié)構(gòu)(裝置)的引入，使得儀器變得復(fù)雜、龐大、成本也居高不下；更重要的是運(yùn)動(dòng)使得整個(gè)儀器處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的檢測(cè)系統(tǒng)中，極易引發(fā)設(shè)備故障，為后續(xù)維修帶來巨大的成本和負(fù)擔(dān)。另外，常見PCR儀的光學(xué)系統(tǒng)一般位于儀器頂部。激發(fā)光源經(jīng)過入射濾光鏡后投射到樣品池中的被測(cè)樣品，被測(cè)樣品被激發(fā)的熒光再通過檢測(cè)光濾光鏡濾色后直接投射到光敏接收管或是CCD等光電檢測(cè)器上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品定量檢測(cè)的目標(biāo)。激發(fā)光從樣品基座頂部照射到樣品管激發(fā)熒光并實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，這種方法對(duì)樣品反應(yīng)管及試劑板的帽子質(zhì)量要求特別高，必須具有高透光度，并且特別容易發(fā)生光路混亂。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)解決的主要問題是提供一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的熒光檢測(cè)方法及系統(tǒng)，以解決光路混亂、散射、光強(qiáng)衰竭的技術(shù)問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的熒光檢測(cè)方法，其特征在于，包括：LED光源發(fā)出光；所述光入射濾光鏡濾光后形成藍(lán)色的激發(fā)光；所述激發(fā)光進(jìn)入入射光纖；入射光纖發(fā)出的光線直接投射到樣品池中的被測(cè)樣品；被測(cè)樣品被激發(fā)的熒光再通過發(fā)射光纖，經(jīng)過棱鏡分光后，按波長(zhǎng)的大小依次投射在攝像頭上。

本發(fā)明達(dá)到了如下效果：

采用發(fā)光二極管作為光源，光源發(fā)出的光經(jīng)過510nm藍(lán)色入射濾光鏡濾光后形成激發(fā)光，經(jīng)入射光纖傳導(dǎo)后投射到樣品池中的被測(cè)樣品，樣品被激發(fā)，發(fā)出熒光。熒光再通過發(fā)射光纖傳導(dǎo)至棱鏡，由于棱鏡對(duì)不同波長(zhǎng)的光有不同的折射率，經(jīng)過棱鏡的折射后，按照波長(zhǎng)的大小分成的光譜成像在攝像頭上。計(jì)算機(jī)根據(jù)光譜計(jì)算出需要的光的強(qiáng)度。通過棱鏡分光和光纖導(dǎo)光，可實(shí)現(xiàn)一次全部通道熒光采集的實(shí)現(xiàn)而無需切換濾光片，節(jié)省了多通道檢測(cè)時(shí)濾光鏡之間的切換。通過光纖系統(tǒng)避免了不同樣品孔之間的機(jī)械移動(dòng)和CCD采集模式的邊緣效應(yīng)。從而，可以實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、高效率的檢測(cè)。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的熒光檢測(cè)方法的流程圖。

圖2是本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的熒光檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖

具體實(shí)施方式

如在說明書及權(quán)利要求當(dāng)中使用了某些詞匯來指稱特定組件。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)可理解，硬件制造商可能會(huì)用不同名詞來稱呼同一個(gè)組件。本說明書及權(quán)利要求并不以名稱的差異來作為區(qū)分組件的方式，而是以組件在功能上的差異來作為區(qū)分的準(zhǔn)則。如在通篇說明書及權(quán)利要求當(dāng)中所提及的“包含”為一開放式用語(yǔ)，故應(yīng)解釋成“包含但不限定于”?！按笾隆笔侵冈诳山邮盏恼`差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問題，基本達(dá)到所述技術(shù)效果。此外，“耦接”一詞在此包含任何直接及間接的電性耦接手段。因此，若文中描述一第一裝置耦接于一第二裝置，則代表所述第一裝置可直接電性耦接于所述第二裝置，或通過其他裝置或耦接手段間接地電性耦接至所述第二裝置。說明書后續(xù)描述為實(shí)施本申請(qǐng)的較佳實(shí)施方式，然所述描述乃以說明本申請(qǐng)的一般原則為目的，并非用以限定本申請(qǐng)的范圍。本申請(qǐng)的保護(hù)范圍當(dāng)視所附權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。

以下結(jié)合附圖對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不作為對(duì)本申請(qǐng)的限定。下文為了敘述方便，下文中所稱的“左”“右”“上”“下”等與附圖本身左、右、上、下等方向一致，“前端”、“后端”或“末端”等相對(duì)于附圖為前或后。下文中的“第一”、“第二”等為描述上加以區(qū)分，并沒有其他特殊含義。

實(shí)施例一：

請(qǐng)參考圖1，本發(fā)明的一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的熒光檢測(cè)方法，包括：LED光源1發(fā)出光；所述光入射濾光鏡2濾光后形成激發(fā)光；所述激發(fā)光進(jìn)入入射光纖；入射光纖發(fā)出的光線直接投射到樣品池中的被測(cè)樣品3；被測(cè)樣品被激發(fā)的熒光再通過發(fā)射光纖，經(jīng)過棱鏡4分光后，熒光通道按波長(zhǎng)的大小依次投射在攝像頭5上，形成光譜成像。

優(yōu)選的，所述熒光的波長(zhǎng)為510-750nm。具體的，理論上可實(shí)現(xiàn)120熒光通道的檢測(cè)，極大的突破和改善現(xiàn)有熒光定量PCR儀最多4-5條熒光通路的限制。通過棱鏡分光，可實(shí)現(xiàn)一次性全部通路熒光采集的實(shí)現(xiàn)而無需切換濾光鏡，節(jié)省了多通道檢測(cè)時(shí)濾光鏡切換的時(shí)間。

優(yōu)選的，所述熒光通道的數(shù)目為120。

優(yōu)選的，還包括：計(jì)算機(jī)將所述光譜成像進(jìn)行計(jì)算，以得到光強(qiáng)度值的步驟。

優(yōu)選的，所述濾光鏡2為500nm藍(lán)光濾光鏡。

優(yōu)選的，包括：LED光源1，用于發(fā)出光；濾光鏡2，用于接收所述光入射濾光后形成激發(fā)光；入射光纖，用于接收所述激發(fā)光；被測(cè)樣品3，用于直接接收入射光纖投射的光線；發(fā)射光纖，用于接收被測(cè)樣品被激發(fā)的熒光，經(jīng)過棱鏡4分光后，熒光通道按波長(zhǎng)的大小依次投射在攝像頭5上，形成光譜成像。

優(yōu)選的，所述熒光的波長(zhǎng)為510-750nm。

優(yōu)選的，所述熒光通道的數(shù)目為120。

優(yōu)選的，還包括：計(jì)算機(jī)，用于將所述光譜成像進(jìn)行計(jì)算，以得到光強(qiáng)度值的步驟。

優(yōu)選的，所述濾光鏡2為500nm藍(lán)光濾光鏡。

由于方法部分已經(jīng)對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，這里對(duì)實(shí)施例中涉及的系統(tǒng)與方法對(duì)應(yīng)部分的展開描述省略，不再贅述。對(duì)于系統(tǒng)中具體內(nèi)容的描述可參考方法實(shí)施例的內(nèi)容，這里不再具體限定。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述的一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的熒光檢測(cè)方法，達(dá)到了如下效果：

采用發(fā)光二極管作為光源，光源發(fā)出的光經(jīng)過510nm藍(lán)色入射濾光鏡濾光后形成激發(fā)光，經(jīng)入射光纖傳導(dǎo)后投射到樣品池中的被測(cè)樣品，樣品被激發(fā)，發(fā)出熒光。熒光再通過發(fā)射光纖傳導(dǎo)至棱鏡，由于棱鏡對(duì)不同波長(zhǎng)的光有不同的折射率，經(jīng)過棱鏡的折射后，按照波長(zhǎng)的大小分成的光譜成像在攝像頭上。計(jì)算機(jī)根據(jù)光譜計(jì)算出需要的光的強(qiáng)度。通過棱鏡分光和光纖導(dǎo)光，可實(shí)現(xiàn)一次全部通道熒光采集的實(shí)現(xiàn)而無需切換濾光片，節(jié)省了多通道檢測(cè)時(shí)濾光鏡之間的切換。通過光纖系統(tǒng)避免了不同樣品孔之間的機(jī)械移動(dòng)和CCD采集模式的邊緣效應(yīng)。從而，可以實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、高效率的檢測(cè)。

上述說明示出并描述了本申請(qǐng)的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解本申請(qǐng)并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述申請(qǐng)構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本申請(qǐng)的精神和范圍，則都應(yīng)在本申請(qǐng)所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。